養(yǎng)陰活胃合劑對(duì)慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜淋巴細(xì)胞瘤-2基因和三葉因子1表達(dá)的影響

陳彥竹 何小艷 曾斌芳

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)為胃癌前變化的最初階段，國(guó)內(nèi)臨床報(bào)道中藥可以阻斷或逆轉(zhuǎn)胃癌的癌前病變［1］。CAG病因復(fù)雜，具有病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。經(jīng)過多年臨床驗(yàn)證總結(jié)出養(yǎng)陰活胃合劑方，可改善CAG患者臨床癥狀，能夠改善局部病理以及逆轉(zhuǎn)胃黏膜的病理狀態(tài)，使病變胃黏膜趨于正常，對(duì)治療慢性萎縮性胃炎有良好效果［2］，為了探討該方對(duì)CAG的作用機(jī)制，本研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用該方對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行了研究，觀察其對(duì)CAG大鼠胃黏膜細(xì)胞相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和三葉因子 1(trefoil factor 1，TFF1)基因表達(dá)的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠96只，體質(zhì)量150～200 g，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào):SCXK(新)2003-0001］。

1．2 藥物及給藥方法

中藥養(yǎng)陰活胃合劑組成:阿魏、蘆根、白術(shù)、茯苓、雞內(nèi)金、莪術(shù)各15 g、海螵蛸30 g、旋覆花10 g、炙遠(yuǎn)志、砂仁、炙甘草各6 g。由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供水煎劑。模型復(fù)制成功后除空白對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)、自由進(jìn)食水外，模型組繼續(xù)施加上述造模因素，養(yǎng)陰活胃合劑高、中、低劑量組分別喂飼水煎劑2．22 g/(kg·d)、1．48 g/(kg·d)和 0．74 g/(kg·d)，陽(yáng)性藥物對(duì)照組予維酶素0．86 g/(kg·d)灌胃，共12周。

1．3 主要試劑與儀器

(今寧)維酶素片(湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):120901);無水乙醇(天津市靜?？h大邱莊工業(yè)園區(qū)生產(chǎn)，批號(hào):20131106);水楊酸鈉(天津市化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)，批號(hào):20070916);兔抗Bcl-2多抗IgG，免疫組化試劑盒為英國(guó)abcam公司產(chǎn)品;兔抗TFF1多抗IgG，免疫組化試劑盒為美國(guó)GeneTex公司產(chǎn)品。

TD5AWS臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)儀器廠)。

1．4 模型制備

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性藥物對(duì)照組，中藥高、中、低劑量組，每組16只。大鼠顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)、自由進(jìn)食水，其余5組將2 g水楊酸鈉加入100 mL的30%乙醇溶液中，給大鼠灌胃3 mL/d，灌胃前1小時(shí)禁食、禁水;再配合隔日進(jìn)食不禁水法，直到12周造模結(jié)束。每組處死2只大鼠，觀察胃黏膜腸上皮化生和萎縮情況，以證實(shí)CAG造模成功。

1．5 取材及標(biāo)本處理

末次給藥后禁食不禁水24小時(shí)，5%戊巴比妥麻醉大鼠，剖取全胃，沿胃大彎側(cè)剖胃腔，作大體觀察，以4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)取材，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下組織形態(tài)觀察。

1．6 Bcl-2與TFF1免疫組化染色方法

采用通用型二步法免疫組化法檢測(cè)。石蠟切片脫蠟至水洗;3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS液沖洗3次，蒸餾水洗3次;枸櫞酸鈉緩沖液修復(fù)抗原，PBS沖洗3次，蒸餾水洗3次;加入山羊血清封閉非特異性抗原;一抗按照適當(dāng)比例稀釋滴入(以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)，4℃冰箱孵育過夜，次日37℃下復(fù)溫30分鐘，PBS沖洗3次;滴加通用型二抗，37℃溫箱孵育25分鐘，PBS洗滌3次;DAB顯色3～5分鐘，蘇木素復(fù)染10秒，蒸餾水沖洗返藍(lán);各級(jí)乙醇脫水;二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。各指標(biāo)結(jié)果用標(biāo)記指數(shù)(u)表示:LI:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。在高倍鏡下選取5個(gè)有代表性的視野，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用LSD法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 大鼠胃組織肉眼觀察比較

空白對(duì)照組大鼠胃黏膜柔軟，表面較多黏液，皺襞面光滑，胃壁彈性良好，呈橘紅色。模型組大鼠胃黏膜薄弱粗糙，灰白色澤，表面黏液減少，可見細(xì)小顆粒和結(jié)節(jié)，亦可見黏膜糜爛出血，皺襞變細(xì)，胃壁彈性減低，養(yǎng)陰活胃合劑組及陽(yáng)性藥維酶素組部分胃黏膜基本恢復(fù)正常，以養(yǎng)陰活胃合劑組為明顯。

2．2 胃組織形態(tài)觀察比較

空白對(duì)照組大鼠胃黏膜厚度正常，黏膜上皮層呈單層柱狀，上皮細(xì)胞及腺體排列整齊，大小形狀較為一致，固有層可見少許嗜酸性粒細(xì)胞散在，無增生和化生現(xiàn)象，肌層未見明顯變化。模型組胃黏膜固有層腺體均有不同程度減少，胃黏膜固有層變薄，黏膜下層充血、水腫，黏膜固有層下部局灶性淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，可見黏膜肌層增厚，胃幽門部位腺體結(jié)構(gòu)不完整，腸上皮化生。陽(yáng)性藥物對(duì)照組胃黏膜較薄，固有層腺體有輕度減少，淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)。中藥高劑量組胃黏膜基本正常，腺體排列較規(guī)整，可見散在淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，未見腸上皮化生。見圖1。說明養(yǎng)陰活胃合劑與陽(yáng)性藥物對(duì)照組均能改善胃黏膜的病理形態(tài)，但以養(yǎng)陰活胃合劑效果為佳。

2．3 各組大鼠胃黏膜Bcl-2免疫組化染色統(tǒng)計(jì)的比較

Bcl-2蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞漿內(nèi)?？瞻讓?duì)照組大鼠胃黏膜有極少量陽(yáng)性細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)染色，細(xì)胞核有少量表達(dá);陽(yáng)性藥物對(duì)照組和中藥高、中劑量組大鼠胃黏膜部分細(xì)胞可見黃色、褐色程度不同的染色，與模型組比較染色較淺;模型組染色最重。見圖2。

圖1 大鼠胃黏膜組織HE染色病理切片(HE×200)

圖2 各組大鼠胃黏膜中Bcl-2蛋白的表達(dá)情況(×200)

采用陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法，統(tǒng)計(jì)結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，各組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高(P＜0．05);與模型組比較，中藥高、中劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯降低(P＜0．05);與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，中藥高劑量組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);中藥高、中、低劑量組間比較，中藥低劑量組Bcl-2明顯高于中藥高、中劑量組(P＜0．05)。見表1。

2．4 各組大鼠胃黏膜TFF1免疫組化染色統(tǒng)計(jì)的比較

TFF1主要表達(dá)于胃黏膜腺體細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞膜及細(xì)胞核中有少量表達(dá)?？瞻讓?duì)照組大鼠胃黏膜腺體細(xì)胞胞漿有大量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，核周聚焦明顯，呈棕黃色，染色最深見于接近腔面的細(xì)胞;陽(yáng)性藥物對(duì)照組和中藥組大鼠胃黏膜部分細(xì)胞可見黃色程度不等的染色，與模型組比較染色較重;模型組染色最輕。見圖3。

表1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1陽(yáng)性表達(dá)率的比較±s，表達(dá)率/%)

表1 各組大鼠胃黏膜Bcl-2和TFF1陽(yáng)性表達(dá)率的比較±s，表達(dá)率/%)

注:與模型組比較，a P＜0．05;與空白對(duì)照組比較，b P＜0．05;與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，c P＜0．05;與中藥低劑量組比較，d P＜0．05。

14 18．08 ±1．62 95．66 ±1．7陽(yáng)性藥物對(duì)照組 13 37．45 ±2．69ab 89．40 ±2．45ab模型組 11 43．41 ±3．14b 84．00 ±2．79b中藥高劑量組 12 32．25 ±2．59abcd 93．33 ±4．18acd中藥中劑量組 12 34．90 ±3．28abd 90．90 ±5．76abd中藥低劑量組 13 40．54 ±7．03b 86．68 ±5．01陽(yáng)性空白對(duì)照組組別 n Bcl-2陽(yáng)性 TFF1 b

圖3 各組大鼠胃黏膜中TFF1蛋白的表達(dá)情況(×200)

采用陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法，統(tǒng)計(jì)結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，除中藥高劑量組接近于空白對(duì)照組外(P＞0．05)，其余各組TFF1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯降低(P＜0．05);與模型組比較，中藥高、中劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組TFF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，中藥高劑量組TFF1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高(P＜0．05);中藥高、中、低劑量組間比較，中藥低劑量組TFF1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于中藥高、中劑量組(P ＜0．05)。見表1。

3 討論

CAG多由慢性淺表性胃炎演變而成，是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要原因。其病情遷延反復(fù)難愈，兼于長(zhǎng)期的病理?yè)p傷本身、內(nèi)傷外邪等諸多因素而導(dǎo)致血絡(luò)瘀阻。本實(shí)驗(yàn)中養(yǎng)陰活胃合劑能夠改善大鼠腺體萎縮情況，使病變胃黏膜趨于正常，對(duì)CAG大鼠有良好治療作用。方中蘆根養(yǎng)陰和胃降逆，配伍白術(shù)、茯苓健脾助運(yùn)，加之阿魏消積散痞，莪術(shù)可活血行氣止痛，旋復(fù)花、炙遠(yuǎn)志兼顧疏肝理氣、化痰通絡(luò)，合雞內(nèi)金、砂仁消食和胃，諸藥配合，標(biāo)本兼顧，共奏養(yǎng)陰活血，化痰和胃之功。

臨床資料證實(shí)胃癌前狀態(tài)和胃癌組織中TFF1的表達(dá)明顯下調(diào)，可能是胃黏膜惡變的早期事件之一［3］。TFF1作為三葉因子家族成員之一，具有保護(hù)胃腸道黏膜、促進(jìn)細(xì)胞遷移和黏膜修復(fù)的重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中藥組TFF1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其他各組，提示養(yǎng)陰活胃合劑可能通過增加胃黏膜TFF1表達(dá)而起到治療慢性萎縮性胃炎的作用，從而抑制腫瘤的產(chǎn)生。Bcl-2是Tsujimoro等人在1985年最先從濾泡性非霍奇金淋巴瘤中分離出來的一個(gè)抗凋亡基因。轉(zhuǎn)基因研究表明，Bcl-2為致癌基因，主要通過抑制線粒體依賴性凋亡通路被激活的功能達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡和延長(zhǎng)細(xì)胞壽命的作用造成腫瘤細(xì)胞堆積［4］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胃竇黏膜Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)明顯升高，經(jīng)養(yǎng)陰活胃合劑干預(yù)后，中藥高、中劑量組及陽(yáng)性藥物對(duì)照組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈減少趨勢(shì)，表明養(yǎng)陰活胃合劑能不同程度地下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，可能在一定程度上促使胃黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡平衡，改善甚至逆轉(zhuǎn)CAG胃黏膜的病理狀態(tài)。

綜上所述，通過本研究提示養(yǎng)陰活胃合劑可明顯降低Bcl-2和增強(qiáng)TFF1的表達(dá)，通過保護(hù)胃黏膜細(xì)胞，阻止癌前病變進(jìn)一步發(fā)展，促使病變胃黏膜恢復(fù)正常，起到改善甚至逆轉(zhuǎn)CAG病變的作用。

［1］ 王文，張仲海，夏天．消萎靈對(duì)大鼠胃黏膜癌前病變的逆轉(zhuǎn)作用［J］．新中醫(yī)，1999，31(7):39-40．

［2］ 戴明，丁國(guó)寧，雷云霞，等．養(yǎng)陰活胃合劑治療慢性萎縮性胃炎患者胃鏡組織學(xué)影響［J］．陜西中醫(yī)，2013，7(9):34．

［3］ 石淑青，蔡建庭．三葉因子Ⅰ和Ⅱ在胃癌和癌前狀態(tài)中的表達(dá)［J］．中華內(nèi)科雜志，2004，43(3):195-198．

［4］ Mariano M T，Moritti I，Donelli A，et al．Bcl-2 gene expression in hemato poietic cell differentiation［J］．Blood，1997，80:768-775．