“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型的制作及其胃腸組織中c-kit mRNA的表達變化

王文革，次苗苗，張俊紅，劉興，孟小雨

(中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，北京100142)

“瀉劑結(jié)腸”指長期使用刺激性瀉劑造成腸道正常蠕動和排便功能紊亂，最終形成對瀉劑的依賴性，無瀉劑不排便，是慢傳輸型便秘(STC)的一種類型，其發(fā)病機制尚不清楚，臨床缺乏有效治療方法。Cajal間質(zhì)細胞(ICC)作為引起胃腸平滑肌自動節(jié)律性運動的起搏細胞，在胃腸道運動紊亂性疾病的研究中多有涉及［1］?！盀a劑結(jié)腸”患者不僅表現(xiàn)為結(jié)腸動力降低、糞便干硬、排便時間延長，還常伴有早飽、胃排空障礙、惡心、嘔吐、腹脹等上消化道癥狀，因此有必要研究ICC在全胃腸道中的表達情況。2013年2～6月，我們采用大黃酸粉懸液灌胃建立“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型，并觀察了其胃竇、小腸、結(jié)腸組織中ICC的特異性標志物酪氨酸激酶生長因子受體(c-kit)mRNA［2］的表達變化，探討“瀉劑結(jié)腸”的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康清潔級雄性Wistar大鼠20只，3～4周齡，體質(zhì)量50～80 g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供［許可證號SCXK (京)2011-0004］，在室溫18～23℃、相對濕度50%～70%的清潔安靜環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。將20只大鼠隨機分為實驗組與對照組，各10只。

1.2 “瀉劑結(jié)腸”大鼠模型的制作 實驗組給予大黃酸粉懸液灌胃制備“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型［3，4］。造模過程分3個循環(huán)，約115 d完成。第1個循環(huán)(約35 d)給藥劑量為240 mg/(kg·d)，灌2 d停1 d，約半數(shù)大鼠出現(xiàn)稀便，維持此劑量直至80%的大鼠稀便消失開始下一循環(huán);第2個循環(huán)(約35 d)給藥劑量同上，灌5 d停2 d，直至80%的大鼠稀便消失;第3個循環(huán)(約45 d)給藥劑量為320 mg/(kg·d)，灌5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失，造模完成。對照組給予10 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃。依據(jù)Bristol大便性狀分型［5］，每日10:00觀察大鼠糞便性狀。實驗組大鼠停止大黃酸粉懸液灌胃7 d后，禁食、不禁水24 h，經(jīng)口灌入100 g/L活性炭懸液2 mL，40 min后頸椎脫臼法處死。對照組于同一時間處死大鼠。立即剖腹，結(jié)扎幽門和直腸末端，分離腸系膜，無張力情況下測量腸道全長及活性炭末推進長度?；钚蕴磕┩七M率(%)=(炭末前端與幽門的距離/腸道全長)×100%。

1.3 胃竇、小腸、結(jié)腸組織中c-kit mRNA的檢測采用real-time PCR法。留取兩組大鼠胃竇部胃壁全層及十二指腸遠端、結(jié)腸組織，放入凍存管保存于－80℃冰箱。采用TRIzol-A+Reagent試劑提取總RNA，合成cDNA。c-kit mRNA上游引物序列為5'-CTGATCCCCTGAAAAGGCCAACA-3'，下游引物序列為5'-ACAGAATGGTCCACCACCACG-3';內(nèi)參β-actin上游引物序列為 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物序列為 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。PCR反應條件:95℃預變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)，每個樣品重復測3次。記錄每個樣品的Ct值，以2－△△Ct進行相對量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件。計量資料以s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

實驗組大鼠大便性狀較對照組明顯變硬。實驗組腸道全長、活性炭末推進長度、活性炭末推進率分別為(135.66±4.33)cm、(53.23±6.63)cm、39.24%±4.28%，對照組分別為(133.07±6.27) cm、(82.35±6.58)cm、61.84%±3.05%，兩組活性炭末推進率相比，P＜0.05。實驗組成功制作了“瀉劑結(jié)腸”模型。

實驗組大鼠胃竇、小腸、結(jié)腸組織中c-kit mRNA相對表達量分別為0.61±0.08、0.37±0.02、0.32 ±0.03，對照組分別為0.67±0.03、0.90±0.05、1.01±0.09，兩組小腸及結(jié)腸組織中c-kit mRNA相對表達量相比，P均＜0.05。

3 討論

“瀉劑結(jié)腸”是STC的一種主要類型，涉及全胃腸道動力紊亂，尤其以結(jié)腸傳輸減慢為主［6，7］。瀉劑的長期使用使腸神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及功能失調(diào)，導致結(jié)腸動力受損［8］，同時患者對瀉劑的反應性下降，便秘癥狀逐漸加重，由腹瀉最終形成瀉劑依賴性便秘。大黃、番瀉葉等刺激性瀉劑可誘導“瀉劑結(jié)腸”形成。大黃酸是從大黃中提取的單體物質(zhì)，本研究實驗組采用大黃酸造模，避免了大黃在制備“瀉劑結(jié)腸”模型過程中存在稀便情況不穩(wěn)定、使用劑量不統(tǒng)一等問題［4］。我們發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠大便性狀干硬，活性炭末推進率明顯降低，腸道傳輸時間明顯延長，表明“瀉劑結(jié)腸”大鼠模型制備成功。

近幾年ICC在胃腸道運動紊亂性疾病中的作用成為國內(nèi)外研究的熱點。ICC作為一類特殊的間質(zhì)細胞，廣泛分布于整個胃腸道。ICC不僅是胃腸道運動的起搏細胞，可通過產(chǎn)生慢波，促進胃腸道收縮，加速胃腸道運動;同時ICC還可調(diào)節(jié)或介導腸神經(jīng)信號向平滑肌細胞傳遞，參加電流的傳導。ICC的數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)及功能異常被認為是STC發(fā)病的關鍵因素［9，10］。c-kit是一種原癌基因，編碼Ⅲ型酪氨酸蛋白激酶生長因子受體，通過與干細胞因子(SCF)結(jié)合使信號途徑激活，在ICC發(fā)育、存活、增殖、分化及遷移等方面發(fā)揮重要作用［11，12］。研究［13］表明，敲除大鼠小腸c-kit基因后，ICC將不能產(chǎn)生慢波，胃腸運動功能發(fā)生紊亂，其可作為ICC的特異性標志物。Adachi等［14］發(fā)現(xiàn)c-kit mRNA表達下調(diào)可導致STC患者乙狀結(jié)腸ICC數(shù)量減少，為STC的重要發(fā)病機制?；裘鳀|等［15］推測，長期應用刺激性瀉劑可使c-kit mRNA在結(jié)腸中的表達下調(diào)，進而使ICC網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破環(huán)，最終導致“瀉劑結(jié)腸”的形成。

“瀉劑結(jié)腸”患者常有不同程度的上腹部飽脹不適、早飽、反酸、噯氣、胃排空障礙等上消化道癥狀，甚至有些患者在切除部分結(jié)腸后仍可伴有上述癥狀，我們推測“瀉劑結(jié)腸”可能涉及全胃腸道運動功能失調(diào)，而不單局限于結(jié)腸。因此，我們對兩組大鼠全胃腸道中c-kit mRNA的表達情況進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組小腸及結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達降低，提示c-kit mRNA的低表達與“瀉劑結(jié)腸”的形成有關，但小腸組織c-kit mRNA表達降低為原發(fā)性還是繼發(fā)于結(jié)腸功能障礙需要深入研究。胃節(jié)律性運動的起搏點位于胃竇，且ICC在胃竇的分布多于胃底，因此我們留取胃竇組織進行實驗。研究結(jié)果顯示，實驗組胃竇組織中c-kit mRNA的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義，推測可能由于胃的正常功能受腸神經(jīng)系統(tǒng)、ICC、平滑肌共同調(diào)節(jié)，ICC的功能并不能全面反映胃功能，“瀉劑結(jié)腸”患者上消化道癥狀可能與ICC異常表達無明確相關性，具體原因尚需進一步探索。

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