雷 娜,王 米,張賽奇,楊銳樂,薛飛群

(中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,中國農業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室,農業(yè)部動物寄生蟲學病重點實驗室,上海200241)

磷酸化酵母葡聚糖抗氧化及免疫增強活性研究

雷 娜,王 米*,張賽奇,楊銳樂,薛飛群*

(中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,中國農業(yè)科學院獸藥安全評價與獸藥殘留研究重點開放實驗室,農業(yè)部動物寄生蟲學病重點實驗室,上海200241)

采用磷酸化修飾方法對酵母葡聚糖進行結構修飾。通過對1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、超氧化物

磷酸化修飾;酵母葡聚糖;抗氧化活性;免疫活性

近些年來,多糖由于其免疫增強、抗氧化等功能而備受關注,成為研究熱點。多糖,又稱多聚糖,它是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵相連形成的復雜的聚合物。多糖的復雜的分子結構、單糖組成,主鏈的糖苷鍵、分支的類型及聚合程度等決定了其具有各種生物活性。因此,對多糖分子結構進行修飾會對其生物活性產生影響[1]。常見的分子修飾方法有硫酸化、乙?；?、羧甲基化、磷酸化、磺?；萚2]。Li等[3]通過對修飾前后多糖抗氧化和抗菌作用比較后發(fā)現修飾后的多糖抗氧化活性明顯增強,抑菌圈明顯增大。Wang等[4]發(fā)現,硫酸化后的酵母葡聚糖在體外實驗中能夠顯著增強淋巴細胞的增殖,體內表明能夠顯著提高血清抗體滴度、血清白介素-2(IL-2)和γ-干擾素(IFN-)的濃度。磷酸化多糖是一種重要的多糖衍生物。許多研究表明,磷酸化多糖表現出來良好的抗氧化、抗菌、抗病毒作用[5]。為了研究磷酸化修飾對酵母葡聚糖生物活性的影響,本實驗將酵母葡聚糖進行磷酸化修飾,研究其抗氧化活性和免疫增強活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 酵母葡聚糖購自蘭州科進公司。三聚磷酸鈉(STPP)、三偏磷酸鈉(STMP)、1,1-二苯基-2-苦肼基 (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、抗壞血酸、焦性沒食子酸(pyrogallic acid)、考馬斯亮藍G250、硫酸亞鐵、噻唑藍(MTT)均購自Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、Hank,s購自Gibco公司;200目細胞篩網、0.22 μm針頭濾器(美國Milipore公司生產;二甲基亞砜(DMSO)購自江蘇宜興化學工程公司,所有化學試劑均為分析純。96孔細胞培養(yǎng)板購自Corning公司。

1.2 實驗儀器 全自動高壓滅菌鍋(ALP公司)、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Haraneus公司)、ESCO生物安全柜(Esco科技有限公司)、Nikon Eclipse E200顯微鏡(Nikon公司)、酶標儀Multiskan Mk3(Thermo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 磷酸化反應[6]將三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉混合配成磷酸化試劑,溶解后,加入酵母葡聚糖,加入少量5%的Na2SO4,調pH值,反應一段時間,加入3倍體積的95%的乙醇沉淀24 h,將多糖沉淀真空干燥,再進行復溶,將溶液進行透析,濃縮,真空干燥后得到磷酸化酵母葡聚糖(pGSC)。

1.3.2 DPPH自由基清除率測定[7]精密稱取7.9 mg的DPPH,溶于95%的乙醇中,定容至200 mL的棕色容量瓶中,配成濃度為0.025 mg的DPPH溶液,避光保存。精密稱取200 mg的抗壞血酸,溶于去離子水,定容至100 mL,配成2 mg/mL的溶液,然后依次稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.1、0.05、0.025 mg/mL。稱取樣品50 mg溶于10 mL的去離子水,配成5 mg/mL的樣品溶液,然后依次稀釋為4、3、2、1 mg/mL的樣品溶液。在5 mL的離心管中,分別加入1.5 mL的樣品溶液和1.5 mL的DPPH溶液,混勻后,在25℃,黑暗中反應30 min,在517 nm波長處測定吸光度值,記為Ai。

DPPH自由基清除率公式:清除率=[Ac-(Ai-Aj)]× 100%,Ac:混合溶液中用去離子水代替樣品溶液的吸光度值;Aj:混合溶液中用95%的乙醇代替DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 超氧化物自由基清除率測定[8]先將Tris-HCL(50 mmol/L,pH=8.2)和去離子水在25℃的水浴鍋中預熱20 min,在15 mL的離心管中分別加入1 mL的不同濃度的樣品溶液(5、4、3、2、1 mg/mL),4.5 mL的Tris-HCl,4.2 mL的去離子水,和0.4 mL的焦性沒食子酸(50 mmol/L),快速混勻后,在25℃、黑暗中反應5 min。加入8 mmol/L的HCL終止反應,在325 nm的波長處測定吸光度值,記為A1。

超氧化物自由基清除率計算公式:清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%,A0:混合溶液中用去離子水代替樣品溶液的吸光度值;A2:混合溶液中用Tris-HCL代替焦性沒食子酸的吸光度值。

1.3.4 經自由基清除率測[9]在25 mL的容量瓶中分別加入1.5 mL的考馬斯亮藍G250(0.055 g/L),2.0 mL的硫酸(0.1 mol/L),的1.0mL鐵標準溶液(1.20 g/L), 0.6 mL的過氧化氫溶液(0.12%),3 mL不同濃度的樣品溶液(5、4、3、2、1 mg/mL)。用去離子水將容量瓶稀釋至刻度,在40℃水浴中加熱15 min后,用流水冷卻3 min。在582 nm波長處測定吸光度值。記為A1。

經自由基清除率計算公式:清除率=(A1-A2)/ (A3-A2)×100%,A2:混合液中不加樣品溶液的吸光度值;A3:混合溶液中不加樣品、鐵標準溶液和過氧化氫溶液的吸光度值。

1.3.5 淋巴細胞體外增殖實驗 將磷酸化的多糖配成4 mg/mL,然后依次倍比稀釋5個濃度,分別記為pGSC1(4 mg/mL)、pGSC2(2 mg/mL)、pGSC3(1 mg/mL)、pGSC4(0.5 mg/mL)、pGSC5(0.25 mg/mL)。取4周齡的KM小鼠,脫臼處死后,在75%的乙醇中浸泡15 min,解剖取其脾臟,在Hanks中清洗后,搗碎分離淋巴細胞,混懸液2 000 r/min離心5 min,加Hanks清洗離心,去除其中的紅細胞,分離出淋巴細胞,向細胞中加入完全1640培養(yǎng)液,進行細胞計數。調整細胞濃度為每毫升5×106個細胞。96孔板每個孔加入100 μL的細胞液,100 μL的pGSC多糖溶液,細胞對照組加100 μL完全1640溶液。將96孔板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)72 h,第68小時,每孔加20 μL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后,2 000 r/min離心5 min,吸取去掉100 μL的上清,再加入100 μL的DMSO,在酶標儀上測其在570 nm波長處的吸光度值作為淋巴細胞增殖的指標。采用SPASS15.0軟件對數據進行分析,利用t檢驗和單因素方差分析對數據進行處理,組間數據多重比較采用Duncan′s法。數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 pGSC對DPPH自由基的清除作用 由圖1可知,pGSC對DPPH自由基清除作用低于抗壞血酸,但在1～5 mg/mL的濃度范圍內,pGSC對DPPH自由基的清除效果明顯,且隨著濃度的增加而逐漸增強。當pGSC濃度為1 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率為32.81%;當pGSC濃度為5 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率為58.99%。其量效分析方程為Y=7.505X+20.383,R2=0.8904,具有一定的量效關系。

圖1 pGSC對DPPH自由基清除作

2.2 pGSC對超氧化物陰離子的清除作用 由圖2可知,在1～5 mg/mL的濃度范圍內,pGSC對超氧化物陰離子具有一定的清除作用,隨著其濃度增加清除率越高。當pGSC為1 mg/mL時,pGSC對超氧化物陰離子的清除率為50%;當pGSC為5 mg/mL時,清除率為76.25%,其量效關系方程為Y=6.891X+38.482,R2= 0.8653,具有一定的量效關系。

2.3 pGSC對經自由基的清除作用 由圖3可知,雖然pGSC對經自由基的清除活性低于抗壞血酸,但在一定范圍內,其對經自由基具有較好的清除作用。當其濃度為1 mg/mL時,清除率為33.93%;而濃度為5 mg/mL時,其對經自由基的清除率為62.3%,清除率隨著pGSC濃度的增加而逐漸升高。其量效關系方程為Y=7.64X+26.064,R2=0.9537,具有較好的量效關系。

圖2 pGSC對超氧化物陰離子的清除作用

圖3 pGSC對羥自由基的清除作用

2.4 不同濃度的pGSC對淋巴細胞的增殖作用 由表1可知,與對照組相比,試驗組對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖差異并不顯著(P＞0.05);但在0.5～4 mg/mL的濃度范圍內,隨著pGSC濃度的增加,淋巴細胞的A570逐漸降低,表明高濃度的多糖會抑制淋巴細胞的增殖。與對照組相比,pGSC濃度為0.5 mg/mL組的A570提高4.76%,表明此濃度可刺激小鼠脾臟淋巴細胞增值,提高其細胞免疫。

表1 不同濃度的pGSC對淋巴細胞增殖的影響(A570)

3 討 論

3.1 磷酸化修飾對酵母葡聚糖抗氧化活性的影響 多糖能夠與機體內的多種自由基結合,使自由基減少,達到抗氧化的作用。在機體的新陳代謝的過程中會持續(xù)不斷的產生自由基,這些自由基包括過氧化氫、超氧化物陰離子和經自由基等,這些自由基會對細胞結構造成重大傷害,使脂質過氧化或DNA加合物的形成,從而誘發(fā)惡性腫瘤[10]、冠心病以及其他與年齡有關的健康問題[11]。盡管,正常機體具有自身的抗氧化的機制,但由于自由基的產生不斷增加,自身清除自由基的能力有限,因此,需要找到一種抗氧化的輔助物,降低自由基對機體造成的傷害[3]。

DPPH是廣泛用于評價抗氧劑清除自由基,發(fā)揮抗氧化能力的的物質,它是一種穩(wěn)定的有機氮自由基,其分子中的氮原子能夠接受電子或氫原子,形成穩(wěn)定的分子[11],在酒精溶液中,DPPH在517 nm處有紫外吸收峰,根據這個原理,評估多糖的抗氧化能力。超氧化物陰離子是在酶系統(tǒng)的自氧化反應中產生的,在所有自由基中,超氧化物陰離子是最早形成的,也促進其他自由基的形成,因此,對超氧化物陰離子的清除能力是反映抗氧化性的重要指標[12]。經自由基在生物細胞中是通過Fenton反應產生的,它也是活性氧的代表之一,能夠很容易的與大多數的生物大分子發(fā)生反應。Fenton反應已經廣泛用于評價經自由基清除活性能力[13]。許多研究表明分子修飾后的多糖具有很好的對DPPH、超氧化物陰離子和經自由基清除效果[14-15],從杏鮑菇里提取的多糖經過硫酸化修飾后,與未修飾的多糖相比,對DPPH、超氧化物陰離子和經自由基清除顯著提高,修飾后的杏鮑菇多糖在1 mg/mL時對DPPH、超氧化物陰離子和經自由基清除率分別為14.55%、35.10%和23.44%,而在本試驗中pGSC5(1 mg/mL)對DPPH、超氧化物陰離子和經自由基清除率分別為32.81%、50%和33.93%,均高于硫酸化后的杏鮑菇多糖[3]。另外在本試驗中,pGSC5對經自由基的清除率為33.93%,從綠藻中提取的多糖磷酸化后對經自由基的清除率明顯升高,在1 mg/mL的濃度時,磷酸化的多糖(PEP)對經自由基的清除率為30%[5],與本試驗結果相近,但本試驗中的pGSC的經自由基清除率隨濃度增加幅度低于PEP。在本試驗中分別以DPPH、超氧化物陰離子、經自由基的清除率作為評價指標,評價pGSC的抗氧化能力,其中對DPPH自由基、超氧化物陰離子和經自由基的清除率最高分別達58.99%、76.25%和62.3%,呈現出了較好的抗氧化能力。

3.2 磷酸化修飾對酵母葡聚糖免疫活性的影響 多糖作為一種大分子的生物活性物質,其研究始于20世紀70年代,隨著對多糖不斷的深入研究,越來越多的生物活性被發(fā)現,許多研究表明,多糖具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用,這些活性都與多糖的抗氧化和免疫增強活性有關,已有研究證實,在多糖的抗腫瘤作用中,多糖分子并不是直接攻擊腫瘤細胞使其致死,而是通過激活機體不同的免疫反應而產生抗腫瘤的作用[16]。在本試驗中,與對照組相比,pGSC實驗組對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖作用并不顯著,但在4～0.5 mg/mL的濃度范圍內有隨著濃度的增加,增殖率逐漸增加的趨勢,說明,pGSC對淋巴細胞的增殖具有一定的作用,這與Lai等[17]的靈芝多糖的實驗結果一致,在體內實驗中靈芝多糖能顯著提高脾臟T、B細胞數,而Bao等[18]的靈芝葡聚糖的體外實驗中發(fā)現該葡聚糖在體外也能促進T、B淋巴細胞的增殖。許多研究還從其他方面來探求多糖分子的免疫調節(jié)活性,Chang等[19]通過對蝦飼喂白參葡聚糖發(fā)現,與對照組相比,葡聚糖飼喂組的蝦的存活率顯著升高,血細胞吞噬活性增強從而證明葡聚糖的免疫刺激作用,且刺激峰是在飼喂后的24 d出現。Guo等[1]將復合多糖與新城疫和禽流感疫苗聯(lián)合使用,發(fā)現復合多糖實驗組在100 mg/kg的劑量時能提高新城疫和禽流感的抗體滴度和淋巴細胞增殖,可以作為安全有效的免疫刺激替代品。Cheng等[20]對甘草多糖的免疫調節(jié)活性研究中發(fā)現,甘草多糖能顯著提高胞飲作用、一氧化氮(NO)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6和IL-12的產生,表明甘草多糖可能通過調節(jié)巨噬細胞免疫功能發(fā)揮有益的治療作用。

本實驗是通過體外實驗測定磷酸化修飾后的酵母葡聚糖的抗氧化能力和免疫增強活性,探求磷酸化修飾對其活性的影響。在體外實驗中,磷酸化修飾后的酵母葡聚糖表現出較好的抗氧化活性和一定的免疫增強活性,但由于體外實驗影響因素較為單一,并不能完全模擬機體體內復雜的內環(huán)境,因此,需要進一步研究,探究修飾后的葡聚糖在機體內的生物活性。

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Study on the Antioxidation and Immune Activity of Phosphory Lation Glucan From Saccharomyces Cerevisiae

LEI Na,WANG Mi*,ZHANG Sai-qi,YANG Rui-le,XUE Fei-qun*
(Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture,Key Open Laboratory of Veterinary Drug Safety Evaluation and Residues Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Veterinary Research Institute,Shanghai 200241,China)

Glucan was modificated by phosphorylate method.To evaluate the antioxidant and immune enhancement activities of pGSC,the scavenging activity of DPPH、superoxide anion radical、hydroxyl radical and the proliferation of mouse spleen lymphocytes were investigated.The results showed that with the increase of the concentration of pGSC, the scavenging activities of DPPH,superoxide anion radical and hydroxyl radical were increased.At the concentration of 5 mg/mL,the scavenging activities of three kinds of free radicals were 58.99%,76.25%and 62.3%,respectively. These results suggested that pGSC had good scavenging effect on the three kinds of free radicals.At the concentration of 0.5～4 mg/mL,the A570 values of mouse spleen lymphocytes of all pGSC groups were not significantly higher than that of control group,but at the concentration of 0.5 mg/mL,the A570 values of pGSC group was 4.76%higher than that of control group.The results indicate that pGSC should have good antioxidant activity and immune enhancement activity.

phosphorylated modification;yeast glucan;antioxidation activity;immunity activity

S865.5

:A

:0258-7033(2015)13-0061-05

2014-10-20;

2015-03-18

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303040-08);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項(2010JB14);863計劃課題(2011AA2114);國家自然科學基金(31272607)

雷娜(1990-),女,碩士,研究方向為中獸藥,Email: aoleina@126.com

*通訊作者:王米,Email:wangmi@shvri.ac.cn;薛飛群,feiqun@gmail.com

陰離子、羥自由基的清除試驗,測定磷酸化酵母葡聚糖(pGSC)的抗氧化活性;通過對小鼠脾臟淋巴細胞的增殖作用評價其細胞免疫增強活性。結果表明:pGSC對DPPH、超氧化物陰離子、羥自由基的清除率均隨著pGSC的濃度的增加而增加,在濃度為5 mg/mL時,對3種自由基的清除率分別為58.99%、76.25%、62.3%。表明pGSC對3種自由基均有較好的清除作用,表現出了較好的抗氧化活性。在0.5～4 mg/mL的濃度范圍內,與對照組相比,小鼠脾臟淋巴細胞的增殖(A570)差異不顯著(P＞0.05);但pGSC濃度為0.5 mg/mL時,其A570比對照組可提高4.76%,表明pGSC具有一定的免疫增強活性。