柴苓護(hù)肝顆粒的優(yōu)化工藝

楊瑾 莫國(guó)棟 宋鳳蘭 李嘉良 曾維國(guó) 林麗

柴苓護(hù)肝顆粒是由柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材組成，具疏肝利膽，解酒瀉毒的功效，臨床用于酒精肝、脂肪肝、急慢性病毒性肝炎等的治療。方中柴胡疏肝解郁，使肝氣條達(dá)為君藥，現(xiàn)代藥理研究表明柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有保肝、抗炎、抗病毒、解熱、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性作用［1-6］。干膏得率作為劑型選擇的參考指標(biāo)，是確定顆粒劑藥物日服量、單服量及包裝規(guī)格的重要參數(shù)［7-9］。因此，本文以方中柴胡總皂苷與浸膏得率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選柴苓護(hù)肝顆粒水提醇沉工藝。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)［UV-1800島津儀器(蘇州)有限公司］;十萬(wàn)分之一電子天平(AUW220D SHIMADZU);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52C上海亞榮生化儀器廠);恒溫水浴鍋(B-220上海亞榮生化儀器廠);AS系列超聲波清洗機(jī)(AS20500A天津奧特賽恩斯儀器有限公司);AP-01P真空泵(AP-01P天津奧特賽恩斯儀器有限公司);濃縮鍋(06038湖南衡陽(yáng)金一帆制藥設(shè)備實(shí)業(yè)有限公司);數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(10-2A上海滬越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司、滬越科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1．2 試藥

柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司。

柴胡皂苷d對(duì)照品(含量98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):110833-200302，中國(guó)藥品生物制品檢定所);硅藻土、氨水、甲醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛、乙醇、蒸餾水。

2 方法

2．1 干膏得率的測(cè)定方法

參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)(附錄XA)浸出物測(cè)定法。各正交實(shí)驗(yàn)中藥液濃縮或定容至100 mL，精密吸取正交試驗(yàn)所得的藥液5 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿(設(shè)重量為W1)中，水浴揮干，殘?jiān)?05℃干燥3小時(shí)，取出，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定總重量(重量為W2)，通過(guò)公式1計(jì)算其干膏得率。

2．2 總皂苷的含量測(cè)定方法的建立

2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取柴胡皂苷d對(duì)照品10．68 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0．05 mL、0．10 mL、0．15 mL、0．20 mL、0．25 mL、0．5 mL置1 mL容量瓶中，稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取各溶液0．5 mL，另取0．5 mL甲醇作為空白，分別精密加入0．1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0．5 mL搖勻，于70℃反應(yīng)10分鐘，取出，放冷，加入磷酸6 mL，70℃反應(yīng)30分鐘，取出，放冷，在波長(zhǎng)300 nm至600 nm掃描，得最大吸收波長(zhǎng)為544 nm。于544 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，以柴胡皂苷d的濃度(X)為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:Y=0．7067X－0．0227(r=0.9998)，表明柴胡皂苷 d 在0．1068～1．068 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)圖1。

圖1 柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2．2．2 精密度考察 取同一柴胡皂苷d對(duì)照品溶液，按2．2．1項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行操作，于544 nm連續(xù)測(cè)定吸光度6次，吸光度的RSD值為0．19%，表明儀器的精密度良好，符合測(cè)定要求。見(jiàn)表1。

表1 供試品的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2．2．3 重現(xiàn)性考察 分別取相同的6份供試品溶液，按2．2．1項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行操作，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總皂苷含量，結(jié)果皂苷含量的RSD為1．1%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。見(jiàn)表2。

表2 供試品溶液的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2．2．4 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按2．2．1項(xiàng)下顯色方法進(jìn)行操作，室溫放置，分別于0、15、30、45、60、90、120 分鐘測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1．2%，表明樣品溶液在90分鐘內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表3。

2．2．5 加樣回收考察 精密量取已知皂苷含量的樣品溶液2．5 mL，共9份，每份分別準(zhǔn)確加入柴胡皂苷 d 對(duì)照品2．638 mg、5．278 mg、10．560 mg(每個(gè)濃度3份)，定容至5 mL，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度，皂苷的平均加樣回收率為100.9%，RSD為2．9%。見(jiàn)表4。

表3 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2．2．6 樣品測(cè)定 精密量取樣品溶液5 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加入1．5 g硅藻土混合，研勻，全部轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入5%氨水甲醇溶液25 mL，浸泡30分鐘，超聲30分鐘，濾過(guò)，再用5%氨水甲醇15 mL清洗錐形瓶和漏斗，合并濾液，揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 mL。再分別精密吸取2 mL至具塞試管中，加甲醇至5 mL。按2．2．1項(xiàng)下進(jìn)行操作，測(cè)得其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求總皂苷的含量。

2．3 水提工藝優(yōu)化

2．3．1 因素水平的確定 在單因素考察的基礎(chǔ)上，根據(jù)處方中藥物性質(zhì)及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)選擇藥材浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量為考察因素，對(duì)水提工藝的進(jìn)行優(yōu)選，以確定最佳水提條件，為生產(chǎn)提供依據(jù)。各因素設(shè)3個(gè)水平，因素水平表見(jiàn)表5。2．3．2 樣品溶液的制備 處方:柴胡160 g、豬苓200 g、黨參 200 g、白術(shù) 133 g、澤瀉 160 g、姜半夏133 g、桂枝133 g、炙甘草80 g、葡萄糖粉適量。按以上處方配比稱取柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草八味藥材共90 g，根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)表安排進(jìn)行藥材水提處理，加水浸泡煎煮，收集水提液，濃縮至100 mL，得9份樣品溶液，按上述干膏得率測(cè)定方法和總皂苷測(cè)定方法測(cè)定。

表5 水提因素水平表

2．4 醇沉工藝優(yōu)化

2．4．1 因素水平的確定 根據(jù)藥物的特性并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，醇沉工藝選取了對(duì)醇沉影響較大的醇沉濃度、醇沉?xí)r間及濃縮液相對(duì)密度(50℃測(cè))3個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素選擇了3個(gè)水平，選擇L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表6。

表6 醇沉因素水平表

2．4．2 樣品溶液的制備 按處方配比稱取柴胡、豬苓、黨參、白術(shù)、澤瀉、姜半夏、桂枝、炙甘草藥材810 g，按上述確定的水提工藝進(jìn)行提取，提取液過(guò)濾，濃縮至900 mL，精確分為9份，每份100 mL，將各份溶液根據(jù)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表安排進(jìn)行濃縮及醇沉，抽濾，濾液減壓回收乙醇，再分別定容至100 mL。按上述干膏得率測(cè)定方法和總皂苷測(cè)定方法測(cè)定。

3 結(jié)果

3．1 水提工藝結(jié)果

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提過(guò)程中影響提取效率的因素D(加水量)＞A(浸泡時(shí)間)＞B(煎煮時(shí)間)＞C(煎煮次數(shù))，最佳水提工藝條件為A3B3C3D2，即藥材加10倍量水，浸泡3小時(shí)，提取3次，每次提取2小時(shí)。方差分析表明浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量對(duì)提取效率均沒(méi)有顯著性影響。煎煮次數(shù)對(duì)提取效率影響較小，為了縮短提取周期，節(jié)約能源，結(jié)合大生產(chǎn)實(shí)際，將最終工藝確定為A3B3C2D2，即加10倍量水，藥材浸泡3小時(shí)，提取2次，每次提取2小時(shí)。見(jiàn)表7、8。

表7 水提正交試驗(yàn)結(jié)果表

表8 綜合評(píng)分方差分析

表9 醇沉正交試驗(yàn)結(jié)果表

表10 方差分析表

3．2 醇沉工藝結(jié)果

從以上結(jié)果可知，醇沉過(guò)程中影響提取效率的因素C(濃縮液相對(duì)密度)＞B(醇沉?xí)r間)＞A(醇沉濃度)，經(jīng)方差分析可知，濃縮液相對(duì)密度和醇沉?xí)r間對(duì)醇沉效果有顯著性影響，醇沉最佳工藝為A2B3C2，即提取液濃縮至相對(duì)密度為1．16～1．20，加乙醇使含醇量為50%，靜置36小時(shí)。見(jiàn)表9、10。

3．3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以確保提取工藝合理可行，按上述優(yōu)選水提及醇沉工藝，重復(fù)試驗(yàn)3次。即按處方配比稱取藥材90 g，加10倍量水，浸泡3小時(shí)，煎煮2次，每次2小時(shí)，藥液濃縮至相對(duì)密度為1．16～1．20，放冷，加乙醇使藥液含醇量為50%，靜置36小時(shí)，取上清液濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇至無(wú)乙醇味，濃縮液定容至100 mL，按上述干膏得率測(cè)定方法和總皂苷測(cè)定方法測(cè)定。由表11可知，采用此水提工藝干膏得率均值為16.70%，總皂苷均值為3．752 mg/mL，說(shuō)明該水提工藝條件基本穩(wěn)定，具有可重現(xiàn)性。

表11 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表

4 討論

柴胡作為傳統(tǒng)中藥，主歸肝膽經(jīng)，具有解表退熱，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣的功效，由柴胡組成的方劑治療肝病均有較好的臨床療效［10-11］。中藥傳統(tǒng)湯劑多以水煎煮提取，本試驗(yàn)尊重柴苓護(hù)肝方的傳統(tǒng)水煎方式，以君藥柴胡的主要活性成分柴胡總皂苷及得膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中干膏得率權(quán)重系數(shù)0.4，總皂苷含量權(quán)重系數(shù)0．6，規(guī)定干膏得率最大值為40分，總皂苷含量最大值為60分，其余值對(duì)應(yīng)比較，兩項(xiàng)相加得綜合評(píng)分，對(duì)柴苓護(hù)肝方的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)選的工藝簡(jiǎn)單，活性成分的提取率高，為柴苓護(hù)肝顆粒的制備工藝研究奠定了基礎(chǔ)，并為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

豬苓多糖、黨參多糖等成分具有明顯的保肝作用，因此，總多糖含量也作為考察的指標(biāo)，為日后建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做準(zhǔn)備。但是目前總多糖含量測(cè)定數(shù)據(jù)不理想，所以課題組將總多糖含量的測(cè)定作為后期工藝優(yōu)化的重點(diǎn)。

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