副豬嗜血桿菌感染禁食初乳仔豬實(shí)驗(yàn)動物模型的構(gòu)建＊

陳洪波，程 蕾，向 敏，趙書紅，侯永清，黎旺明

（1.武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430023；2.武漢市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北武漢430208；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070；4.通城縣種畜場，國家級華中兩頭烏豬（通城豬）保種場，湖北通城437400）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是一種非溶血、NAD依賴性的革蘭氏陰性短小桿菌，作為一種機(jī)會致病菌，通常存在于健康豬只的上呼吸道部位。毒力菌株侵入機(jī)體后可引起菌血癥，臨床表現(xiàn)以豬格拉澤氏?。℅l?sser＇s disease）為主要特征，即纖維蛋白性心包炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎，進(jìn)而使動物敗血病癥加重；有些感染還導(dǎo)致鼻炎、中耳炎和急性肺炎等［1－2］。目前，HPS已成為豬場最主要的細(xì)菌性病原體之一，每年給包括我國在內(nèi)的世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失［2］。由于該菌存在多種血清型并且不同血清型菌株毒力存在較大差異，所以現(xiàn)有疫苗在異源保護(hù)方面并不理想［3］。抗生素治療不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本上升，還會引起一系列社會、環(huán)境問題，正迫使人們研發(fā)更加有效的預(yù)防方案。另外，研究表明：豬群中存在針對HPS感染的遺傳差異［4］，這使得通過遺傳改良途徑培育出抗性品系／品種成為可能。構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的活體感染模型是深入研究這些問題的關(guān)鍵。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)豬只的不同，活體感染模型的構(gòu)建有多種。自然分娩后、仔豬哺乳期間，細(xì)菌可于較早時(shí)間經(jīng)母豬傳染給仔豬，所以新生小豬首先會存在針對細(xì)菌的被動免疫，隨后會建立主動免疫［5－6］，因此利用普通仔豬使得實(shí)驗(yàn)條件下復(fù)制豬格拉澤氏病的穩(wěn)定性大大降低。Vahle等［7］曾利用剖腹產(chǎn)、禁食初乳仔豬（Caesarean－derived and colostrum－deprived，CDCD）成功復(fù)制出了HPS感染，但是該方法要求對母豬實(shí)施剖腹產(chǎn)，需要配備專業(yè)的外科手術(shù)醫(yī)生、嚴(yán)格的無菌手術(shù)室等條件，導(dǎo)致成本極其高昂，并不現(xiàn)實(shí)。無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）仔豬即HPS陰性仔豬也曾被應(yīng)用于HPS感染的活體建模［8］，但是在目前生產(chǎn)條件下HPS陰性豬群已經(jīng)很難找到，而且該方法同樣對技術(shù)要求很高致使成本昂貴，操作難度更大且不可靠。

禁食初乳（colostrum－deprived，CD）仔豬，即仔豬經(jīng)母豬自然分娩后立即作必要隔離并禁食初乳，使用代乳料飼喂。以CD仔豬作為實(shí)驗(yàn)動物可以成功復(fù)制HPS感染［9－10］：一方面，由于仔豬出生后與母豬的早期隔離，阻止了HPS于上呼吸道的定植、最大程度上避免了母體抗體的不利影響；另一方面，與CDCD和SPF仔豬相比，飼養(yǎng)期間不需要苛刻的無菌環(huán)境，硬件條件相對寬松，操作簡單、成本較低。因此，CD仔豬被認(rèn)為比較適合用于實(shí)驗(yàn)條件下的HPS感染建模。鑒于現(xiàn)有相關(guān)技術(shù)仍存在諸多問題，本研究旨在結(jié)合國內(nèi)實(shí)際條件，以不同品種豬只為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)一步探討利用CD仔豬進(jìn)行HPS感染的可行性與科學(xué)性，并對相關(guān)技術(shù)流程做進(jìn)一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試驗(yàn)場地

同日出生通城仔豬（n＝12）選自國家級華中兩頭烏豬（通城豬）保種場；同日出生杜長大三元雜交仔豬（n＝15）選自武漢市江夏區(qū)某大型畜禽有限公司。母豬自然分娩時(shí)實(shí)施人工助產(chǎn)，經(jīng)產(chǎn)道分娩后避免新生仔豬吮吸初乳，禁止其接觸母豬、地面、欄舍等；斷臍、擦干后立即轉(zhuǎn)入經(jīng)萬金水○R（深圳市某公司）消毒處理的泡沫保溫箱中。全部仔豬分娩后于3～5h內(nèi)運(yùn)輸至武漢市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號：SYXK（鄂）2014－0081］；實(shí)驗(yàn)中心采用負(fù)壓凈風(fēng)系統(tǒng)，環(huán)境溫度25℃左右，進(jìn)豬前經(jīng)臭氧徹底消毒處理，保育欄懸掛紅外保溫?zé)粢暂o助仔豬取暖。

1.2 CD仔豬的飼喂

對新生CD仔豬采用嬰兒奶瓶飼喂流食，40～45℃溫開水沖泡，每餐前對奶瓶清洗后紫外消毒30 min，每只仔豬固定用同一只奶瓶。CD仔豬的1～12日齡均喂食人工乳；13～21日齡采用人工乳并輔助顆粒飼料飼喂，每1L流食中按照顆粒料每日5%～10%的比例遞加，對應(yīng)人工乳粉以5%～10%的比例減少；22日齡后自由采食顆粒飼料和飲水（溫開水）。期間，7～21日齡不間斷訓(xùn)練采食顆粒飼料（料槽內(nèi)撒飼）。詳細(xì)飼喂方案見表1。

1.3 CD仔豬的日常管理

CD仔豬出生后禁食初乳，不進(jìn)行任何疫苗注射；為減少應(yīng)激，無斷牙、斷尾處理，僅利用耳標(biāo)鉗佩戴耳標(biāo)。

表1 禁食初乳仔豬飼喂方案Table 1 Feeding program for colostrum－deprived piglets

所有CD仔豬1日齡時(shí)肌肉注射濃度為10%的右旋糖酐鐵注射液1mL（東方澳龍制藥有限公司）。1～3日齡時(shí)，根據(jù)CD仔豬的體重，每天向每頭CD仔豬注射50μL／kg的肌注土霉素注射液（華北制藥股份有限公司）以防止拉稀。3日齡后若有拉稀發(fā)生，則立即轉(zhuǎn)入隔離欄喂養(yǎng)直至康復(fù)；期間，根據(jù)體重，自發(fā)現(xiàn)日起，連續(xù)3d，向?qū)?yīng)CD仔豬早晚分別注射50μL／kg的土霉素注射液和頭孢噻呋鈉注射液（齊魯動物保健品有限公司）；加強(qiáng)保暖的同時(shí)，每天灌食糖鹽水以補(bǔ)充體液，每升糖鹽水中含20g葡萄糖、3.5g氯化鈉和2.5g碳酸氫鈉，攻毒前2周停用任何抗生素藥品。對于因打斗等因素造成的外傷及時(shí)做消毒、包扎等必要處理。

人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)動物中心均需噴霧消毒（萬金水○R經(jīng)1∶500稀釋后使用），動物欄舍等每日噴霧消毒1～2次；動物糞尿每日于消毒后清理。攻毒前不定期利用水銀體溫計(jì)直腸測溫以鑒別異常豬只，加強(qiáng)日常觀察，每日記錄仔豬狀態(tài)并評分（正常：N，10＇；異常：A，輕微拉稀或發(fā)燒畏寒9＇，拉稀7＇，消瘦5＇；死亡：D，0＇）。早上給料前，每隔1周空腹稱重。

對于因噴霧消毒、人工喂乳導(dǎo)致的仔豬體表過分濕潮，采用豬爽寶（北京清智德成科技有限公司）均勻涂抹軀體以快速干燥體表防止仔豬體溫失調(diào)。22日齡時(shí)，每個(gè)品種豬只隨機(jī)分為兩組：對照組和攻毒組，分組后分欄飼養(yǎng)。

1.4 HPS細(xì)菌培養(yǎng)與CD仔豬攻毒

HPS（0165菌株，血清型5）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周銳教授惠贈。細(xì)菌凍干粉利用TSA平板［5%（v／v）胎牛血清，0.006%（m／v）NAD］劃線，37℃培養(yǎng)24～36h后挑取單菌落，然后于TSB液體培養(yǎng)基［5%（v／v）胎牛血清，0.006%（m／v）NAD］中37℃、180rpm擴(kuò)大培養(yǎng)約12h。對新鮮菌液利用無菌PBS經(jīng)100萬倍稀釋，取100μL均勻點(diǎn)涂TSA平板，37℃培養(yǎng)后進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，同時(shí)，測定新鮮菌液的OD600吸光度；重復(fù)多次，建立細(xì)菌CFU與OD600值的一元線性回歸方程。

35日齡時(shí)采集CD仔豬鼻拭子，確認(rèn)動物為HPS陰性，具體做法為：將采集的鼻拭子迅速置于500μL無菌PBS中，充分震蕩10min后于10 000 g離心10min，去掉上清，以離心管底部微量懸液為模板（取1μL）直接進(jìn)行細(xì)菌特異性16SrDNA檢測；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物821bp，引物序列為：5＇GGCTTCGTCACCCTCTG3＇／5＇GTGATGAGGAAGGG TGGTGT3＇（Tm＝60℃）。前腔靜脈采集非抗凝外周血2mL，室溫靜置2h后再于4℃靜置6h，然后4℃、8 000rpm離心10min分離血清；利用豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）ApxIV－ELISA抗體檢測試劑盒（武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司）檢測CD仔豬血清APP抗體以判斷動物是否存在APP感染，具體方法參照試劑盒說明書。

45～46日齡實(shí)施HPS攻毒。攻毒前使用鎮(zhèn)定劑麻醉豬只，具體為：空腹稱重后肌肉注射0.1mg／kg硫酸阿托品注射液，15min后肌肉注射10mg／kg Zoletil 50?（法國維克）；待仔豬麻醉后（約5～10 min）氣管內(nèi)接種致死劑量的HPS細(xì)菌109CFU（TSB液體培養(yǎng)基懸浮，共1mL），對照組豬只氣管內(nèi)注射1mL無菌TSB液體培養(yǎng)基；攻毒后肌肉注射0.15mg／kg阿替美唑解除麻醉。

1.5 臨床病征觀察與數(shù)據(jù)采集

攻毒后每日定時(shí)直腸測溫。密切觀察豬群狀態(tài)，共包括以下六項(xiàng)內(nèi)容：行為舉止（機(jī)敏性）、呼吸（急促程度）、跛行／關(guān)節(jié)腫脹（單肢、雙肢、倒地）、神經(jīng)癥狀（肌肉僵直、顫抖、抽搐、癱瘓）、咳嗽和進(jìn)食。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物剖檢與樣本采集

分別于HPS攻毒前后0dpi（day post infec－tion）、1dpi、3dpi利用一次性真空采血管（武漢致遠(yuǎn)醫(yī)療科技有限公司）經(jīng)前腔靜脈采集2mL外周血（EDTAK2抗凝）用于血液參數(shù)分析和細(xì)菌分離。攻毒后對垂死豬只經(jīng)麻醉處理后（方法同前述）放血、剖檢，重點(diǎn)檢查：腹腔、胸腔、心包腔、大腦、關(guān)節(jié)等部位。采集腹膜、脾臟、肺臟、心臟、大腦、硬腦膜等組織用于組織病理分析等。

1.7 HPS分離鑒定

取抗凝外周血100μL，利用無菌PBS等倍稀釋后涂TSA平板，37℃培養(yǎng)24～36h后挑取HPS疑似單菌落利用PCR法進(jìn)行鑒定（方法同前述）。利用血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒（天根生化）提取肺臟組織以及其中HPS細(xì)菌基因組DNA，PCR法擴(kuò)增HPS 16SrDNA，鑒定HPS（方法同前述）。

1.8 組織病理與血液參數(shù)分析

仔細(xì)切取適當(dāng)大小新鮮組織于4%多聚甲醛浸泡固定至少24h，制作石蠟切片，HE染色后用于組織病理分析。利用全自動五分類血細(xì)胞分析儀（CELL－DYN○R3700，美國雅培）分析HPS攻毒前后外周血中WBC（白細(xì)胞絕對值）、NEU（嗜中性粒細(xì)胞絕對值）、LYM（淋巴細(xì)胞絕對值）、MONO（單核細(xì)胞絕對值）、EOS（嗜酸性粒細(xì)胞絕對值）、BASO（嗜堿性粒細(xì)胞絕對值）、RBC（紅細(xì)胞）等22項(xiàng)血液參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD仔豬存活率與生長發(fā)育

依據(jù)本研究建立的CD仔豬飼喂、管理流程（圖1），通城豬和杜長大三元雜交豬至感染前分別死亡2頭和3頭，存活率分別為83.3%（10／12）和80%（12／15）；總體上，存活率達(dá)81.5%（22／27）。臨床觀察發(fā)現(xiàn)：腹瀉是仔豬死亡的主要原因，多見于4～9日齡，其中1頭于35日齡死亡，期間少食甚至拒食，迅速消瘦，病發(fā)后2～3天死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡仔豬中存在卡他性腸炎并伴隨肺炎癥狀；采集病灶組織經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)后顯示至少存在大腸桿菌感染（數(shù)據(jù)未列出）。

生長發(fā)育方面，通城豬斷奶前（21日齡）日增重18～66g不等，平均日增重38g；斷奶后（22日齡）至感染前（45日齡）日增重61～247g，平均日增重約154g；杜長大豬斷奶前（21日齡）日增重32～69 g，平均日增重51g；斷奶后（22日齡）至感染前（46日齡）日增重165～267g，平均日增重約210g。這些數(shù)據(jù)表明，相對于雜交品種，通城豬在總體上生長速度明顯較慢。

2.2 HPS攻毒后CD仔豬臨床病征

攻毒前，對健康存活的通城和杜長大CD仔豬的病原體檢測顯示：兩豬群均未無HPS感染（圖2，A～B），而且通城豬體內(nèi)不存在APP（圖2C）；但所有杜長大豬體內(nèi)APP血清抗體呈陽性（圖2C），表明存在APP野毒感染。實(shí)驗(yàn)于22日齡將兩個(gè)豬群分別隨機(jī)分為攻毒組和對照組，根據(jù)前期利用新鮮菌液建立的HPS細(xì)菌OD600值與CFU之間的一元線性回歸方程（圖2，D～E），于45～46日齡實(shí)施氣管內(nèi)接種攻毒。

圖1 副豬嗜血桿菌感染前禁食初乳仔豬飼養(yǎng)管理程序Fig.1 Feeding and management schedule for colostrum－deprived piglets before HPS

圖2 感染前禁食初乳仔豬中副豬嗜血桿菌檢測、培養(yǎng)和豬胸膜肺炎放線桿菌檢測A.通城仔豬（泳道1～10）中副豬嗜血桿菌檢測，“＋”為陽性對照（821bp），“－”為陰性對照，“M”為DNA marker（DL2000）；B.杜長大仔豬（泳道1～12）中副豬嗜血桿菌檢測；C.CD仔豬中APP檢測；D.副豬嗜血桿菌TSA平板生長的單菌落（其中箭頭所指為雜菌）；E.副豬嗜血桿菌CFU與OD600吸光值之間的一元線性回歸方程Fig.2 Feeding and management schedule for colostrum－deprived piglets before c HPSA.HPS detections in Tongcheng piglets（lane 1～10）.“＋”and“－”is the positive and negative control of HPS 16srDNA（821bp），respectively.“M”is the DNA ladder of DL2000.B.HPS detections in Duroc×Landrace×Large white piglets（lane 1～12）.C：APP detections in both breeds.D.Single HPS colonies on TSA culture，in which a polluted colony is marked with the arrow.D.The unary linear regression analysis between HPS CFU and OD600

采用致死劑量（109CFU）對CD仔豬氣管內(nèi)接種攻毒后，通城豬臨床征狀明顯，而杜長大三元雜種豬直至感染后2周未呈現(xiàn)任何征狀。通城豬于攻毒后12h便表現(xiàn)出畏寒、扎堆、飲食廢絕，嚴(yán)重個(gè)體甚至已不愿站立；24h后豬只中出現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)腫大的典型征狀，個(gè)別的呈現(xiàn)出急性敗血癥狀或嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。36h起感染豬只開始陸續(xù)死亡，其中，2頭于2dpi死亡（36hpi、40hpi），3頭于3dpi死亡（50hpi、52hpi、68hpi），1頭于4dpi死亡（76hpi）；期間，對照組豬只一直正常。

2.3 攻毒前后CD仔豬體溫變化

圖3 副豬嗜血桿菌感染前后禁食初乳仔豬體溫變化圖A和圖B分別代表通城豬對照組和攻毒組，圖C和圖D分別代表杜長大豬對照組和攻毒組；“C”和“I”分別表示“對照”和“感染”。Fig.3 Body temperature changes in colostrum－deprived piglets before and after HPSTemperatures of the control groups（“C”）and HPS challenged（“I”）groups from Tongcheng（TC）and Duroc×Landrace× Large white（DLL）breeds are presented in figures A～B and C－D，respectively.

攻毒前，通城CD仔豬總體體溫基本保持在38.5～40℃，平均39.5℃（圖3，A～B）；HPS感染后，對照組豬只體溫?zé)o明顯變化，而攻毒組仔豬體溫于1日內(nèi)便明顯升高，甚至接近42℃（圖3B），部分急性感染仔豬因?yàn)闉l臨死亡，攻毒后2天體溫開始下降。攻毒前，絕大多數(shù)杜長大CD仔豬體溫基本保持在39～40℃，個(gè)別豬只略微高于40℃（圖3，C～D）；HPS感染后，除攻毒組中1頭仔豬體溫明顯升高外（6～8dpi），無論對照組還是攻毒組體溫2周內(nèi)均無明顯變化。

2.4 實(shí)驗(yàn)動物剖檢與組織病理

HPS攻毒后，所有通城仔豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的敗血癥狀，尤其是在四肢末端和吻突最為明顯，此外體表其他部位也呈現(xiàn)出敗血病征（圖4A）。剖檢分析顯示，HPS感染導(dǎo)致仔豬肺臟（圖4D）等組織不同程度地出現(xiàn)炎癥變化，其中，纖維素性漿膜炎主要集中在腹腔（圖4E）、胸腔和心包腔（圖4G）；尤其在心臟表面可見大量纖維素沉積。此外，在腹腔、胸腔、心包腔和關(guān)節(jié)腔（圖4B）有大量積液產(chǎn)生，甚至腹腔積液較為渾濁（伴隨纖維素滲出）。肉眼觀察未在腦部（硬腦膜）發(fā)現(xiàn)明顯病變；對照組動物未見上述炎癥病變（圖4，H和I）。

石蠟組織切片鏡檢后發(fā)現(xiàn)（圖5），盡管剖檢顯示腦部病征不明顯但是HPS感染可能導(dǎo)致仔豬伴隨較為嚴(yán)重的纖維素－化膿性腦膜炎，與腹膜、心臟組織類似，感染后大腦中也存在較多的白細(xì)胞侵潤。細(xì)菌感染還導(dǎo)致心臟、脾臟、肺臟在組織形態(tài)上發(fā)生較大改變，主要表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)松軟，中間充斥較多的纖維蛋白沉積；此外，脾臟組織動脈外周淋巴鞘（periarterial lymphoid sheath，PALS）和淋巴濾泡中淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少（可能與細(xì)菌感染導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞溶解有關(guān)）。HPS感染還導(dǎo)致發(fā)病豬只肺臟、脾臟、腹膜和大腦組織中不同程度地出現(xiàn)血管充血、腫脹、凝血甚至性成血栓，這些組織病理變化與臨床上觀察到的急性敗血癥狀相吻合。

2.5 攻毒后HPS分離鑒定

HPS攻毒后采集外周血，經(jīng)TSA平板培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)絕大多平板有菌落生成且生長速度較快（37℃恒溫培養(yǎng)5～6h后即形成肉眼可見菌落），菌落形態(tài)鑒別顯示大多不是HPS（雜菌），這通過對細(xì)菌特異性基因的PCR擴(kuò)增后得以進(jìn)一步證實(shí)。但是部分仔豬的TSA血平板上疑似目的菌，與雜菌相比，疑似菌生長速度較慢而且呈透明或半透明狀，區(qū)別十分明顯（圖6B）。同時(shí)以雜菌和標(biāo)準(zhǔn)HPS細(xì)菌為對照，PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)：在經(jīng)HPS攻毒的6頭通城仔豬中有4頭仔豬外周血中分離出了HPS（圖6 A）。其中，對04、06、11號仔豬于攻毒后1天內(nèi)便可以檢出（圖6A中分別編號為0401、0601、1101）；對05號仔豬于攻毒后第3天檢出（0503）。部分仔豬由于在攻毒后較早死亡，試驗(yàn)中未做檢測。實(shí)驗(yàn)分別隨機(jī)選擇3頭攻毒和對照仔豬，對肺臟組織中細(xì)菌特異性基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，攻毒組仔豬中肺部存在HPS病原體（圖6C）。

圖4 副豬嗜血桿菌感染后通城仔豬剖檢分析Fig.4 Gross findings of necropsy in Tongcheng piglets afte HPS challenge

圖5 副豬嗜血桿菌感染后通城仔豬組織病理分析（×200）對照組織和感染組織分別以“C”和“I”標(biāo)識Fig.5 Histopathological findings in tissues of Tongcheng piglets after HPS challenge（×200）Tissues from the control group and HPS infected group are marked with“C”and“I”，respectively

2.6 HPS感染后外周血細(xì)胞亞類分析

血液五分類結(jié)果（圖7）表明，致死劑量細(xì)菌感染后仔豬外周血中紅細(xì)胞（RBC）和總白細(xì)胞（WBC）數(shù)量未發(fā)生明顯變化。但是具體到白細(xì)胞亞類，嗜中性粒細(xì)胞（NEU）和嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）感染后有增殖趨勢；而淋巴細(xì)胞（LYM）和單核細(xì)胞（MONO）呈下降趨勢，其中以前者較為明顯，這與組織病理觀察到的脾臟中的情況相一致。嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）在外周血中的水平一直很低，由于部分樣本中BASO檢測失敗，本研究未做進(jìn)一步分析。

圖6 副豬嗜血桿菌感染后通城仔豬中細(xì)菌分離與PCR鑒定A.血液－TSA平板的菌落PCR鑒定；B.血液中分離出HPS細(xì)菌的代表性TSA平板，箭頭所指為HPS菌落（較大菌落為雜菌）；C.肺臟組織中HPS細(xì)菌的PCR鑒定Fig.6 Bacteria isolation and PCR from Tongcheng piglets challenged with HPSA.Image of the PCR results from blood－TSA cultures.B.Representative image of the blood－TSA culture，in which HPS colonies are marked with the arrow（bigger colonies are the polluted bacteria）.C.PCR result of HPS specific 16s rDNA from control and challenged lungs

圖7 副豬嗜血桿菌感染前后通城仔豬外周血細(xì)胞水平變化Fig.7 Changes of peripheral blood cells in Tongcheng piglets before and after HPS

3 討 論

由于絕大多數(shù)豬場均不同程度地存在HPS，仔豬出生后通過與母豬、欄舍等接觸可以在很短時(shí)間內(nèi)被感染，通常細(xì)菌會駐留在扁桃體［6］、氣管［8］和鼻腔［11］中，但并無發(fā)病表現(xiàn)，這主要是由于受母體抗體（初乳中）和仔豬自身隨后建立的主動免疫雙重因素的影響［5－6］。但作為一種機(jī)會致病菌，仔豬本身的免疫狀態(tài)與HPS感染發(fā)病關(guān)系密切［5］；此外，斷奶應(yīng)激、轉(zhuǎn)群應(yīng)激以及其他病原體協(xié)同感染均有可能誘發(fā)格拉澤氏?。?］。所以，利用普通斷奶仔豬復(fù)制HPS感染不僅比較困難而且非常不穩(wěn)定。與利用CD仔豬復(fù)制HPS感染相比，利用CD仔豬不僅可以穩(wěn)定地復(fù)制出格拉澤氏病，而且操作更為簡單、經(jīng)濟(jì)［9－10］。

保證CD仔豬存活率是復(fù)制HPS感染的前提，也最為關(guān)鍵。與Blanco等［10］不同，本研究采用商業(yè)化的仔豬代乳料飼喂仔豬，因?yàn)閷τ诖蟛糠謱?shí)驗(yàn)室獲得牛初乳可能比較困難，此外，牛初乳需要做消毒處理，不僅增加了操作的復(fù)雜性而且有可能因處理不當(dāng)加重仔豬腹瀉甚至感染新的病原體。為了減少應(yīng)激，我們一直使用奶瓶飼喂人工乳至21日齡，期間自7日齡起訓(xùn)練小豬采食顆粒料，盡管個(gè)別仔豬早在7日齡會舔食顆粒料，但均屬于較為隨機(jī)的采食行為。一般來講，15日齡內(nèi)仔豬很難主動采食顆粒飼料。所以，之前研究［9－10］中于4日齡斷奶后轉(zhuǎn)為顆粒料流食喂養(yǎng)至15日齡的強(qiáng)化訓(xùn)練做法很可能會增加仔豬應(yīng)激。本研究通過較長時(shí)間的人工乳喂養(yǎng)與13日齡起漸進(jìn)式地向顆粒飼料過渡（圖1），總體上使得仔豬感染前成活率達(dá)81.5%，高于國外實(shí)驗(yàn)室29%［9］或79%［10］的水平。

影響HPS感染的諸多因素中不僅包括母體抗體和仔豬免疫狀態(tài)，相關(guān)病癥的出現(xiàn)與否可能還與其他病原體感染有關(guān)。采用致死劑量HPS攻毒后所有通城仔豬癥狀明顯并且于4日內(nèi)發(fā)病死亡；而杜長大仔豬直至攻毒后2周不僅未見體溫升高也無明顯臨床病征。盡管感染前通城仔豬和杜長大仔豬均顯示為HPS陰性，但是ELISA檢測發(fā)現(xiàn)杜長大仔豬中存在APP感染（圖2C）；由于APP與HPS同屬巴斯德菌科，二者之間可能存在交叉免疫保護(hù)。有意思的是，F(xiàn)u等［12］證明：采用基因缺失的APP減毒活菌株免疫仔豬后可以對致死劑量的HPS感染產(chǎn)生免疫保護(hù)。所以，本研究中利用杜長大CD仔豬復(fù)制HPS感染失敗極可能與APP血清抗體的交叉保護(hù)有關(guān)。這也提示我們，復(fù)制豬格拉澤氏病至少要保證實(shí)驗(yàn)動物為HPS和APP雙陰性豬。但由于HPS也會引起肺炎癥狀，同時(shí)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌存在與其他多種重大病原體如豬藍(lán)耳病病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）、豬流感病毒（Swine Influenza Viruses，SIV）、豬圓環(huán)病毒II型（Porcine Circovirus type－2，PCV－2）、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）、豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）、致病性埃希氏大腸桿菌（E.coli）等存在協(xié)同感染情況［13－15］，故對CD仔豬的篩選方面充分考慮這些病原體是非常有必要的，盡管結(jié)合國內(nèi)大部分豬場的實(shí)際情況來看有可能會比較困難。

針對HPS感染的CD仔豬模型，不同的科研人員關(guān)注點(diǎn)可能存在差異。根據(jù)病發(fā)的具體情況基本可以分為三種：急性感染、亞急性感染和慢性感染。利用免疫背景清晰、簡單的CD仔豬作實(shí)驗(yàn)動物可能會更容易把握這一點(diǎn)。因?yàn)樵谂懦龔?fù)雜免疫因素的影響之后，通過準(zhǔn)確控制攻毒劑量便有望可以構(gòu)建出理想的活體感染模型。我們發(fā)現(xiàn)，使用新鮮HPS菌液統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量是非常必要的，倘若菌液室溫放置過久或過夜冷藏保存，統(tǒng)計(jì)結(jié)果甚至?xí)嬖跀?shù)量級上的差異。本研究結(jié)果表明，細(xì)菌劑量為109CFU時(shí)可導(dǎo)致100%的通城CD仔豬發(fā)病，其中大部分可以存活3天，個(gè)別豬只死亡較早，暗示還存在影響病程的其他因素；我們結(jié)合臨床感染病發(fā)情況推測體重可能是其中一個(gè)非常重要的因素。Blanco等［10］研究證實(shí)：細(xì)菌劑量為108CFU時(shí)可導(dǎo)致94%的CD仔豬發(fā)病并推測更高劑量可能導(dǎo)致豬只迅速休克［10］。結(jié)合上述結(jié)果，經(jīng)氣管內(nèi)攻毒時(shí)急性感染模型可以以1×109CFU為參照通過加大劑量調(diào)整，而亞急性和慢性模型可以以5×108CFU為參照通過減小劑量調(diào)整，直至5×107CFU。照此，品種因素可以不予考慮，而若采用其他攻毒途徑如鼻腔接種，對應(yīng)劑量可能需要加大，需要進(jìn)一步研究。

從感染動物體內(nèi)分離出HPS細(xì)菌是判定動物模型效果的重要參考之一，除此之外還要密切結(jié)合臨床病癥。本研究中所有通城CD仔豬經(jīng)致死劑量攻毒后盡管死亡時(shí)間存在差異，但是相關(guān)病程基本相同，臨床表現(xiàn)也十分相似，均出現(xiàn)明顯的敗血癥和神經(jīng)性癥狀并伴隨關(guān)節(jié)腫大、不愿站立等情形。剖檢分析顯示所有攻毒組動物存在腹膜炎伴隨渾濁腹腔積液，但心臟部位的病變程度存在一定差異。作為一種重要的豬細(xì)菌性呼吸道疾病病原體，肺臟分菌是優(yōu)先選項(xiàng)。但實(shí)驗(yàn)條件下可能由于不同豬只的感染程度不同，其他組織中（如腹膜、心包膜、關(guān)節(jié)液等）分出細(xì)菌的情況也存在不同［10］。另外，HPS感染可以引起菌血癥［2］，所以對于多時(shí)間點(diǎn)的研究來講血液可以作為首選樣本用于細(xì)菌分離。本研究直接對新鮮抗凝血涂布TSA平板成功分離出了HPS，但是也有血液HPS為陰性的情況。有可能是雜菌的存在抑制了HPS的生長，也有可能是血液中細(xì)菌含量很低，利用TSA固體培養(yǎng)基難以分離。下一步，我們將把TSA平板培養(yǎng)與血液樣本中總DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)合起來，有望會使結(jié)果更準(zhǔn)確。

本研究利用五分類血細(xì)胞分析儀初步對HPS攻毒后通城CD仔豬的血液參數(shù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)HPS可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖（圖7），但由于血液參數(shù)分析本身的技術(shù)限制沒有直接揭示具體的淋巴細(xì)胞類型。我們之前對HPS感染后脾臟轉(zhuǎn)錄組變化的研究揭示出淋巴組織結(jié)構(gòu)與發(fā)育功能（Lymphoid Tissue Structure and Development）以及Th、CTL、B細(xì)胞相關(guān)典型信號通路（canonical pathway）被抑制［16］，這也與本研究對脾臟組織病理的分析結(jié)果一致；與本研究結(jié)果相對應(yīng)，F(xiàn)randoloso等［17］利用流式細(xì)胞術(shù)對于HPS感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答的最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染顯著抑制CD3＋γδTCR＋細(xì)胞和CD3ε＋CD8α＋CD8β＋細(xì)胞增殖。綜上所述，HPS可能通過抑制宿主獲得性免疫應(yīng)答（具體為T淋巴細(xì)胞應(yīng)答）實(shí)現(xiàn)免疫逃避，這為具體深入探討相關(guān)分子致病機(jī)制指明了方向。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)HPS攻毒后血液單核細(xì)胞呈下降趨勢；de la Fuente等［18］研究結(jié)果顯示，盡管感染導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞（PBMC）中SWC3＋單核細(xì)胞和粒細(xì)胞數(shù)量增加，但似乎對宿主的免疫保護(hù)作用不大；隨后他們發(fā)現(xiàn)PBMC中CD172α＋CD163＋單核細(xì)胞于感染后顯著增加，但單核細(xì)胞組織相容性分子SLAIIDR卻與此同時(shí)發(fā)生下調(diào)表達(dá)［17］。我們推測，這種不一致性可能與不同感染模型中單核細(xì)胞增殖或者進(jìn)入組織中（成為巨噬細(xì)胞）的程度不同有關(guān)，我們通過綜合分析多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組變化數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，肺泡巨噬細(xì)胞在抵抗HPS感染中可能具有極其重要的作用（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。我國于2001年將通城豬等19個(gè)豬種列為國家級重點(diǎn)地方品種［19］，Zhou等［20］和Li等［21］研究表明通城豬對PRRSV感染具有較為明顯的抗性，并初步鑒定了相關(guān)抗性基因。因此，針對HPS感染深入探討通城豬相關(guān)細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗性研究，對于系統(tǒng)挖掘我國著名地方豬種優(yōu)勢基因資源具有重要意義。

4 結(jié) 論

（1）本研究結(jié)合國內(nèi)實(shí)際通過對CD仔豬飼養(yǎng)管理流程的進(jìn)一步優(yōu)化提高了仔豬存活率。

（2）經(jīng)致死劑量HPS攻毒后通城CD仔豬具有典型的格拉澤氏病病征，成功構(gòu)建了HPS感染CD仔豬的活體研究模型。

（3）研究為下一步更加清晰探討HPS不同感染模式下宿主－病原體互做的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為豬其他重大病原體活體感染模型的構(gòu)建提供了參考。

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