羅剛銀，王弼陡，繆 鵬，王 磊，田浩然，錢 慶，王鐘周

(中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，中國科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)重點實驗室，江蘇 蘇州215163)

1 引言

熒光標(biāo)記技術(shù)是指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)(如熒光探針，熒光染料等)共價結(jié)合或物理吸附在所要研究樣本的某個基團(tuán)(如蛋白分子、核酸片段等)上，然后利用熒光顯微鏡或者熒光掃描儀等儀器檢測其熒光特性來提供被研究對象的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息(如抗原抗體分布、濃度等)。

用于熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)有很多，如異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、菁染料等。這些熒光染料的激發(fā)波長分布范圍從紫外、可見到近紅外光譜區(qū)，而其發(fā)射波長分布范圍從可見到近紅外光譜區(qū)。其中，近紅外熒光染料(near infrared fluorescence，NIR)的發(fā)射波長為700～1200nm，在該范圍內(nèi)生物分子自身熒光較弱，可避免背景干擾而獲得較高的分析靈敏度;近紅外熒光具有較強(qiáng)的穿透能力，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本的深層檢測;近紅外熒光對樣本造成的光損傷較低，也有利于實現(xiàn)活體檢測［1］。

熒光物質(zhì)的發(fā)光強(qiáng)度常用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)(Laser induced fluorescence，LIF)［2］進(jìn)行檢測，而激光共聚焦掃描技術(shù)(confocal laser scanning，CLS)是共聚焦技術(shù)與LIF技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。LIF技術(shù)和CLS技術(shù)都采用激光作為發(fā)射熒光的激發(fā)光源，但是LIF技術(shù)中照明激光和發(fā)射熒光不通過同一物鏡，激光往往對樣本進(jìn)行斜射照明，是場光源，如用于普通的熒光顯微鏡;而CLS技術(shù)中照明激光和發(fā)射熒光通過同一物鏡，激光往往對樣本進(jìn)行垂直照明，是點光源［3］，如用于激光共聚焦顯微鏡。相對于LIF技術(shù)，CLS技術(shù)具有更高的分辨率［4］，并且可以實現(xiàn)深度熒光掃描。

根據(jù)CLS技術(shù)的工作原理，針對近紅外熒光染料的光譜需求，設(shè)計了近紅外熒光掃描所需的光學(xué)系統(tǒng)，并采用ZEMAX軟件對光學(xué)設(shè)計進(jìn)行了優(yōu)化。

2 激光共聚焦工作原理

CLS光學(xué)系統(tǒng)利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源，點光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小光點。該點處的熒光物質(zhì)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿著原照射光路回送到由二向色鏡構(gòu)成的分光器，而分光器將熒光直接送到光電探測器。激光光源和光電探測器前方都各有一個針孔，分別是照明針孔和探測針孔，相對于焦平面上的光電，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。在熒光探測過程中，來自焦平面的光可以會聚在探測針孔的范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測針孔之外，這也是CLS光學(xué)系統(tǒng)具有很高的光學(xué)分辨率的原因。

CLS光學(xué)系統(tǒng)主要由照明光源、照明光濾光片、照明光聚焦透鏡組、照明針孔、準(zhǔn)直透鏡組、二向色鏡、物鏡、發(fā)射光濾光片、發(fā)射光聚焦透鏡組、探測針孔、光電探測元件等構(gòu)成，如圖1所示。

圖1 激光共聚焦工作原理圖Fig.1 Principle diagram of laser cenfocal

其中，LASER為用作照明光源的激光器;F1為照明光濾光片;F2為發(fā)射光濾光片;L1為照明光聚焦透鏡組;L2為準(zhǔn)直透鏡組;L3為物鏡;L4為發(fā)射光聚焦透鏡組;A1為照明針孔;A2為探測針孔;D1為用于照明光和發(fā)射光分離的二向色鏡，PMT為用于光電探測的光電倍增管。按照功能劃分，CLS光學(xué)系統(tǒng)包括點光源光路、照明光路和發(fā)射光路兩部分，其中點光源光路包括的光學(xué)元件為LASER、F1、A1，照明光路包括的光學(xué)元件為L1、L2、L3、D1，而發(fā)射光路包括的光學(xué)元件為L3、L4、D1、F2、A2、PMT。

3 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計指標(biāo)

CLS光學(xué)系統(tǒng)的照明光源是方向性、單色性很好的激光，采用平行入射的方式進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)，因此在光學(xué)設(shè)計時只需校正軸上點，即0視場的球差。

物鏡的數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力，是物鏡的重要性質(zhì)之一，增強(qiáng)物鏡的聚光能力可提高物鏡的分辨率。數(shù)值孔徑NA的計算公式如下:

其中，n為物鏡與觀察對象之間介質(zhì)的折射率，如空氣的折射率為1;θ為物鏡的孔徑半角。

數(shù)值孔徑NA是顯微鏡物鏡最主要的光學(xué)特性，它決定了物鏡的衍射分辨率δ［5］，其計算公式為:

具體的設(shè)計指標(biāo)要求如下:

1)視場角w=0°，只校正軸上點球差。

2)工作于近紅外波段，其中照明激光光源的波長為780 nm，發(fā)射熒光的波長為820 nm。

3)采用點光源照明。

4)照明針孔直徑50μm，探測針孔直徑100μm，兩種針孔的厚度都為0.2 mm。

5)光學(xué)分辨率小于2μm，由公式(2)計算可知需要數(shù)值孔徑NA＞0.24。

4 具體光學(xué)設(shè)計過程

4.1 物鏡(L3)光學(xué)設(shè)計

選擇焦距為3.76 mm的復(fù)消色差顯微物鏡［6］作為初始結(jié)構(gòu)，設(shè)置入瞳直徑為14 mm，角度視場為0視場，工作波長為780 nm。由于本物鏡只校正軸上點球差，因此通過設(shè)置優(yōu)化函數(shù)進(jìn)行球差校正，從而得到所需的物鏡結(jié)構(gòu)。優(yōu)化函數(shù)的具體設(shè)置如下:

1)設(shè)置優(yōu)化函數(shù)為“RMS(均方根)+Spot Radius(像點尺寸)+Centroid(質(zhì)心點)”。

2)設(shè)置玻璃厚度邊界條件為“Min=1，Max=4”。

3)設(shè)置空氣間隔邊界條件為“Min=1，Max=6”。

4)增加LONA和SPHA優(yōu)化操作數(shù)，設(shè)置“Target=0，Weight=1”。

5)將所有面r值和d值都設(shè)計為變量。

6)將第一面的玻璃材料設(shè)置為變量(選擇Slove Type類型為Substitute)。

采用“Optimization”進(jìn)行自動優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進(jìn)一步錘形優(yōu)化［7］。優(yōu)化后的物鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示，其三維圖、像差曲線、點列圖分別如圖2、圖3、圖4所示。圖中可見，設(shè)計的物鏡像差很小，焦點彌散斑的直徑小于0.4μm，數(shù)值孔徑較大為0.42，滿足本CLS光學(xué)系統(tǒng)對數(shù)值孔徑的要求。同時，物鏡的結(jié)構(gòu)也較為緊湊，總長為31.5 mm。

優(yōu)化后的物鏡的MTF曲線如圖5所示，由于分辨率δ=2μm，可見其在N=1/δ=500 lp/mm時的MTF＞0.3［8］，因此該物鏡具有極高的光學(xué)傳送效率。

表1 優(yōu)化后的物鏡結(jié)構(gòu)Tab.1 Object lens structure after optimization

圖2 物鏡的三維圖與渲染圖Fig.2 3D layout and shaded model of object lens

圖3 物鏡的像差曲線Fig.3 Ray fan of object lens

圖4 物鏡的點列圖Fig.4 Spot digrams of object lens

圖5 物鏡的MTF曲線Fig.5 MTF of object lens

4.2 點光源光路(F1、A1)設(shè)計

CLS光學(xué)系統(tǒng)采用點光源作為照明光源，具有光源方向性好、發(fā)散小、高度的空間和時間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨(dú)特的優(yōu)點，且與探測針孔及焦平面形成共聚焦裝置。由于本系統(tǒng)采用帶擴(kuò)束準(zhǔn)直鏡且輸出圓形激光光斑的直徑為14 mm的光纖激光器作為光源，因此需要將其轉(zhuǎn)換為點光源。為了簡化光路和校正像差，選擇類似于雙膠合透鏡結(jié)構(gòu)的凹凸雙透鏡［9］來設(shè)計點光源光路。優(yōu)化后的點光源光路結(jié)構(gòu)參數(shù)如表2所示，三維圖如圖6所示，其中假設(shè)鍍膜窄帶濾光片的玻璃材料為BK7，厚度為1 mm。該點光源傳輸光路的焦距為39.6 mm，像方F#為1/2.8，像方數(shù)值孔徑NA為0.17。

表2 點光源光路的初始結(jié)構(gòu)Tab.2 Inital structure of point light source

圖6 點光源光路的三維圖與渲染圖Fig.6 3D layout and shaded model of point light source

優(yōu)化后的點光源光路的像差曲線、點列圖、離焦點列圖分別如圖7、圖8、圖9所示，可見該光路的像差很小，焦點彌散斑的直徑小于0.2μm，很好的模擬了光斑很小的點光源。另外，其在100μm處的離焦彌散斑的直徑小于40μm，因此可以容易地通過厚度為0.2 mm、直徑為50μm的照明針孔，滿足照明針孔空間濾波的要求。

圖7 點光源光路的像差曲線Fig.7 Ray fan of point light source

圖8 點光源光路的點列圖Fig.8 Spot digrams of point light source

圖9 點光源光路的離焦點列圖Fig.9 Thogh focus spot digrams of point light source

4.3 照明光路(L2、D1、L3)設(shè)計

為了簡化光路，同樣選擇與點光源光路中相同的凹凸雙透鏡設(shè)計準(zhǔn)直透鏡組L2，并與二向色鏡D1的反光面、物鏡L3一起，構(gòu)成照明光路，其結(jié)構(gòu)參數(shù)如表3所示，三維圖如圖10所示。

設(shè)置準(zhǔn)直透鏡組L2的物方數(shù)值孔徑與點光源光路像方數(shù)值孔徑一致，為0.17，工作波長同樣設(shè)置為780 nm，采用ZEMAX軟件對照明光路進(jìn)行仿真和分析，得到像差曲線、點列圖、能量包圍曲線分別如圖11、圖12、圖13所示。仿真可見，該照明光路的像差很小，焦點彌散斑的直徑小于1μm，且焦點彌散斑的能量在2μm范圍內(nèi)超過了83%，因此焦點光斑的能量集中度很高。

優(yōu)化后的照明光路的MTF曲線如圖14所示，可見其在500 lp/mm時的MTF＞0.4，因此該照明光路具有極高的光學(xué)傳輸效率。

圖10 照明光路的三維圖與渲染圖Fig.10 3D layout and shaded model of lighting structure

表3 點光源光路的初始結(jié)構(gòu)Tab.3 Initial structure of lighting structure

圖11 照明光路的像差曲線Fig.11 Ray fan of lighting structure

圖12 照明光路的點列圖Fig.12 Spot digrams of lighting structure

圖13 照明光路的能量包圍曲線Fig.13 Encircled energy of lighting structure

圖14 照明光路的MTF曲線Fig.14 MTF of lighting structure

4.4 發(fā)射光路(L3、L4、D1、F2)設(shè)計

為了校正像差，選擇類似于柯克物鏡［10］的結(jié)構(gòu)設(shè)計發(fā)射光聚焦透鏡組L4，并添加二向色鏡的折射面，選擇二向色鏡D1和發(fā)射光濾光片F(xiàn)2的玻璃材質(zhì)為BK7，得到其發(fā)射光路的初始結(jié)構(gòu)。

設(shè)置物方數(shù)值孔徑為0.42，與物鏡的數(shù)值孔徑一致，工作波長為820 nm，選擇二向色鏡和窄帶濾光片的玻璃材料為BK7，采用ZEMAX軟件對照明光路進(jìn)行仿真和分析，可見其焦點彌散斑直徑較大，MTF曲線的截止頻率低于500 lp/mm。為了進(jìn)一步校正該發(fā)射光路的像差，提高其截止頻率，設(shè)置優(yōu)化函數(shù)如下:

1)設(shè)置優(yōu)化函數(shù)為“RMS(均方根)+Spot Radius(像點尺寸)+Centroid(質(zhì)心點)”。

2)設(shè)置玻璃厚度邊界條件為“Min=1，Max=6”。

3)設(shè)置空氣間隔邊界條件為“Min=1，Max=10”。

4)增加LONA和SPHA優(yōu)化操作數(shù)，設(shè)置“Target=0，Weight=1”。

5)增加MTFS和MTFT優(yōu)化操作數(shù)，設(shè)置“Samp=2，Wave=0，F(xiàn)ield=1，F(xiàn)req=500，Target=0.3，Weight=2”。

6)將發(fā)射光聚焦透鏡組L4的所有面r值和d值都設(shè)計為變量，將其所有面的玻璃材料都設(shè)置為變量(選擇Slove Type類型為Substitute)。

采用“Optimization”進(jìn)行自動優(yōu)化，然后選擇“Hammer Optimization”進(jìn)一步錘形優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)射光路結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4所示。

表4 優(yōu)化后的發(fā)射光路結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.4 Parameters of emission structure after optimization

優(yōu)化后的發(fā)射光路的三維圖、像差曲線、點列圖、離焦點列圖分別如圖15、圖16、圖17、圖18所示。圖中可見，設(shè)計的發(fā)射光路像差很小，焦點彌散斑的直徑小于4μm。另外，其在100μm處的離焦彌散斑的直徑小于100μm，因此能夠通過厚度為0.2 mm、直徑為100μm的探測針孔，滿足探測針孔離焦濾波的要求。

圖15 發(fā)射光路的三維圖和渲染圖Fig.15 3D layout and shaded model of emission structure

圖16 發(fā)射光路的像差曲線Fig.16 Ray fan of emission structure

圖17 發(fā)射光路的點列圖Fig.17 Spot digrams of emission structure

圖18 發(fā)射光路的離焦點列圖Fig.18 Throgh focus spot digrams of emission structure

優(yōu)化后的照明光路的MTF曲線如圖19所示，可見其在500 lp/mm時的MTF≈0.3，因此該發(fā)射光路同樣具有極高的光學(xué)傳輸效率。

圖19 照明光路的MTF曲線Fig.19 MTF of emission structure

5 結(jié)論

設(shè)計了一種采用激光共聚焦技術(shù)的近紅外熒光的掃描系統(tǒng)，采用復(fù)消色差顯微物鏡作為初始結(jié)構(gòu)設(shè)計了物鏡，采用凹凸雙透鏡結(jié)構(gòu)設(shè)計了點光源光路和照明光路，采用柯克物鏡作為初始結(jié)構(gòu)設(shè)計了發(fā)射光路。其中，物鏡的數(shù)值孔徑為0.42;點光源光路的焦點彌散斑小于0.2μm，將圓形光斑激光很好地轉(zhuǎn)換成了點光源，其離焦彌散斑的直徑小于40μm，滿足照明針孔的尺寸要求;照明光路的焦點彌散斑小于1μm，且焦點彌散斑的能量在2μm范圍內(nèi)超過了83%，因此焦點光斑的能量集中度很高;發(fā)射光路的離焦彌散斑的直徑小于100μm，滿足照明針孔的尺寸要求;同時照明光路和發(fā)射光路都具有較高的光學(xué)傳輸效率。因此，該光學(xué)系統(tǒng)具有數(shù)值孔徑較大、工作于近紅外光譜區(qū)、分辨率高的優(yōu)點，可滿足生物芯片、基因芯片等對激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)的需求。

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