李 碩　邱 旸　張 敏 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

2014版液相色譜儀檢定規(guī)程的探討

李 碩邱 旸張 敏 / 上海市計量測試技術(shù)研究院

0　引言

在化學(xué)分析領(lǐng)域，液相色譜儀可謂應(yīng)用最為廣泛的幾種大型設(shè)備之一。在色譜類分析儀器中，其更是發(fā)揮著不可替代的重要作用，用于食品，醫(yī)藥，生物，環(huán)境監(jiān)測，石油化工等領(lǐng)域。2014年8月14日，我國開始實施新版JJG 705-2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》（以下簡稱新版檢定規(guī)程）。相比于2002版檢定規(guī)程，新版檢定規(guī)程描述更加準(zhǔn)確合理，對于實際操作具有更強的指導(dǎo)作用。然而，檢定人員在日常工作中依然會遇到一些問題，現(xiàn)結(jié)合筆者一些經(jīng)驗，對檢定規(guī)程提出一些建議與同行共同探討。

1　液相色譜儀輸液系統(tǒng)的檢定

在新版檢定規(guī)程中［1］，關(guān)于輸液系統(tǒng)的檢定項目包括：泵耐壓、泵流量設(shè)定值誤差、泵流量穩(wěn)定性和梯度誤差。但沒有針對泵壓力的穩(wěn)定性制定相關(guān)檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)。其實，液相色譜系統(tǒng)的壓力是否穩(wěn)定，是評價該儀器性能的一個重要參數(shù)。如果壓力波動較大，對儀器的流量穩(wěn)定性、定量及定性重復(fù)性都會產(chǎn)生影響。造成泵壓力波動的因素有很多，有一些是人為的，是由于流動相在使用前氣泡未脫凈，或者由于流動相在使用前未抽濾而導(dǎo)致雜質(zhì)過多等。這些因素需要在檢定工作開始前排除。更主要的是泵長期使用，性能下降所導(dǎo)致的：如單向閥中寶石球產(chǎn)生的磨損；密封墊的老化；含緩沖鹽的流動相而導(dǎo)致鹽分在泵上析出附著以及對泵的腐蝕等。因此泵壓力的穩(wěn)定性，能直觀反映出泵在使用過程中性能的優(yōu)劣。各大儀器廠家所開發(fā)的操作系統(tǒng)中，也均具有監(jiān)控儀器實時壓力的功能，可以讀出泵的實時壓力變化，以保證用戶能夠及時發(fā)現(xiàn)壓力系統(tǒng)的異常情況。因此建議，可以參考溫度穩(wěn)定性的評價方法，記錄一定時間內(nèi)泵壓力實時變化情況，并計算該時間內(nèi)的壓力穩(wěn)定性，從而更加全面地評價液相色譜儀在使用中泵性能的變化。

2　超高壓液相色譜的檢定

超高壓液相色譜儀由于其分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，近年來應(yīng)用日益廣泛，尤其在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，用戶多選擇超高壓液相色譜儀。國外知名的儀器生產(chǎn)廠商，例如安捷倫、沃特斯和島津公司都推出了自己的超高壓液相設(shè)備。但新版檢定規(guī)程中，未根據(jù)超高壓液相色譜儀的特殊性而設(shè)置具有針對性的檢定條件。按照新版檢定規(guī)程中規(guī)定的方法，在進(jìn)行定量重復(fù)性和最低檢測濃度檢定時，流速應(yīng)設(shè)為1.0 mL/min，這對于常規(guī)液相色譜儀是普遍適用的。但超高壓液相色譜儀通常需要配備超高壓液相色譜柱，并非常規(guī)的色譜柱。由于超高壓液相色譜柱的粒徑普遍較小，通常小于2 μm（常規(guī)液相色譜柱一般為5～10 μm）。因此在使用中為防止儀器壓力過高而導(dǎo)致?lián)p害輸液泵等配件，往往需要對流速進(jìn)行嚴(yán)格控制，一般應(yīng)在0.1～0.5 mL/min范圍內(nèi)。如采用新版檢定規(guī)程中規(guī)定的流速，將使整個系統(tǒng)壓力過高，無法正常工作。為安全起見，同時結(jié)合實際操作中積累的經(jīng)驗，建議應(yīng)采用較低流速，一般采用0.2 mL/min或0.3 mL/min即可。當(dāng)然，如果使用常規(guī)色譜柱替代超高壓色譜柱，也是可以在流速1.0 mL/min的標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行檢定工作的。但由于常規(guī)色譜柱的柱效明顯低于超高壓液相色譜柱，對于同等濃度的樣品，采用常規(guī)色譜柱產(chǎn)生的色譜峰峰高明顯低于超高壓液相色譜柱產(chǎn)生的峰高，導(dǎo)致最低檢測濃度的計算結(jié)果無法真正反映出超高壓液相色譜儀靈敏度高這一優(yōu)點，從而影響對儀器真實性能的評價。正因為超高壓液相色譜具有更高的靈敏度（即更低的最低檢測濃度），因此也應(yīng)針對其這一特點制定不同于常規(guī)液相的合格判定標(biāo)準(zhǔn)。隨著超高壓液相色譜的推廣，制定規(guī)程時應(yīng)考慮到超高壓液相系統(tǒng)的特殊性，在規(guī)程中設(shè)定針對超高壓液相色譜檢定的色譜條件以及合格判定標(biāo)準(zhǔn)。

另外，進(jìn)行超高壓液相色譜儀的檢定工作時，要特別注意進(jìn)樣量的選擇。常規(guī)液相色譜儀檢定時，由于其自動進(jìn)樣器能準(zhǔn)確控制進(jìn)樣量的范圍為0.1～100 μL，因此可選擇的范圍較廣，將進(jìn)樣量設(shè)置為10 μL或20 μL，甚至更高的進(jìn)樣量都沒有問題。但很多超高壓液相色譜儀由于其自動進(jìn)樣器默認(rèn)配備的定量環(huán)定量體積較小，其能精確控制的進(jìn)樣量一般≤7.5 μL。如果仍較高地進(jìn)樣會導(dǎo)致自動進(jìn)樣器無法準(zhǔn)確定量，這將會嚴(yán)重影響儀器定量重復(fù)性的測定結(jié)果。這種情況下，需要將進(jìn)樣量調(diào)整為1～5 μL，才能保證得到正確的測量結(jié)果。

3　自動進(jìn)樣器缺少相關(guān)檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)

隨著液相色譜儀自動化程度的日益提高，大多數(shù)液相色譜儀都配制了自動進(jìn)樣器。自動進(jìn)樣器作為液相色譜儀的重要組成部分，由于直接影響進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性，因此其計量性能的優(yōu)劣對整套設(shè)備的定量準(zhǔn)確性影響很大。在美國FDA及歐盟的質(zhì)量體系認(rèn)證中，該項目都是必須認(rèn)證的項目。而我國新版檢定規(guī)程中缺少針對該項目的檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)。國家也未頒布有關(guān)自動進(jìn)樣器的校準(zhǔn)規(guī)范。在實際工作中沒有可以依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)來開展該項目的計量工作，無法實現(xiàn)與國際接軌。因此有必要在檢定規(guī)程中增加該項目的檢定方法或制定相關(guān)校準(zhǔn)規(guī)范用以指導(dǎo)計量工作的開展。由于并非所有儀器都配制自動進(jìn)樣器，因此可列為非必檢項目。中國食品藥品檢定研究所的王冠杰［2］等已經(jīng)針對該項目的校準(zhǔn)方法開展了實驗，參照歐洲醫(yī)藥管理局（OMCL）在《質(zhì)量控制文件》［3］中提供的校準(zhǔn)方法，對自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣準(zhǔn)確性、重復(fù)性和進(jìn)樣殘留項目進(jìn)行系統(tǒng)的研究，建立了相關(guān)的實驗方法并對校準(zhǔn)方法的測量不確定度進(jìn)行評價。該研究具有很強的借鑒價值，但所涉及的儀器型號較少，如能有更多型號的儀器進(jìn)行驗證，將為日后該項目檢定校準(zhǔn)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

4　缺乏正相色譜系統(tǒng)檢定方法及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

正相色譜的應(yīng)用范圍雖不如反相色譜廣泛，但其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域也發(fā)揮著不可替代的作用。新版檢定規(guī)程中，僅給出了反相色譜條件下開展檢定的方法。但在實際檢定工作中會遇到很多采用正相色譜系統(tǒng)的液相色譜儀。因此會遇到兩方面的問題：（1）如果嚴(yán)格按照新版檢定規(guī)程的方法，需先將正相色譜條件切換至反相條件，即將正相流動相（如正己烷），經(jīng)異丙醇置換完全后，再用反相流動相（如甲醇）置換完全。整個切換過程比較繁瑣，每一步的置換過程都需要經(jīng)過較長時間的平衡，才能保證管路中殘留的流動相被置換完全，此舉大大增加了檢定工作的時間，而且有些客戶的儀器在日常工作中，只用正相色譜系統(tǒng)進(jìn)行特定樣品的分析工作；（2）從客戶的角度講，他們并不希望進(jìn)行正反相系統(tǒng)的切換，因為在切換過程中如果操作不當(dāng)（如流動相置換不充分），會對整個機器的穩(wěn)定性造成影響，導(dǎo)致樣品保留時間產(chǎn)生偏差等。如果在正相條件下進(jìn)行檢定，又由于缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢定方法，導(dǎo)致檢定工作無法正常開展?；谝陨显颍瑧?yīng)針對不同檢測器，研制一系列用于檢定正相色譜系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。這樣可以避免繁瑣的流動相切換，提高工作效率，也可為客戶提供便利，更容易為客戶所接受。

5　線性范圍的檢定

在液相色譜儀的實際應(yīng)用中，許多用戶需要建立線性曲線用于樣品含量的檢測。儀器線性的好壞，直接關(guān)系到定量是否準(zhǔn)確，是關(guān)乎儀器質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。檢定規(guī)程也對“線性范圍”的檢定制定了相關(guān)方法，但新版檢定規(guī)程中僅將其作為檢測器性能判定的標(biāo)準(zhǔn)。雖然新版檢定規(guī)程中的方法能反映出檢測器線性響應(yīng)的優(yōu)劣，但儀器的線性性能，不但受檢測器的影響，進(jìn)樣器的進(jìn)樣準(zhǔn)確性、溫度的波動、色譜柱的性能等也會對其產(chǎn)生影響。因此應(yīng)將液相色譜儀線性范圍的評價，作為整機性能考察中的一項評判標(biāo)準(zhǔn)，而不單單是只作為評價檢測器性能的標(biāo)準(zhǔn)。在檢定規(guī)程中，針對不同檢測器規(guī)定了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（紫外-可見光檢測器，二極管陣列檢測器和熒光檢測器為萘-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；示差折光率檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為甲醇中膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液）?？梢詫z定方法由直接向檢測器中注入的方式變更為通過進(jìn)樣系統(tǒng)依次進(jìn)同體積不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式。樣品通過整個系統(tǒng)后，將軟件中記錄下的色譜圖經(jīng)積分處理后，用得到的響應(yīng)值（峰高或峰面積）對相應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行線性范圍的檢定。這樣既可以考察檢測器線性響應(yīng)能力的優(yōu)劣，也可以兼顧進(jìn)樣器的進(jìn)樣準(zhǔn)確性等其他因素的影響，因此可以對整套設(shè)備的線性水平做出評價。

另外，在考察儀器線性水平時，除了線性范圍這一指標(biāo)外，還應(yīng)增加線性相關(guān)性（即相關(guān)因子r）這一指標(biāo)的考察。因為該參數(shù)更能直觀反映儀器線性響應(yīng)性能的優(yōu)劣。而用戶在實際應(yīng)用中，也常常需要利用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)程度是有要求的（一般r≥0.999 5）。如果儀器本身的線性相關(guān)性較差，會導(dǎo)致用戶在利用外標(biāo)法進(jìn)行含量計算時產(chǎn)生較大偏差，或無法繪制出符合線性要求的線性曲線。線性相關(guān)性的檢定方法可參照線性范圍的檢定方法同步進(jìn)行。新版檢定規(guī)程中規(guī)定，進(jìn)行線性范圍檢定時，首先依據(jù)前五個濃度點的響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并作為判斷后續(xù)濃度點是否為檢測上限的依據(jù)。因此在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時，可以同步計算出該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)因子r。如果相關(guān)因子合乎標(biāo)準(zhǔn)，表明儀器線性相關(guān)性合格，再進(jìn)行線性范圍的后續(xù)計算。如果相關(guān)因子不合格，則表明儀器的線性相關(guān)性出現(xiàn)了問題。

6　結(jié)語

本文針對新版液相色譜檢定規(guī)程在實際應(yīng)用中遇到的問題進(jìn)行了探討，并結(jié)合工作經(jīng)驗提出了一些建議，希望可以為液相色譜檢定工作的進(jìn)一步完善和發(fā)展提供幫助。

［1］ 全國物理化學(xué)計量技術(shù)委員會. JJG 705-2014 ［S］. 北京：中國質(zhì)檢出版社，2014.

［2］ 王冠杰，季士偉，田利，等. 高等液相色譜儀自動進(jìn)樣器校準(zhǔn)方法及不確定度的評定［J］. 化學(xué)分析計量，2013，22（5）：69-71.

［3］ OMCL Network of the Council of Europe. Quality Management Document PA/PH/OMCL （11） 04- Annex 1［S］.