田 郎 譯，張 霖 校

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海南 儋州571737；2.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封475004）

1 引言

全球氣候及降水的變化強(qiáng)烈地影響著森林的分布和生存（Allen等，1998；Engelbrecht等，2007；Shaw等，2005）。雖然林木屬于固著生物，但它們也具有很多生物學(xué)特征特性使其能夠在一定程度上抵御或適應(yīng)環(huán)境有效水分的不足或變化（Chaves等，2003；Ingram 等，2003）。然而，全球氣候變化的速度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的預(yù)期，并且未來可能伴有更長、更嚴(yán)重的干旱周期（聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(huì)，2007）。這對(duì)于森林健康無疑會(huì)產(chǎn)生極其深遠(yuǎn)的影響，因?yàn)樗窒拗剖菍?dǎo)致全球森林衰退的主要因素之一（Bigler，2006；van Mantgem 等，2009；Allen 等，2010）。例如，加拿大西部的山楊林在2001－2002的生長季節(jié)遭受了一次嚴(yán)重的地區(qū)性干旱之后，植株的生長及存活均受到非常嚴(yán)重的影響（Hogg等，2008）。同樣，在歐洲也有因干旱導(dǎo)致森林生產(chǎn)力下降的報(bào)道（Ciais等，2005）。

干旱是一個(gè)能使林木從分子到林分水平對(duì)刺激信號(hào)作出應(yīng)答反應(yīng)的多維環(huán)境因子。從林分及單木水平上對(duì)干旱響應(yīng)作出解釋是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，因?yàn)檫@既涉及到干旱對(duì)林木產(chǎn)生的脅迫效應(yīng)，也涉及到林木對(duì)于干旱刺激的應(yīng)答反應(yīng)（Yordanov等，2000）。人們在很多方面都已觀察到了干旱對(duì)森林健康的負(fù)面影響，其中包括：幼苗更新，生產(chǎn)力，對(duì)病蟲害的敏感性，以及火災(zāi)敏感性 等 （Hogg等，2005；van Mantgem 等，2009；Zhao等，2010）。因此，人們一直在不斷地探索和了解林木對(duì)干旱的響應(yīng)機(jī)制，并努力尋找應(yīng)對(duì)這一特殊環(huán)境威脅的策略和方法，以有效地保護(hù)林木的生長和生存。

鑒于目前基因組生物學(xué)領(lǐng)域所取得的進(jìn)展，人們已有更大的空間全面而深入地研究林木對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。事實(shí)上，在過去的幾十年里，隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及生物信息學(xué)等學(xué)科的逐步發(fā)展，人們對(duì)于林木干旱響應(yīng)模式的了解已越來越深入。本文綜述該領(lǐng)域的研究成果，并探討如何將其應(yīng)用于未來森林健康的保護(hù)。當(dāng)然，讀者若希望更廣泛地了解林木非生物脅迫應(yīng)答的基因組學(xué)分析，或者是想了解林木如何通過特異基因的修飾獲得耐旱性則可直接參閱Polle等人（2006）及Fischer等（2010）的精彩評(píng)述。

2 林木對(duì)干旱的反應(yīng)

有效水分的減少通過土壤－水分連續(xù)系統(tǒng)影響植株的生長及水分蒸發(fā)。通常，作為對(duì)植株水勢下降的響應(yīng)，為了減少干旱脅迫下水分的損失，林木植物通過關(guān)閉氣孔口以減少水分蒸發(fā)，盡管這是以植株CO2同化受損為代價(jià)（Cowan，1977；Jarvis等，1963）。此外，水分脅迫還可導(dǎo)致木質(zhì)部張力增大，在此情形下植株體內(nèi)的水流可因空穴化或木質(zhì)部栓塞而進(jìn)一步被中斷?？昭ɑ?，或者木質(zhì)部栓塞就是木質(zhì)部充滿大量空氣或水蒸汽而非水分，這無疑會(huì)導(dǎo)致植株水分輸導(dǎo)能力的下降，而植株導(dǎo)水性能的降低反過來又會(huì)限制植株的正常生長（Tyree等，1994；Rice等，2004）。

林木能夠采用眾多策略應(yīng)對(duì)干旱。在水分虧缺的條件下，樹木會(huì)發(fā)生一系列分子、生理、生化及形態(tài)變化對(duì)其作出反應(yīng)，而且反應(yīng)的程度高度可變和復(fù)雜［參見Chaves等（2003）及Ingram等（2003）的綜述］。樹木的干旱反應(yīng)隨干旱脅迫的嚴(yán)重度及持續(xù)時(shí)間而變化（Chaves等，2003），而這種變化又與個(gè)體、群體及物種水平上的遺傳變異疊加在一起（Hamanishi等，2010；Wilkins等，2009b；Zhang等，2004）。林業(yè)工作者很久以前就已知道不同樹種對(duì)干旱具有不同的反應(yīng)。大約50年前，有人曾就不同物種苗木對(duì)干旱的耐受性進(jìn)行過研究，其結(jié)果顯示，南方松（Pinus spp.）是最耐旱的物種，而美洲山楊（Populus tremuloides）最不耐旱（Jarvis等，1963）。

干旱反應(yīng)的差異不但存在于不同的林木物種之間，同一物種內(nèi)也如此。例如，將來自不同地理區(qū)域的花旗松（Pseudotsuga menziesii）實(shí)生苗同時(shí)置于溫室缺水條件下，它們會(huì)表現(xiàn)出不同的耐旱性（Ferrell等，1996）。同樣，Teskey等（1987）在火炬松（Pinus taeda）的后裔及種源試驗(yàn)中也觀察到了對(duì)于水分有效性的不同反應(yīng)。早期這些針對(duì)耐旱性的遺傳研究主要著眼于基因型與環(huán)境之間的關(guān)系并充分證實(shí)了林木種間及種內(nèi)遺傳變異在耐旱性上所起的重要作用。與此相比，人們對(duì)于林木耐旱和抗旱機(jī)制及其分子基礎(chǔ)的了解則相對(duì)少得多。

林木自身具備一系列廣泛的特征特性賦予其耐旱性。樹木免遭干旱脅迫的能力取決于其最大限度減少水分損失及最大限度吸收水分的能力（Chaves等，2003）。例如，有些林木可借助更廣更深的根系增加水分吸收（Nguyen，1989）。而為了在干旱條件下將水分損失減少到最低限度，林木可廣泛利用一系列對(duì)此有利的性狀，這些性狀表現(xiàn)為葉片形態(tài)的改變［如表皮臘質(zhì)化（Hadley，1990）］，葉面 積 減 少 ［如 增 加 落葉 （Munné－Bosch，2004）］，以及氣孔導(dǎo)度降低等。氣孔控制在調(diào)節(jié)植株體內(nèi)的水分平衡上起著十分重要的作用，也相應(yīng)地對(duì)CO2同化起著調(diào)節(jié)作用。盡管氣孔關(guān)閉是通過限制水分損失應(yīng)對(duì)水份短缺的一種有效機(jī)制，但僅靠這并不能阻止體內(nèi)水分的進(jìn)一步丟失。因此，林木在干旱脅迫下的生長和存活通常依賴于上述各種策略的共同作用。雖然人們對(duì)于林木干旱生理反應(yīng)的認(rèn)識(shí)已取得長足進(jìn)展，但相對(duì)于草本的一年生植物而言，迄今對(duì)林木干旱分子響應(yīng)的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入。

3 林木對(duì)水分狀況的感受及下游信號(hào)通路

植物能夠通過某些方式感知水分虧缺條件并隨后誘導(dǎo)下游分子信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)［參見Shinozaki等（2007）的綜述］。為了啟動(dòng)對(duì)干旱的任何響應(yīng)，植株必須首先感受水分虧缺條件。盡管植物中引起干旱感知的分子機(jī)制尚不十分清楚，但人們?nèi)蕴岢隽硕鄠€(gè)有關(guān)根部如何感受土壤干旱的假說。在土壤水分下降的情況下，植物激素脫落酸（ABA）會(huì)在土壤溶液中積累。土壤ABA濃度的增加很可能作為一種機(jī)制使根系得以感知土壤水分的下降（Slovik等，1995；Hartung等，1996）。植物還有可能借助滲透感受器通過膨壓下降感受干旱。Urao等（1999）鑒定了一個(gè)擬南芥跨膜組氨酸激酶（At HK1），并推定其具有滲透感受器的功能。At HK1感受滲透壓改變并傳遞脅迫信號(hào)到下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)級(jí)聯(lián)，隨后引發(fā)干旱響應(yīng)基因的表達(dá) （Urao 等，1999）。 在 赤 桉 （Eucalyptus camaldulensis）中，Liu等（2001）鑒定了2個(gè)高親和性鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HKT1）同系物，它們都能感知溶質(zhì)濃度的變化，其作用類似于At HK1。桉樹HKT1同系物能改變非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母細(xì)胞的鉀和鈉運(yùn)輸，這表明它們具有感受及調(diào)節(jié)滲透壓的作用。這些同系物也是林木中相關(guān)蛋白質(zhì)強(qiáng)有力的候選蛋白，在林木感受水分脅迫并引發(fā)干旱響應(yīng)信號(hào)傳遞的過程中可能起著關(guān)鍵作用。

在水分虧缺感受的下游，植物借助以下兩條信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一啟動(dòng)對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答：依賴于ABA和不依賴ABA的途徑（Shinozaki等，1996）。據(jù)報(bào)道，在干旱條件下，根部和莖芽端的ABA水平會(huì)逐漸增加，因此，ABA被認(rèn)為在根到芽端的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用（Davies等，1991；Walton等，1976；Zeevaart，1988）。ABA信號(hào)還可受木質(zhì)部或質(zhì)外體p H的影響而發(fā)生改變。由于木質(zhì)部或質(zhì)外體p H的變化可改變植株對(duì)ABA的敏感性及體內(nèi)ABA的有效性，進(jìn)而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程（Wilkinson等，1998；Bahrun等，2002；Sobeih等，2004）。ABA不僅在干旱脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，而且也是調(diào)控植物干旱應(yīng)答的關(guān)鍵因子。

ABA最突出的作用之一是調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)以應(yīng)對(duì)干旱脅迫［見Belin等（2010），Wilkinson等（2002），以及 Popko等（2010）的綜述］。通過氣孔開度的調(diào)節(jié)可以有效地限制植株在干旱條件下的水分損失并保持其在脅迫期間的水分平衡。植物中由ABA介導(dǎo)的另一個(gè)重要干旱反應(yīng)是保持根系在輕度或中度干旱脅迫下的生長，而葉片在干旱條件下的生長則受到抑制（Hsiao等，2000）。在干旱條件下，植物的生長分配模式會(huì)發(fā)生改變，而且根及莖芽生長速率的變化與ABA水平相關(guān)；不過，生長速率的調(diào)節(jié)可能受到植物中的另一種激素，即乙烯的影響（Sharp等，2004）。

盡管人們對(duì)ABA在引發(fā)植物干旱響應(yīng)中的作用已有所了解，但直到最近人們對(duì)于植物細(xì)胞對(duì)ABA信號(hào)的感受機(jī)制依然知之甚少。就初步鑒定出的一些ABA受體而言，由于它們在ABA信號(hào)感受及應(yīng)答中發(fā)揮中心作用的相關(guān)證據(jù)有限，故尚存較大爭議。然而值得注意的是，就在前不久，Park等（2009）采用化學(xué)篩選技術(shù)成功鑒定出了一種參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)，即pyrabactin resistant 1（PYR1）。PYR1及PYR1相似受體為很多植物響應(yīng)ABA所必須。受體蛋白 PYRABACTIN RESISTANT／PYRABACTIN RESISTANT－LIKE（PYR／PRL）家族的成員可在下游與蛋白磷酸酶2C（PP2C）中的HAB1蛋白發(fā)生相互作用。PP2Cs對(duì)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)調(diào)節(jié)作用（Saez等，2004）。借助蛋白質(zhì)組學(xué)方法，人們同時(shí)還鑒定出了另一組ABA受體，即RACR1，它們同屬PYR／PRL受體家族（Ma等，2009）。該家族的受體蛋白在不同農(nóng)作物之間顯示出高度的保守性，目前人們也在致力于尋找并了解樹木物種中的該家族成員［參見Klingler等（2010）的綜述］。據(jù)Saavedra等（2010）報(bào)道，他們從山毛櫸樹（Fagus sylvatica）中鑒定出了一種PP2C同系物。該同系物是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一種負(fù)調(diào)節(jié)蛋白。此外，該FsPP2C蛋白還可與擬南芥PYR7和PYR8發(fā)生相互作用。林木ABA受體蛋白同系物的鑒定對(duì)于了解其ABA信號(hào)的感受及應(yīng)答具有十分重要的意義。

4 干旱信號(hào)途徑中的誘導(dǎo)產(chǎn)物

整個(gè)植株對(duì)ABA的反應(yīng)有賴于ABA所引發(fā)的一系列基因表達(dá)的改變，而這些基因的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。這類轉(zhuǎn)錄因子可與相關(guān)應(yīng)答基因中的ABA反應(yīng)元件（ABREs）相結(jié)合進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，ABREs在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中作為順式作用元件而起作用［參見Ingram等（2003）的綜述］。ABRE通常都發(fā)現(xiàn)于干旱響應(yīng)基因的上游調(diào)節(jié)區(qū) （Giuliano等，1988；Bray，1994）。此外，人們在干旱誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)還鑒定出了一些包括G－box序列在內(nèi)的ABRE相似序列（Williams等，1992；Shen等，1996）。還有報(bào)道指出，堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）蛋白質(zhì)家族的成員也可結(jié)合到ABRE及ABRE相似序列上，從而激活A(yù)BA依賴基因的表達(dá)（Guiltinan等，1990；Choi等，2000；Uno等，2000）。

在已被明確鑒定的干旱誘導(dǎo)基因中，脫水響應(yīng)22（RESPONSIVE TO DESSICATION 22）基因（RD22）也存在依賴ABA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。ABA介導(dǎo)的RD22基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)需要一種MYC （rd22BP1／At MYC2） 及 一 種 MYB（At MYB2）轉(zhuǎn)錄因子的合成，而該2種轉(zhuǎn)錄因子的合成都為ABA所誘導(dǎo)。At MYC2及At MYB2起轉(zhuǎn)錄激活因子的作用并與RD22基因啟動(dòng)子中的順式作用元件相結(jié)合（Abe等，1997；Abe等，2003）。At MYC2及At MYB2還以同樣機(jī)制參與其它ABA誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（Abe等，2003）。

盡管很多干旱反應(yīng)受ABA調(diào)節(jié)，但植物中也存在不依賴于ABA的干旱應(yīng)答機(jī)制。據(jù)報(bào)道，有多個(gè)干旱誘導(dǎo)基因并不依賴于ABA（Shinozaki等，1996）。這些基因在其上游調(diào)節(jié)區(qū)含有一個(gè)保守的脫水響應(yīng)元件（DRE），有些不受ABA調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子可與之結(jié)合并驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。很多不依賴于ABA的非生物脅迫信號(hào)途徑都很復(fù)雜，有人猜測DRE順式作用元件可能起著協(xié)調(diào)不同脅迫信號(hào)級(jí)聯(lián)的作用，并引發(fā)整個(gè)植株水平上對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)（Knight等，2001）。

ABA依賴及ABA非依賴信號(hào)級(jí)聯(lián)還可通過下游基因調(diào)節(jié)發(fā)生整合。例如，RD29A基因在其上游基因調(diào)節(jié)區(qū)同時(shí)含有ABRE及DRE順式作用元件各一個(gè)。在干旱脅迫的最初階段，RD29A基因的表達(dá)不依賴于ABA，但之后該基因的表達(dá)卻要依賴于ABA（Shinozaki等，2000）。

通過多個(gè)植物物種的分子學(xué)分析，人們對(duì)于干旱響應(yīng)的認(rèn)識(shí)已深入到水分虧缺條件下所誘導(dǎo)產(chǎn)生的一系列蛋白質(zhì)［參見Ramanjulu等（2002）的綜述］。例如，在干旱脅迫下，疏水性晚期胚胎富集（LEA）蛋白會(huì)積累，而這通常與植株的耐旱能力相關(guān)聯(lián)（Welin等，1994）。最近有證據(jù)表明，LEA蛋白可能具有穩(wěn)定其它蛋白質(zhì)及細(xì)胞膜的重要作用，并在干旱期間避免發(fā)生蛋白質(zhì)凝聚（Close，1996；Goyal等，2005）。在楊樹無性系（歐美楊品種Dorskamp）中，當(dāng)對(duì)植株施加滲透脅迫之后，研究人員觀察到了一種LEA家族蛋白，即脫水素的快速誘導(dǎo)和基因表達(dá)（Caruso等，2002）。在其它林木，例如云杉中，人們同樣也觀察到了LEA家族蛋白轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)水平的增加（Blodner等，2007）。

水通道蛋白是另一類在干旱響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用的主要蛋白質(zhì)。水通道蛋白存在于細(xì)胞膜中并負(fù)責(zé)水分子的跨膜運(yùn)輸，對(duì)于維持植株適宜的水分平衡起著至關(guān)重要的作用［參見Maurel等（2008）的綜述］。植物中有兩類主要的水通道蛋白：一類是發(fā)現(xiàn)于原生質(zhì)膜中的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs），另一類是發(fā)現(xiàn)于液泡膜中的液泡膜內(nèi)在蛋白（TIPs）。這兩類水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于維持植株體內(nèi)的水分狀況都至關(guān)重要，因而對(duì)光合作用和植株生長也有重要影響。在桉樹（Eucalyptus）中，PIPs為植株正常生長所必需，PIPs的下降會(huì)抑制生長（Tsuchihira等，2010）。水通道蛋白的表達(dá)水平可隨植株對(duì)水分狀況的反應(yīng)而有所不同。在水分脅迫條件下，煙草植株中PIP類型的水通道蛋白會(huì)有所下降，猜測其原因可能是水分運(yùn)輸減少所致（Mahdieh，2008）。在銀白楊（Populus alba L.）中，Berta等（2010）在經(jīng)歷干旱脅迫然后又復(fù)水的植株中鑒定出了5個(gè)上調(diào)表達(dá)的水通道蛋白轉(zhuǎn)錄物。復(fù)水之后水通道蛋白的積累對(duì)于植株重新處于水分供給充足狀態(tài)之后恢復(fù)其水分運(yùn)輸不可或缺。在楊樹（Populus）中，PIP1水通道蛋白家族的成員對(duì)于植株從木質(zhì)部栓塞狀態(tài)恢復(fù)到正常狀態(tài)也非常重要（Secchi等，2010）。水通道蛋白在干旱響應(yīng)中的功能多樣性無疑進(jìn)一步看出此類蛋白質(zhì)在不同樹木應(yīng)對(duì)干旱脅迫中的重要作用。據(jù)報(bào)道，在干旱條件下，特異水通道蛋白家族成員在干旱響應(yīng)策略明顯不同的兩個(gè)楊樹無性系（香脂楊及小葉楊×香脂楊）之間能引發(fā)不同的干旱響應(yīng)（Almeida－Rodriguez等，2010），這也反映出水通道蛋白在樹木水分運(yùn)輸中可能起著多方面的作用。

在過去的幾十年中，人們對(duì)于1年生草本植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)及其分子學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行過深入分析和研究，并鑒定出很多在干旱條件下積累的重要蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，信使RNA結(jié)合蛋白，蛋白酶，以及許多參與調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它蛋白質(zhì)［參見Ingram等（2003）的綜述］。近年來，人們在林木干旱響應(yīng)的分子機(jī)制及耐旱和抗旱性研究方面也取得長足進(jìn)展。目前，基因組方法正在被引入林木干旱響應(yīng)的相關(guān)研究之中，這將使基因的表達(dá)和功能能夠與植株整體水平上的反應(yīng)聯(lián)系在一起，無疑會(huì)有力地促進(jìn)此方面研究的發(fā)展。

5 林木干旱響應(yīng)基因的早期鑒定

在基因組時(shí)代之前，林業(yè)工作者和植物生物學(xué)家每一次都只能對(duì)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因的功能進(jìn)行研究。早期的研究結(jié)果顯示，最初在一年生草本植物中鑒定出的干旱響應(yīng)基因，如脫水蛋白及熱休克蛋白在各種木本植物的樹皮組織也存在其同系物（Wisniewski等，1996）。通過林木干旱誘導(dǎo)基因的鑒定，人們得以對(duì)林木干旱響應(yīng)的分子基礎(chǔ)有了進(jìn)一步的了解。例如，通過對(duì)水分虧缺條件下所誘導(dǎo)表達(dá)的互補(bǔ)DNA（cDNA）克隆的比較分析，人們在火炬松中首次鑒定出了大量干旱誘導(dǎo)基因，并對(duì)4個(gè)水分虧缺誘導(dǎo)cDNAs的序列及表達(dá)模式進(jìn)行了深入分析（Chang等，1996）。通過與其它植物中已鑒定的基因作序列相似性比對(duì)，結(jié)果顯示這些基因中的大多數(shù)可能具有細(xì)胞壁加固功能，并猜測它們參與細(xì)胞對(duì)水分脅迫的適應(yīng)（Chang等，1996）。為了不必根據(jù)已有的相關(guān)信息就能鑒定出更多的干旱響應(yīng)基因，Dubos等（2003）率先利用cDNA－ 擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)在海岸松（Pinus pinaster）的根及針葉中進(jìn)行干旱響應(yīng)基因的鑒定。據(jù)報(bào)道，他們在海岸松的實(shí)生苗中共鑒定出了48個(gè)推定的干旱響應(yīng)基因，而這48個(gè)基因中，很多都與已知功能的蛋白質(zhì)相符，其中包括光合作用，碳水化合物代謝，細(xì)胞壁合成以及植物防御功能等；不過，其中也有相當(dāng)高的比例與未知功能蛋白質(zhì)的基因相符。此外，Campalans等（2001）也曾采用cDNA－AFLP技術(shù)從干旱反應(yīng)不同的扁桃（Prunus amygdalus）品種的嫩葉中嘗試干旱應(yīng)答基因的鑒定。

表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag，EST）是通過對(duì)cDNA克隆進(jìn)行部分測序得到的一小段基因表達(dá)序列片段。與其它物種一樣，林木EST技術(shù)的開展和應(yīng)用也有力地拓展了林木基因發(fā)現(xiàn)的廣度和深度。據(jù)報(bào)道，Allona等（1998）及Sterky等（1998）通過EST分析分別從火炬松和楊樹中鑒定出了很多與木材形成相關(guān)的基因。盡管這些EST分析僅獲得與基因的表達(dá)及編碼序列有關(guān)的信息，而且以現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)來看，所發(fā)現(xiàn)的基因種類和數(shù)量也有限，但在當(dāng)時(shí)幾乎完全未作基因組鑒定的情況下，這些早期的開創(chuàng)性研究無疑為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

繼Allona及Sterky等人在火炬松和楊樹中的研究之后，人們在樺樹，松樹，以及桉樹等各種林木物種中報(bào)道的ESTs數(shù)量逐年增加（Strabala，2004；Li等，2009；Wang等，2010）。然而，這些研究中的很多依然側(cè)重于木材形成基因的EST分析。隨著人們越來越迫切地希望了解林木對(duì)各種環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制，生物學(xué)家們開始對(duì)實(shí)施各種不同脅迫處理后的植株或組織進(jìn)行EST分析。據(jù)Ujino－Ihara等（2000）報(bào)道，為了構(gòu)建干旱、傷害及其它脅迫相關(guān)基因的富集EST文庫，他們從砍伐2天后的日本柳杉（Cryptomeria japonica）植株的內(nèi)樹皮中成功鑒定出了約1 400個(gè)ESTs。Lorenz等（2006）報(bào)道，為了直接從火炬松中鑒定水分響應(yīng)基因，他們對(duì)火炬松的實(shí)生苗實(shí)施各種水分處理，之后建立了根部組織的EST文庫。在這些研究所鑒定出的EST中，有些與早先已在草本植物中鑒定出的干旱應(yīng)答基因同源，例如LEAs及脫水素。盡管樹木中鑒定出的ESTs與早先在其它植物物種中鑒定出的ES－Ts之間存在一定程度的相似性，但樹木中鑒定出的很多轉(zhuǎn)錄物屬于未知功能基因范疇。林木干旱誘導(dǎo)ESTs的鑒定對(duì)于早期的基因鑒定和轉(zhuǎn)錄組研究無疑起到了十分重要的作用，而通過這些研究所建立的EST文庫對(duì)于今后更加全面深入地開展樹木轉(zhuǎn)錄組活動(dòng)的分析研究也將具有十分重要的意義（Nagaraj等，2007）。

6 林木干旱響應(yīng)的全基因組解析－全轉(zhuǎn)錄組分析

在努力發(fā)掘和鑒定ESTs的同時(shí)，人們也清楚地認(rèn)識(shí)到僅通過干旱響應(yīng)基因的鑒定并不足以完全了解林木干旱響應(yīng)的復(fù)雜性。cDNAAFLP技術(shù)及EST頻率雖然能夠提供基因表達(dá)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但采用全基因組分析技術(shù)，例如微陣列分析（即基因芯片分析）才能全局性地揭示基因的表達(dá)模式。據(jù) Hertzberg等（2001）報(bào)道，他們在雜交白楊基因表達(dá)模式的研究中，基于一組木材形成相關(guān)ESTs（Sterky等，1998）并通過微陣列分析有效地揭示出木質(zhì)部在不同分化階段的特異性轉(zhuǎn)錄譜。事實(shí)上，人們最初也是基于用特異性組織，例如木質(zhì)部、莖尖及花粉等構(gòu)建的ESTs文庫并通過c DNA微陣列分析從而獲得林木轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)干旱應(yīng)答的一些信息。Heath等（2002）曾利用一個(gè)含有384個(gè)基因的松樹cDNA芯片研究松樹實(shí)生苗對(duì)輕度干旱的適應(yīng)性。盡管研究所涉及的基因數(shù)量有限，但仍然鑒定出了一些重要的分子伴侶及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些特定蛋白質(zhì)對(duì)于細(xì)胞維持和修復(fù)至關(guān)重要，因而為林木應(yīng)對(duì)輕度干旱脅迫所必需（Heath等，2002）。

早期的微陣列試驗(yàn)雖然能夠在一定程度上探究某一特定性狀或脅迫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)，但其結(jié)果顯然受到研究中所涉及到的基因數(shù)目的限制。隨著林木遺傳資源的不斷開發(fā)利用，更為全面的微陣列技術(shù)的建立使人們得以更加深入地研究脅迫生理反應(yīng)與全基因組表達(dá)譜之間的關(guān)系。Watkinson等（2003）利用一個(gè)大約包含2 100個(gè)cDNA克隆的微陣列芯片對(duì)受到干旱脅迫的火炬松植株的基因表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。其結(jié)果顯示，遭受干旱的植株其基因表達(dá)模式發(fā)生明顯變化，無論是基因表達(dá)種類還是基因的表達(dá)量均有所改變。所檢測到的干旱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物隸屬15個(gè)功能范疇，這使得研究人員能夠?qū)⒒虻谋磉_(dá)模式與植株對(duì)輕度或嚴(yán)重干旱環(huán)境的適應(yīng)能力相聯(lián)系，并明確這些特殊類群的基因在干旱應(yīng)答中的作用（Watkinson等，2003）。

盡管EST測序及早期的微陣列試驗(yàn)有力地促進(jìn)了人們對(duì)各類干旱應(yīng)答基因的認(rèn)識(shí)，但直到2006年，毛果楊（P.trichocarpa Torr.＆Gray）全基因組測序的完成才標(biāo)志著人們有能力對(duì)林木植株的整個(gè)干旱轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行探索（Tuskan等，2006）。楊屬基因組序列不僅為開發(fā)更全面的楊樹全基因組微陣列檢測平臺(tái)所必需，而且對(duì)于開展楊樹與其它植物物種，例如擬南芥（Arabidopsis）的比較基因組學(xué)研究也至為重要。進(jìn)入后基因組時(shí)代，人們借助可利用的序列數(shù)據(jù)開發(fā)出了大量楊樹微陣列資源。據(jù)報(bào)道，一種源自楊屬基因組并涉及100 000個(gè)以上ESTs及約占4成預(yù)測基因的c DNA微陣列芯片POP2被用于毛果楊（P.trichocarpa）及美洲黑楊（P.deltoides Bart.）全局性干旱響應(yīng)的研究（Sterky等，2004；Street等，2006）。研究人員在該兩個(gè)干旱反應(yīng)明顯不同的楊屬物種中鑒定出眾多差異性表達(dá)基因，并猜測基因表達(dá)的調(diào)控可能是物種分化中的一個(gè)重要步驟。

除了cDNA微陣列之外，人們還在楊樹中開發(fā)出了兩種短的寡核苷酸微陣列：Affymetrix楊樹基因組芯片（Affymetrix GeneChip Poplar Genome Array；www.affymetrix.com）及 Nimblegen楊樹全基因組微陣列芯片（Nimblegen Populus whole－genome array；http：／／www.nimblegen.com／products／exp／eukaryotic.html）。該兩種微陣列均根據(jù)楊樹全基因組測序鑒定出的基因序列（Tuskan等，2006）及公開可用的EST序列設(shè)計(jì)開發(fā)而來。據(jù) Wilkins等（2009b）報(bào)道，他們利用Affymetrix楊樹基因組芯片對(duì)2個(gè)楊樹雜種在2種水分處理（水分充足和水分受限）及4種取樣時(shí)間點(diǎn)（1天中的半夜、黎明前、正午及傍晚）條件下的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析鑒定。結(jié)果顯示，該2個(gè)基因型的干旱反應(yīng)在轉(zhuǎn)錄組水平上存在明顯分歧，這也說明僅僅通過一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)楊樹基因型的干旱轉(zhuǎn)錄組分析尚難以對(duì)整個(gè)楊屬物種的干旱轉(zhuǎn)錄組作出準(zhǔn)確的描述和鑒定。此外，取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)于該2個(gè)基因型的基因表達(dá)譜也有很大影響，而且2個(gè)基因型在某一時(shí)間點(diǎn)上對(duì)于干旱的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答并不存在實(shí)質(zhì)性關(guān)聯(lián)，這表明在研究植物對(duì)干旱脅迫的分子反應(yīng)時(shí)應(yīng)當(dāng)將基因表達(dá)的時(shí)間因素考慮在內(nèi)才能夠全面了解干旱響應(yīng)的分子基礎(chǔ)。

據(jù)Hamanishi等（2010）報(bào)道，他們利用全基因組微陣列技術(shù)在香脂楊（P.balsamifera）中明確檢測到了干旱轉(zhuǎn)錄組的種內(nèi)變異。有鑒于此，人們對(duì)于楊樹物種水平上的干旱轉(zhuǎn)錄組鑒定或許會(huì)變得愈加困難和復(fù)雜。試驗(yàn)中他們還將表型性狀與基因表達(dá)譜相比較，結(jié)果顯示，基因表達(dá)上變化幅度大的香脂楊基因型在干旱條件下也能保持生長。不同香脂楊基因型間干旱響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組的差異與種內(nèi)DNA序列變異的程度有關(guān)，這表明不同基因型之間的遺傳相關(guān)性或許可作為判斷它們是否具有相同干旱反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)。

直到最近，有關(guān)林木基因表達(dá)的很多研究都集中于葉片或根部并用以了解這些特定器官在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)。不過，這些試驗(yàn)均難以從細(xì)胞水平上揭示其對(duì)干旱脅迫的微妙反應(yīng)。Berta等（2001）檢測了銀白楊木材形成組織在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)水分虧缺的反應(yīng)，并就木材形成與干旱響應(yīng)之間的交互作用作了進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，很多干旱響應(yīng)基因網(wǎng)絡(luò)為不同組織（例如葉片和根）所共有，而且所鑒定出的有些轉(zhuǎn)錄物可能在干旱條件下起著調(diào)節(jié)木材形成的特殊作用?？偟恼f來，人們在楊樹中開展的這些相關(guān)研究充分揭示了林木全基因組干旱應(yīng)答的復(fù)雜性。而對(duì)于林業(yè)工作者而言，不同林木其干旱轉(zhuǎn)錄組在時(shí)間和空間上的變異性，以及不同個(gè)體之間所存在的相關(guān)變異均有望被開發(fā)用于育種及抗旱砧木的選擇。

7 林木干旱響應(yīng)的全基因組解析－數(shù)量性狀基因座定位及關(guān)聯(lián)研究

林木在形態(tài)和轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)都十分復(fù)雜且高度可變，不管是種內(nèi)或種間均是如此。有鑒于此，人們常常需要通過遺傳作圖及數(shù)量性狀基因座（QTL）定位以深入解析這樣一種復(fù)雜的性狀。不僅如此，QTL定位分析也有助于進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)這類復(fù)雜性狀的遺傳操作。迄今為止，不少林木植物都已成功構(gòu)建遺傳圖譜，并鑒定出了很多干旱相關(guān)性狀的QTLs。據(jù)Ronnberg－Wastljung等（2005）報(bào)道，他們在速生的柳樹雜種（Salix dasyclados×S.viminalis，即毛枝柳×蒿柳）中鑒定出多個(gè)對(duì)水分利用率（WUE）有顯著影響的QTLs。同樣，Brendel等（2008）在夏櫟（Quercus robur L.）中也鑒定出了10個(gè)與WUE相關(guān)的QTLs，其中有幾個(gè)QTL能引發(fā)較大程度的無性系變異。這些QTLs的鑒定及其效應(yīng)分析充分揭示了林木在耐旱或WUE上的復(fù)雜性，而相關(guān)研究成果也將有助于推動(dòng)林木抗旱育種的進(jìn)一步發(fā)展。然而，由于在基因組序列信息有限的情況下定位和鑒定某些特定QTL仍極為困難和耗時(shí)，因而極大程度地限制了該技術(shù)在一些物種中的開展和應(yīng)用。

為了克服QTL定位分析所面臨的困難，生物學(xué)家已開始采用基于連鎖不平衡（LD）的關(guān)聯(lián)作圖法，也即LD作圖法探究復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)，而與基于連鎖分析的常規(guī)QTL作圖相比，該方法顯得更為簡便有效（Hall等，2010）。關(guān)聯(lián)作圖是基于群體內(nèi)不同基因座等位基因間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)，并通過對(duì)含有遺傳標(biāo)記的基因組區(qū)段與所研究的復(fù)雜性狀之間進(jìn)行相關(guān)性分析從而達(dá)到定位和鑒定目標(biāo)基因的目的。隨著植物分子標(biāo)記的不斷開發(fā)利用，關(guān)聯(lián)作圖的應(yīng)用正變得越來越普遍。Gonzalez－Martinez等（2006）報(bào)道了火炬松18個(gè)耐旱候選基因的核苷酸多樣性及連鎖不平衡（LD）分析結(jié)果。中性檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，群體遺傳結(jié)構(gòu)或整個(gè)基因組未偏離中性假設(shè)。所有耐旱候選基因中大多數(shù)均屬中性選擇基因，而與這些中性選擇基因不同的是，候選基因early response to drought 3（erd3，干旱早期應(yīng)答3）可能受到過選擇清掃的作用，另一個(gè)基因ccoaomt－1（咖啡酰輔酶A－O－甲基轉(zhuǎn)移酶－1）則呈現(xiàn)出二態(tài)性，這大概與該基因受到長期的平衡選擇有關(guān)。候選基因在同義位點(diǎn)具有中等水平的核苷酸多樣性?；騼?nèi)的LD水平低且衰減迅速，而基因間未觀察到明顯的LD。此外，他們還鑒定出一系列單核苷酸多態(tài)性（SNPs）及單倍型標(biāo)簽SNPs（htSNPs）位點(diǎn)，而利用htSNPs可以大幅減少SNP基因分型工作的投入。盡管火炬松等針葉樹種具有一定程度甚至相當(dāng)程度的核苷酸多樣性，但由于其連鎖不平衡水平低且衰減快，故人們普遍看好通過候選基因途徑對(duì)其進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析?；鹁嫠赡秃岛蜻x基因多態(tài)性模式及LD水平的分析鑒定對(duì)于該復(fù)雜性狀的關(guān)聯(lián)分析無疑具有十分重要的意義。

除了基于候選基因策略的關(guān)聯(lián)作圖法之外，另一種可供選擇的關(guān)聯(lián)分析方法是基于全基因組掃描的關(guān)聯(lián)作圖法。該方法是利用足以覆蓋整個(gè)基因組片段的標(biāo)記與QTL等位基因之間的連鎖不平衡（LD）關(guān)系從而達(dá)到定位QTL的目的，很顯然全基因組掃描取決于能否獲得大量標(biāo)記，物種的LD水平，以及大規(guī)?；蚍中偷男省Ｓ捎诨鹁嫠傻柔樔~樹種基因組很大，而且LD水平低且衰減迅速，加之目前可利用的基因組信息相對(duì)較少，故該方法的應(yīng)用受到很大程度的限制。據(jù)Namroud等（2008）報(bào)道，他們在白云杉（Picea glauca）中通過全基因組SNP掃描研究了來自6個(gè)不同生態(tài)區(qū)域的自然群體其環(huán)境適應(yīng)性分化的分子基礎(chǔ)。在該項(xiàng)研究中，他們成功檢測到了一系列與群體表型適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)的編碼基因及SNPs位點(diǎn)，這表明該項(xiàng)技術(shù)不失為檢測和鑒定非模式及野生樹種具有環(huán)境適應(yīng)意義的正向選擇基因的有效方法，而通過關(guān)聯(lián)分析鑒定樹木野生種群經(jīng)長期正向選擇所產(chǎn)生的耐旱基因也必將有力地促進(jìn)未來林木抗旱育種的發(fā)展。

8 從干旱轉(zhuǎn)錄組到干旱蛋白質(zhì)組

盡管林木干旱響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組的分析鑒定能夠提供大量有關(guān)干旱分子應(yīng)答方面的信息，不過只有通過進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組分析才能夠揭示基因最終的表達(dá)產(chǎn)物，而這對(duì)于充分了解和認(rèn)識(shí)林木干旱的下游應(yīng)答基因也顯得尤為重要。迄今為止，人們已對(duì)多個(gè)林木物種的干旱蛋白質(zhì)組進(jìn)行過分析檢測，如楊樹（Plomion等，2006）及云杉（Blodner等，2007）等。然而，人們早先在檢測與楊樹干旱應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物及蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者之間并不完全相吻合，這表明相關(guān)基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)之間存在一定乃至相當(dāng)程度的差異，因此，只有通過干旱轉(zhuǎn)錄譜與蛋白質(zhì)譜的相互結(jié)合和相互補(bǔ)充才能夠充分揭示林木干旱應(yīng)答及干旱適應(yīng)性的分子機(jī)制（Plomion等，2006）。

林木中很多有關(guān)干旱響應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究均著重于評(píng)估和分析不同基因型在干旱響應(yīng)中的遺傳效應(yīng)。據(jù)Bonhomme等（2009）報(bào)道，他們通過雙向凝膠電泳在水分利用率明顯不同的2個(gè)歐美雜交楊（Populus deltoides×P.nigra）的葉片中鑒定出了一系列差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中有相當(dāng)部分為涉及光呼吸，氧化應(yīng)激，以及光合作用的葉綠體蛋白。楊帆等（2010）就2個(gè)中國本地楊樹物種，即康定楊（Populus kangdingensis）和青楊（Populus cathayana）對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)及蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行了分析和研究。結(jié)果顯示，該2種起源于喜馬拉雅東側(cè)不同海拔高度地區(qū)的楊樹對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出明顯不同的適應(yīng)性反應(yīng)。在干旱脅迫條件下，起源于低海拔地區(qū)的青楊其葉片相對(duì)含水量及CO2同化率的下降均顯著大于起源于高海拔地區(qū)的康定楊，同時(shí)，青楊中丙二醛及過氧化氫含量的增加也大于康定楊，而且與光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)呈明顯下調(diào)表達(dá)或發(fā)生降解。與青楊相比，康定楊則能更好地應(yīng)對(duì)干旱對(duì)整個(gè)機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的負(fù)面影響，如康定楊在干旱條件下能更加有效地增加可溶性糖，可溶性蛋白質(zhì)，以及游離脯氨酸的含量，并能增加抗氧化酶的活性，同時(shí)，干旱還能誘導(dǎo)某些與蛋白質(zhì)加工、氧化還原穩(wěn)態(tài)及糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)的特異性表達(dá)。這些研究結(jié)果表明康定楊在干旱條件下能更有效地維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并減輕細(xì)胞損傷，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱能力。植物干旱反應(yīng)的差異不只表現(xiàn)在物種水平上，對(duì)于有性別分化的物種而言，這種差異甚至也存在于雌雄植株之間。據(jù)張勝等（2010）報(bào)道，在青楊（Populus cathayana）中很多光合相關(guān)及脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá)均存在顯著的性別差異。不同性別植株干旱響應(yīng)蛋白質(zhì)的鑒定對(duì)于深入了解其干旱響應(yīng)及植株生產(chǎn)力的差異和變化無疑具有十分重要的意義。此外，人們還通過質(zhì)外體蛋白質(zhì)組分析充分證實(shí)了細(xì)胞外基質(zhì)在樹木逆境脅迫響應(yīng)中的重要作用。據(jù)Pechanova等（2010）報(bào)道，他們在美洲黑楊（P.deltoides）植株的葉片－莖－根質(zhì)外體連續(xù)體中鑒定出了很多脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)，而且葉片、莖及根質(zhì)外體各自都擁有一系列特異性脅迫相關(guān)蛋白。質(zhì)外體蛋白中有些涉及到蔗糖和淀粉的醣酵解、發(fā)酵及分解代謝，這些蛋白質(zhì)的存在有可能使植株在水分脅迫下也能夠正常生長。質(zhì)外體中還存在特別豐富并能有效抑制楊樹葉銹病病原體生長的病程相關(guān)蛋白，而葉銹病是楊樹中發(fā)生最普遍、危害也最大的病害之一。不僅如此，他們還在質(zhì)外體中鑒定出各種不同的過氧化物酶，而這些酶類看來參與了脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞壁修飾，尤其是在楊樹的生長季節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)表明楊樹在其胞外基質(zhì)連續(xù)體中已進(jìn)化出了一套能對(duì)多種生物和非生物脅迫因子作出響應(yīng)的系統(tǒng)水平上的“脅迫蛋白質(zhì)組”，而對(duì)于棲息于河岸等動(dòng)態(tài)多變環(huán)境中的楊樹及其它植物物種而言這也是一種十分重要的適應(yīng)性狀。

（未完，下期待續(xù)）