動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達及血漿IL-1β、IL-18水平變化

周洪琴1，郭晶1，陳鵬2，李蕊1，趙珍1

(1新泰市第二人民醫(yī)院，山東新泰271200；2泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀察動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)mRNA的表達情況，及患者血漿IL-1β、IL-18水平變化。方法動脈粥樣硬化患者45例(病例組)，健康查體者42例(對照組)，采集兩組外周靜脈血，淋巴細胞分離液分離單核細胞，real-time PCR法檢測單核細胞中的NLRP3 mRNA。采用ELISA法檢測兩組血漿中的IL-1β、IL-18。分析NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關(guān)性。結(jié)果對照組單核細胞中NLRP3 mRNA表達為1，病例組NLRP3 mRNA表達量為對照組的(1.76±0.35)倍，兩組相比，P<0.05。對照組血漿IL-1β、IL-18水平分別為(12.35±3.89)、(25.14±5.67)pg/mL，病例組分別為(17.56±4.66)、(32.81±7.08)pg/mL，兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較，P均<0.05。病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達與血漿IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.48、0.53，P均<0.05)。結(jié)論動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達上調(diào)，血漿IL-1β、IL-18水平升高；NLRP3可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞：動脈粥樣硬化；單核細胞；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3；白細胞介素1β；白細胞介素18

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.017

中圖分類號：R541.4 文獻標(biāo)志碼：B

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81202979)。

收稿日期：(2015-08-15)

局部及全身炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。炎性小體是細胞內(nèi)一類大分子蛋白質(zhì)復(fù)合體[2，3]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)炎性小體可促進IL-1β、IL-18等細胞因子的剪切和活化，引起機體炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性小體在心血管疾病中的作用是當(dāng)前的研究熱點[4,5]。本研究觀察了動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA的表達情況及血漿IL-1β、IL-18的水平變化，進一步探討NLRP3炎性小體與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料2013年12月~2014年12月泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和新泰市第二人民醫(yī)院收治的穩(wěn)定型心絞痛患者45例(病例組)，男25例、女20例，年齡(57.6±7.1)歲，均經(jīng)超聲檢查確診，并且近48 h內(nèi)有心絞痛發(fā)作至少1次，但無心肌壞死的心肌酶譜改變，同時伴有心電圖ST段壓低或T波改變。選擇健康體檢者42例(對照組)，其中男23例、女19例，年齡(55.2±5.3)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2單核細胞中NLRP3 mRNA檢測取兩組外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝。用淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞。按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，用分光光度計測定RNA濃度。取總RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎胷eal-time PCR法檢測NLRP3 mRNA。NLRP3上游引物序列為5′-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3′，下游引物序列為5′-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3′，產(chǎn)物長度220 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-CTTCTCTGATGAGGCCCAAG-3′，下游引物序列為5′-G-CAGCAAACTGGAAAGGAAG-3′，產(chǎn)物長度222 bp。PCR總反應(yīng)體系包含SYBR Green Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 1 μL，加雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品均作3個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線，以2-ΔΔCt進行數(shù)據(jù)分析。

1.3血漿IL-1β、IL-18檢測采用ELISA法檢測兩組血漿IL-1β、IL-18，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析對NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關(guān)性進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組單核細胞中NLRP3 mRNA表達比較設(shè)對照組單核細胞中NLRP3 mRNA表達為1，病例組NLRP3 mRNA表達量為對照組的(1.76±0.35)倍，兩組相比，P<0.05。

2.2兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較對照組血漿IL-1β、IL-18水平分別為(12.35±3.89)、(25.14±5.67)pg/mL，病例組分別為(17.56±4.66)、(32.81±7.08)pg/mL，兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較，P均<0.05。

2.3NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關(guān)性病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達與血漿IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.48、0.53，P均<0.05)。

3討論

NLRP3炎性小體由NLRP3、含C-末端Caspase募集域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和Caspase-1相互結(jié)合而成。一般情況下NLRP3處于自身抑制狀態(tài)，其C端亮氨酸重復(fù)序列(LRR)結(jié)構(gòu)域與分子伴侶熱休克蛋白90結(jié)合，抑制NLRP3活性[6,7]。當(dāng)配體與NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，使得熱休克蛋白90釋放，NLRP3通過核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)發(fā)生自身寡聚化，使熱蛋白結(jié)構(gòu)域與ASC相互作用，并通過ASC的胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域招募并激活Caspase-1，Caspase-1活化后可使IL-1β、IL-18前體變?yōu)榛钚孕问剑置诘郊毎鈴亩l(fā)揮免疫作用[8~11]。

炎癥反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。血脂異常被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)病的始動因素[12~14]。近期研究顯示，膽固醇被內(nèi)皮細胞及巨噬細胞吞噬攝取后會形成微小膽固醇結(jié)晶，膽固醇晶體可激活NLRP3炎性小體，促進IL-1β、IL-18分泌，促動脈粥樣硬化形成[15,16]。

為闡明NLRP3炎性小體是否參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，我們檢測了動脈粥樣硬化患者及健康人群外周血單核細胞中的NLRP3 mRNA及血漿IL-1β、IL-18。我們發(fā)現(xiàn)，病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達升高，血漿IL-1β、IL-18水平也明顯升高；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，病例組NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平均呈正相關(guān)關(guān)系。上述研究結(jié)果提示NLRP3炎性小體及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、IL-18都可能參與了動脈粥樣硬化的進展。這與Satoh等[11]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達升高，NLRP3/IL-1β、IL-18通路在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。NLRP3炎性小體的具體調(diào)控機制及NLRP3炎性小體與其他炎癥因子的相互作用將成為下一步研究的重點。

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