張世永嚴(yán)玉霖王文梅呂忠芬

(1.會澤縣寶云街道畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200;2.云南省農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650201; 3.會澤縣娜姑鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200; 4.會澤縣畜牧局技術(shù)服務(wù)中心,云南曲靖654200)

會澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌的分離與鑒定及耐藥性實(shí)驗(yàn)

張世永1嚴(yán)玉霖2王文梅3呂忠芬4

(1.會澤縣寶云街道畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200;2.云南省農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650201; 3.會澤縣娜姑鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200; 4.會澤縣畜牧局技術(shù)服務(wù)中心,云南曲靖654200)

分析會澤當(dāng)?shù)刈胸i大腸桿菌對抗菌藥物的敏感度,為臨床中大腸桿菌病的防治提供理論依據(jù);了解會澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌是否存在及其流行情況;為深入研究仔豬大腸桿菌的耐藥機(jī)制及其致病機(jī)制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。會澤縣關(guān)于仔豬大腸桿菌病流行情況,目前未見有相關(guān)報道,本研究的開展能為會澤縣動物性大腸桿菌病的研究提供相關(guān)資料。

大腸桿菌;致病性;血清型;耐藥性;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

1 會澤縣仔豬黃白痢流行情況

目前，會澤縣境內(nèi)21個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）大部分規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶均不同程度存在仔豬黃白痢的流行，但規(guī)模化豬場由于對豬只的飼養(yǎng)管理更加合理化，致使其發(fā)病率相對較低。經(jīng)本人調(diào)查，使用仔豬黃白痢相關(guān)疫苗進(jìn)行免疫的豬場，仔豬黃白痢的發(fā)生幾率較低，同時即便有少量豬只發(fā)病使用常規(guī)的抗生素類藥品均能有較好療效；不使用疫苗的豬場一旦發(fā)病，在使用抗生素時往往療效較差或需要使用大量藥物才能控制疫病的發(fā)展。

在疫苗使用方面大部分規(guī)?；B(yǎng)殖場均選用三價基因工程苗；在藥物選擇方面則主要包括口服類（氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、鹽酸洛氟沙星及某些中藥或中成藥等）、注射類（磺胺芐甲氧嘧啶）及外用類（氯氟平）。

2 采樣方法

依據(jù)仔豬黃白痢的臨床特征，選擇10日齡內(nèi)表現(xiàn)精神沉郁，腹瀉，排出淡黃色、乳白色或灰綠色糊狀糞便的仔豬，以窩為單位采集糞便，編號后作為試驗(yàn)原料。

3 試驗(yàn)方法

3.1 會澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌的分離

采集會澤縣部分規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶疑似仔豬黃白痢糞便，從單份糞便中挑取約0.5g樣品用10ml滅菌生理鹽水稀釋后，離心機(jī)內(nèi)離心取上清液約0.5g，以滅菌棉簽捈布于麥康凱培養(yǎng)基，置溫箱內(nèi)培養(yǎng)37℃24h后；挑選單個粉紅菌落再次分別接種于麥康凱培養(yǎng)基及伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，置溫箱內(nèi)培養(yǎng)37℃24h后，觀察記錄并保存結(jié)果。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將上述分離培養(yǎng)所得菌株，以革蘭氏染色法染色后，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

3.3 生化鑒定

將經(jīng)純化培養(yǎng)后菌種接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、尿素、硫化氫、明膠、蔗糖、v-p及蛋白胨微量試劑管中，置37℃24h后，觀察并記錄結(jié)果；

3.4 菌株的保存

將所需保存菌株的肉湯培養(yǎng)物取適量置于密閉試管內(nèi)，加入終濃度為30%的甘油生理鹽水，置-20℃冰箱保存，保存半年后重新轉(zhuǎn)種。

4 結(jié)果

由相關(guān)結(jié)果得出，大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈微紅色菌落，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。

由相關(guān)結(jié)果得出，大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落。

本次試驗(yàn)共采集到疑似仔豬黃白痢糞便40份，分離培養(yǎng)得到疑似大腸桿菌（在麥康凱瓊脂平板上呈微紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈黑色帶金屬光澤菌落）共35份。

5 討論

5.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在2012年7月至2013年5月期間，從會澤縣內(nèi)8個豬場共采集到特征性仔豬黃白痢糞便樣本40份，仔豬品種包括蘇太、洋三元、PIC、約長撒、杜約共5個品種，利用麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，共分離到疑似大腸桿菌菌株35份，這說明從具備仔豬大腸桿菌病典型臨床表現(xiàn)的病仔豬糞便中能分離培養(yǎng)到的菌種可能有很多種，臨床上如需確認(rèn)仔豬病原類型，必須采樣后送相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

5.2 形態(tài)學(xué)及生化鑒定

此次所分離的40份菌株，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后的35份菌株，生化鑒定與形態(tài)鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致，分離率為87.5%。

5.3 具有較強(qiáng)的致病性

4株產(chǎn)ESBLS菌株，對小白鼠的致病率均為100%，但在相同濃度條件下，同菌株不同個體小白鼠的死亡時間不同，不同菌株不同個體小白鼠的死亡時間也不同。并且由于4份菌株中有1株無血清型鑒定結(jié)果作為參考依據(jù)，故實(shí)際的致病性大腸桿菌的感染率可能更高。

國內(nèi)外近幾年的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)能致病的大腸桿菌血清型越來越多，在防治本病的過程中應(yīng)充分考慮疫苗及藥品的選擇，以達(dá)到最好的免疫及治療效果。

5.4 對常用藥物具有廣泛耐受性

此次分離培養(yǎng)的菌株對除頭孢噻肟（耐藥率17.5%）、頭孢他啶（耐藥率2.5%）及多粘菌素（耐藥率2.5%）外的其他強(qiáng)力霉素等7種常用藥物（耐藥率均＞50%）有廣泛的耐受性，其中氨芐西林和阿莫西林的耐藥率甚至＞80%，這可能和本地區(qū)臨床過多使用這兩類藥物有關(guān)。此外此次測定的40份菌株中，單一菌株對抗生素耐受性表現(xiàn)為最少的耐受2種藥品，最多的耐受7種藥品，并且耐受藥物的種類有的相同有的不同，這可能和本豬場使用藥品的種類及菌株自身血清型有關(guān)。

抗菌藥不僅能預(yù)防和治療動物疾病，有些甚至還能起到很好的促生長作用，這使得養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展離不開抗菌藥物。因此，長期使用抗菌素和濫用抗生素是藥物殘留及細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的源頭，兩者相互依賴而存在，使細(xì)菌耐藥性的危害越來越嚴(yán)重。

因此建議，應(yīng)每年定期對菌株進(jìn)行抗生素敏感性監(jiān)測，在選擇藥物時不能僅僅依靠經(jīng)驗(yàn)，而應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇最有效的藥物控制大腸桿菌病。在臨床上應(yīng)停用已普遍產(chǎn)生耐藥性或已明顯無效的藥物，選用目前應(yīng)用較少、經(jīng)藥敏試驗(yàn)證明對大腸桿菌敏感的藥物。

6 結(jié)論

（1）會澤縣存在仔豬黃白痢耐藥性大腸桿菌，其中少數(shù)耐藥性菌株甚至能產(chǎn)生ESBLS。

（2）產(chǎn)ESBLS菌株SHV和CTX-M基因檢測呈陽性。

（3）產(chǎn)ESBLS菌株具有較強(qiáng)的致病性。

（4）從本實(shí)驗(yàn)可看出，目前楚雄州存在的致病性大腸桿菌除對頭孢噻肟、頭孢他啶及多粘菌素外的其他7種?？股丶矗簭?qiáng)力霉素（四環(huán)素類）、慶大霉素（氨基糖苷類）、阿莫西林（青霉素類）、環(huán)丙沙星（喹諾酮類）、氧氟沙星（喹諾酮類）、氨芐西林（青霉素類）、青霉素G（青霉素類）均表現(xiàn)不同程度耐藥性。

[1]顧欣，金凌艷，蔡金華，等.國家動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測工作的探討和建議[J].中國獸藥雜志，2009，（7）：45-50.

[2]張秀英，蘆秀梅.大腸桿菌對獸醫(yī)臨床抗菌藥物耐藥性情況分析[J].中國獸藥雜志，2003，37（3）：33-50.