聚酰胺法富集人參根總黃酮工藝研究

張 儒，張變玲，謝 濤，李谷才，胡建昌，易 拓，蔡金紅

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

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聚酰胺法富集人參根總黃酮工藝研究

張 儒，張變玲，謝 濤，李谷才，胡建昌，易 拓，蔡金紅

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

以總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂對(duì)人參根總黃酮靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附與解吸附特性的研究，優(yōu)化聚酰胺樹(shù)脂對(duì)人參根總黃酮的富集工藝；并對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證，得到純度高的人參根總黃酮.結(jié)果表明人參根總黃酮富集工藝為：室溫、人參根總黃酮粗提物上樣濃度為6 mg/mL、pH為10.0、洗脫液濃度80%乙醇、洗脫液流速1.5 mL/min，在該條件下富集3次，人參根總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)可由粗品的1.96%提高到48.38%.此法可較好的富集人參根總黃酮.

人參根總黃酮；聚酰胺樹(shù)脂；富集

0 前 言

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬名貴藥用植物，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神之功效.據(jù)報(bào)道，人參中含皂苷、多糖、黃酮、揮發(fā)油、生物堿、氨基酸等多種化學(xué)成分[1-2].近年來(lái)，對(duì)人參藥用成分的研究主要集中在人參皂苷和人參多糖的藥理活性方面[3].但作為人參重要成分之一的黃酮類化合物的研究卻很少.

聚酰胺樹(shù)脂是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，它主要通過(guò)氫鍵和范德華力對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行吸附，已利用聚酰胺樹(shù)脂從多種中藥材中富集得到黃酮類化合物[4-6].

本研究組前期已經(jīng)證實(shí)人參根黃酮類化合物具有很好的抗氧化活性[7].然而人參根黃酮類化合物含量很低，為了進(jìn)一步提高人參根總黃酮粗提物中黃酮的純度，利用聚酰胺樹(shù)脂富集人參根中總黃酮，并對(duì)其富集工藝加以優(yōu)化，期望探索出人參根總黃酮的高效富集工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4年生人參根采自吉林撫松，經(jīng)湖南省藥品檢驗(yàn)所趙勇主管藥師鑒定為人參(P. ginseng C.A. Meyer)；蘆丁，中國(guó)藥品生物制品檢定所；聚酰胺樹(shù)脂(30～60目、60～80目)、乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

WND-200型高速中藥粉粹機(jī)(浙江偉能達(dá)電器有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)篩(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)；BS323S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；NH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠)；UV-2102PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司).

1.2 聚酰胺樹(shù)脂預(yù)處理

稱取一定量的30～60目和60～80目?jī)煞N聚酰胺樹(shù)脂，用蒸餾水充分淋洗，95%乙醇浸泡24 h，過(guò)濾后用蒸餾水洗至樹(shù)脂無(wú)醇味，再用4% NaOH溶液浸泡24 h，濾掉上層堿液，再以蒸餾水洗至中性，然后用4 mol/L鹽酸浸泡24 h，再用蒸餾水洗至中性，備用.

1.3 人參根黃酮提取液的制備及含量測(cè)定

取新鮮人參根60 ℃烘干至水分含量低于0.5 %，粉碎后過(guò)20目篩.稱取200.0 g，加入5 L 75%乙醇，65 ℃恒溫水浴鍋中提取2 h，收集濾液，濾渣重復(fù)上述操作3次，合并濾液；回收乙醇至干，分別用少量水溶解，并用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液并濃縮至干后，得到12.27 g人參黃酮粗提物干粉，再加水定容至500 mL(2.5 mL/g生藥)，即人參黃酮粗提物.

[8]方法，精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品18.2 mg，加30%乙醇溶解，置100 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，混勻.即得0.182 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL比色管中，分別加入30%乙醇10 mL，5%亞硝酸鈉0.7 mL，混勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁0.7 mL，6 min后加入10%氫氧化鈉5 mL， 30%乙醇定容至10 mL，混勻后靜置20 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值.以A值為縱坐標(biāo)(y)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.018x+0.0497(r=0.999).結(jié)果表明：對(duì)照品在7.28～43.68 μg/mL之間具有良好的線性關(guān)系.以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定人參根提取物中總黃酮的含量.

1.4 聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸附

取預(yù)處理好的不同目數(shù)的聚酰胺樹(shù)脂各0.5 g，置于50 mL三角燒瓶中.加入4 mL濃度為0.48 mg/mL的總黃酮粗提物樣品溶液，室溫下震蕩24 h后，過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮的濃度.計(jì)算聚酰胺樹(shù)脂的吸附量和吸附率.吸附量=(初始質(zhì)量濃度-剩余質(zhì)量濃度)×溶液體積/樹(shù)脂質(zhì)量；吸附率(%)=[(初始質(zhì)量濃度-剩余質(zhì)量濃度)×溶液體積]/吸附樣液中總黃酮含量×100%.

經(jīng)靜態(tài)飽和吸附后的樹(shù)脂，濾出，吸干表面水分，轉(zhuǎn)入三角燒瓶，再精密加入60%的乙醇20 mL，用震蕩器震蕩24 h后，過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮的濃度.計(jì)算解吸率.解吸率(%)=(解吸液濃度×解吸液體積)/吸附量×100%.

1.5 聚酰胺樹(shù)脂富集人參根黃酮的工藝

1.5.1 聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附條件優(yōu)化

精密稱取15份活化的60～80目聚酰胺樹(shù)脂各0.5 g，分別置具塞三角瓶中，加入0.48 mg/mL人參根總黃酮粗提物溶液4 mL，分別在不同溫度和pH條件下，180 r/min振蕩12 h后收集3 mL上清液，取上清液1.0 mL(每組3個(gè)重復(fù))，過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮的濃度.計(jì)算吸附量和吸附率.

1.5.2 聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

取預(yù)處理好的60～80目聚酰胺樹(shù)脂，濕法裝入內(nèi)徑為1.0 cm的色譜柱中，徑高比為1∶10；室溫下采用恒流泵，分析pH值為10.0、上樣液濃度(2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL)和上樣液流速(1～2.5 mL/min)對(duì)人參根黃酮吸附的影響，采用部分收集器收集流出液，每隔一定的時(shí)間(2 min)對(duì)流出液采用黃酮類化合物特異性顯色反應(yīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)進(jìn)行一次飽和檢驗(yàn)，如有飽和反應(yīng)則停止吸附.計(jì)算吸附量及吸附率.

1.5.3 聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸附條件優(yōu)化

考慮到所洗脫樣品的安全性，試驗(yàn)用乙醇作為解吸劑，稱取0.5 g預(yù)處理好的60～80目聚酰胺樹(shù)脂，濕法裝入內(nèi)徑為1.0 cm的色譜柱中，徑高比為1∶10；室溫下采用恒流泵，對(duì)濃度為6.0 mg/mL人參根總黃酮粗提物溶液進(jìn)行上柱吸附，流速為1.5 mL/min，飽和吸附后，再分別用不同濃度的乙醇水溶液(20%～100%)和不同流速(1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min)進(jìn)行洗脫.計(jì)算解吸附率.

1.5.4 聚酰胺樹(shù)脂精制級(jí)數(shù)的優(yōu)化

按優(yōu)化的富集工藝，取預(yù)處理好的60～80目聚酰胺樹(shù)脂，濕法裝入內(nèi)徑為1.0 cm的色譜柱中使柱高為10 cm，室溫下采用恒流泵，對(duì)人參根總黃酮粗提液濃度為6.0 mg/mL、pH10的人參根黃酮提取物進(jìn)行上柱吸附，吸附流速為1.5 mL/min，飽和后，用80%乙醇以1.5 mL/min的速度進(jìn)行3次洗脫，繪制洗脫曲線并計(jì)算不同洗脫級(jí)別下人參根黃酮的純度.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚酰胺樹(shù)脂型號(hào)的選擇

經(jīng)分光光度法測(cè)定，粗提物中人參根總黃酮濃度為0.48 mg/mL.由于不同聚酰胺樹(shù)脂對(duì)黃酮吸附能力的強(qiáng)弱不同，解吸難易程度也不同.因此，篩選出吸附率和解吸率都高的樹(shù)脂，才能保證有效成分被最大限度地回收.以提取的人參黃酮粗提物為原料，采用不同目數(shù)的聚酰胺樹(shù)脂進(jìn)行分離.表1表明兩種樹(shù)脂的吸附和解吸能力差別較大，60～80目樹(shù)脂比30～60目的樹(shù)脂比表面積大，故其吸比附量較大，吸附率可達(dá)到83.85%.同時(shí)，60～80目聚酰胺樹(shù)脂的解吸附能力也較高，因此本實(shí)驗(yàn)選用60～80目的聚酰胺樹(shù)脂.

表1 不同目數(shù)聚酰胺吸附與解吸附結(jié)果(n=3)

2.2 不同溫度及pH下靜態(tài)吸附與解吸附特性

表2為不同溫度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能的影響結(jié)果，溫度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂的靜態(tài)吸附性能有一定影響，但不同溫度下的溶液的吸附率差別不大，所以采用室溫作為聚酰胺樹(shù)脂吸附時(shí)的環(huán)境溫度.

表2 溫度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能的影響(n=3)

表3 為不同pH條件下，聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附結(jié)果.從表3可以看出，隨著pH值的增加，吸附率先逐漸增加，但當(dāng)pH值達(dá)到11.0時(shí)，吸附率開(kāi)始降低.黃酮類化合物含有酚羥基，多呈酸性，故在堿性環(huán)境中溶解性較高，利于聚酰胺樹(shù)脂的吸附，但是堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)容易破壞黃酮化合物的母核，所以選擇介質(zhì)的pH值在10.0條件下吸附人參根黃酮.

表3 pH值對(duì)聚酰胺樹(shù)脂靜態(tài)吸附性能的影響

2.3 聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸附特性

2.3.1 上樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

表4 液濃度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響

黃酮粗提物中富含多種糖類等雜質(zhì)，其溶液的濃度是影響聚酰胺樹(shù)脂吸附性能的重要因素之一.聚酰胺樹(shù)脂對(duì)黃酮的吸附容量一般以較低質(zhì)量濃度進(jìn)行較為有利.如果黃酮粗提物質(zhì)量濃度過(guò)高，其它雜質(zhì)影響樹(shù)脂的吸附量，使樹(shù)脂的處理量變小，樹(shù)脂使用周期也將縮短；黃酮粗提物質(zhì)量濃度過(guò)低，吸附效率降低.表4為不同上樣液濃度樹(shù)脂對(duì)人參根黃酮吸附結(jié)果，人參根總黃酮粗提物溶液的質(zhì)量濃度為2.0、4.0、6.0 mg/mL時(shí)，吸附量較適宜，還觀察到，人參根總黃酮粗提物溶液的質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL時(shí)，吸附過(guò)程的穩(wěn)定性好，且吸附時(shí)間也較適宜.因此，選擇質(zhì)量濃度為6.0 mg/mL人參根總黃酮粗提物溶液作為料液.

2.3.2 上樣液流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響

見(jiàn)表5為體積流量在1～2.5 mL/min時(shí)吸附量和吸附率結(jié)果，吸附量隨體積流量的增大而下降，體積流量過(guò)大，樹(shù)脂的吸附量下降，提早泄露，并且試驗(yàn)中可觀察到人參根黃酮粗提物在樹(shù)脂上的分布未呈明顯的梯度變化，即吸附過(guò)程的穩(wěn)定性差；體積流量過(guò)小，樹(shù)脂的吸附量過(guò)大，吸附時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低.考慮工作效率和吸附效果，選擇吸附體積流量1.5 mL/min較適當(dāng).

表5 流量對(duì)聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響

2.3.3 乙醇濃度對(duì)解吸率及黃酮純度的影響

考慮到所洗脫樣品的安全性，試驗(yàn)用乙醇作為解吸劑，分別用50 mL 20%、40%、60%、80%、100%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果如表6，從表中可知，隨著乙醇濃度增大，解吸率逐漸增大，但是樣品純度卻是先增加后減小，80%乙醇洗脫時(shí)純度最大，綜合考慮，選擇80%乙醇作為洗脫劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表6 洗脫劑濃度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)解吸的影響

2.3.4 解吸液流速對(duì)解吸率的影響

表7為優(yōu)化條件下，人參根黃酮經(jīng)飽和吸附后，用80%乙醇水溶液以流速分別為1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min進(jìn)行洗脫的結(jié)果.從表7中可知，隨著洗脫劑流速增大，解吸率逐漸減小，但是解吸劑流速過(guò)小，解吸時(shí)間又會(huì)增加，所以綜合考慮，選擇解吸附流速為1.5 mL/min.

表7 洗脫劑流速對(duì)聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附性能的影響

2.4 精制級(jí)數(shù)對(duì)人參根黃酮收率及純度的影響

圖1為優(yōu)化的工藝條件下人參黃酮洗脫曲線.圖1顯示，60～80目聚酰胺樹(shù)脂在優(yōu)化的條件下，解吸時(shí)間都較短，約12 min達(dá)到峰值，60 min內(nèi)基本解吸完全.因此，優(yōu)化的工藝能高效率的富集人參根總黃酮.為了提高聚酰胺樹(shù)脂的利用率和濃縮效果，人參根總黃酮洗脫液濃縮后再進(jìn)行3次聚酰胺純化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表8，結(jié)果表明經(jīng)聚酰胺樹(shù)脂3次富集后，人參根總黃酮粗提液中黃酮含量從1.96%提高到48.38%.

圖1 80%乙醇溶液動(dòng)態(tài)洗脫曲線

精致級(jí)數(shù)黃酮純度(%)粗品1.96一級(jí)32.06二級(jí)39.97三級(jí)48.38

3 結(jié) 論

采用聚酰胺樹(shù)脂富集人參根總黃酮的最佳工藝

為：人參根總黃酮粗提液上樣濃度為6 mg/mL，上柱流速為1.5 mL/min，而后用水洗至無(wú)色，再以80%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min.經(jīng)3次上柱吸附純化后，人參根黃酮化合物的純度可從粗品的1.96%提高到達(dá)到48.38%.結(jié)果表明，聚酰胺樹(shù)脂富集純化人參根總黃酮方法可行.該研究為人參的綜合利用提供理論依據(jù).

參 考 文 獻(xiàn)

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Study on Enriching Flavonoids from Roots of Panax Ginseng with Polyamide Resin

ZHANG Ru, ZHANG Bian-ling, XIE Tao, LI Gu-cai, HU Jian-chang, YI Tuo, CAI Jin-hong

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China)

To investigate the enrichment technology of flavonoids with polyamide resin from the roots of Panax ginseng, the optimal enrichment technique is confirmed by studying the static and dynamic absorption and desorption of flavonoids from the roots of P. ginseng with polyamide resin under various conditions. The optimized technique is verified and the high purification flavonoids are produced. The results show that the optimum experimental conditions are as follows: loading concentration of flavonoids is 6.0 mg/mL, pH10.0 and the most effective desorption is obtained with 80% of alcohol as eluent with a flowing rate of 1.5 mL/min. The maximum content of the enrichment flavonoid reaches to 48.38% whichis higher than 1.96% in the crude extraction solution. In conclusion, the process is feasible to enrich flavonoids from the roots of P. ginseng with polyamide resin.

roots of Panax ginseng C. A. Meyer; total flavonoids; polyamide resin; enrichment

2014-10-27

湖南省教育廳科研資助項(xiàng)目(11C0329)；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201411342004)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(湘教通[2014]248號(hào)).

張 儒(1979-)，男，博士，講師，研究方向：天然活性成分生物合成調(diào)控與開(kāi)發(fā)利用.

張變玲(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：天然活性成分開(kāi)發(fā)與利用.

R284.2

A

1671-119X(2015)01-0058-04