轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)研究進展

王晨光，許文濤，朱鵬宇，付 偉*

轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)研究進展

王晨光1,2，許文濤2,3，朱鵬宇2，付 偉1,*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100029；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100083）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)備受世人關(guān)注，且轉(zhuǎn)基因作物關(guān)乎人體健康和生態(tài)環(huán)境，因此對轉(zhuǎn)基因作物的安全評價地位極其重要，各種評價方法也在不斷前進與發(fā)展。組學分析技術(shù)成為安全評價工作的新思路。本文主要論述了轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)的必要性，組學分析技術(shù)的發(fā)展，世界主要轉(zhuǎn)基因作物組學評價發(fā)展情況及未來轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)的發(fā)展趨勢，以期對轉(zhuǎn)基因安全評價工作提供新的思路和方向。

轉(zhuǎn)基因作物；組學分析；組學策略；多組學分析技術(shù)

自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因作物耐草甘膦品系轉(zhuǎn)基因大豆問世以來[1]，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類生活做出了極大的貢獻。轉(zhuǎn)基因作物不僅在種植面積上呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，其種類也逐漸豐富起來。目前主要的轉(zhuǎn)基因性狀包括抗蟲及抗除草劑兩大類，除此之外，其他抗逆性狀以及品質(zhì)改良型轉(zhuǎn)基因作物也獲得了研究者更多的關(guān)注[2]。伴隨轉(zhuǎn)基因作物快速發(fā)展而來的是人們對其打破原有生物進化規(guī)律的深入思考。轉(zhuǎn)基因食品是轉(zhuǎn)基因作物經(jīng)過加工制成的。作為人體日常攝入的消費品，轉(zhuǎn)基因食品的原料必須是已經(jīng)過批準商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物。從這一角度來看，無論是考慮打破物種間基因轉(zhuǎn)移規(guī)律的轉(zhuǎn)基因作物，還是考慮民眾日常消費的轉(zhuǎn)基因食品都需要進行必要的安全評價。需要說明的是，對轉(zhuǎn)基因食品的評價其實是對食品中轉(zhuǎn)基因成分的評價，也就是對轉(zhuǎn)基因作物進行評價。本文對世界主要轉(zhuǎn)基因作物新興的組學分析技術(shù)進行綜述，并重點分析了當前轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)的特點及發(fā)展方向，為轉(zhuǎn)基因食品安全評價提供新策略與認知。

1 轉(zhuǎn)基因組學技術(shù)分析策略

1.1轉(zhuǎn)基因組學分析技術(shù)的必要性

安全評價的目標在于識別和規(guī)避風險。對于轉(zhuǎn)基因作物而言，分析轉(zhuǎn)基因樣品預期及可能存在的非預期變化能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物的安全評價。既然要分析變化，我們就要首先識別這些變化。國際上公認的識別變化的技術(shù)都是基于實質(zhì)等同（substantial equivalence）原則[3]。實質(zhì)等同通過對轉(zhuǎn)基因作物的農(nóng)藝性狀和食品中各主要營養(yǎng)成分、營養(yǎng)拮抗物質(zhì)、毒性物質(zhì)及過敏性物質(zhì)等成分的種類和數(shù)量進行分析，并與相應的傳統(tǒng)食品進行比較，若二者之間沒有明顯差異，則認為該轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品在食用安全性方面具有實質(zhì)等同性，不存在安全性問題[4]。實質(zhì)等同原則不僅提供了評價轉(zhuǎn)基因食品的思路，而且提供了相應的實驗方法，包括農(nóng)藝學性狀評價（多地點多時間），成分分析，動物營養(yǎng)及毒理學評價等[5]。然而，這些方法很難把握基因轉(zhuǎn)移可能帶來的其他潛在變化，即非期望效應（unintended effects）。非期望效應是指除了目的基因插入產(chǎn)生的效應之外，轉(zhuǎn)基因與親本在表型、反應和組成上所顯示出的統(tǒng)計學的顯著差異[6]，因此非期望效應是轉(zhuǎn)基因安全性的關(guān)鍵因素，它在我們預計的產(chǎn)毒及過敏物質(zhì)的基礎上體現(xiàn)出基因轉(zhuǎn)移對受體其他活動的影響，而這些差異恰恰可能是轉(zhuǎn)基因作物安全隱患的來源。同時，傳統(tǒng)的分析方法還存在一些普遍的不足之處，比如不夠靈敏，耗時較長及可能存在統(tǒng)計錯誤等。因此，必須開發(fā)出新的評價方法來分析轉(zhuǎn)基因食品的非期望效應。

轉(zhuǎn)基因作物可以在不同生物水平（轉(zhuǎn)錄RNA、蛋白質(zhì)、代謝物）與親本發(fā)生變化，這些變化有些是轉(zhuǎn)入基因直接調(diào)控的，有些則是因為基因插入導致的其他生物分子的變化，需要一種能在一個生物體中通過分析數(shù)據(jù)來分析整個生命活動的研究方法，于是學術(shù)界產(chǎn)生了將組學技術(shù)應用在轉(zhuǎn)基因作物非期望效應分析上來的思想。組學是一類個體的系統(tǒng)集合，它通過獲得生物體整體的綜合信息來鑒定不同物質(zhì)（DNA、蛋白質(zhì)、代謝物），最初的組學研究是用來找出與疾病相關(guān)的分子標志物[6]。也正因為這樣，組學能夠找出傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因評價方法存在的“盲點”；當然組學分析也會產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，其中一部分數(shù)據(jù)還是“無關(guān)點”。但是，合理地處理盲點與無關(guān)點之間的矛盾可以幫助我們找到轉(zhuǎn)基因作物的未知變化。因此，組學分析技術(shù)越來越多的應用到非期望效應研究上，已成為轉(zhuǎn)基因作物及食品安全評價的發(fā)展方向[6]。

1.2 轉(zhuǎn)基因組學分析方法

組學技術(shù)能夠鑒定和分析轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生的核酸或化合物，這些分子可以是轉(zhuǎn)基因的表達產(chǎn)物，也可能是未知的發(fā)生變化的表達產(chǎn)物。運用組學技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因與親本差異不僅可以找到生物體病原性或其他方面的非期望效應，還能進一步研究非期望效應是否會產(chǎn)生負面影響。其中，按照中心法則規(guī)律，生物信息形成了DNA、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、細胞、組織、器官、個體及群體這幾個研究層次，對應就有基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學和代謝組學等多個領域誕生。

轉(zhuǎn)錄組學是指在特定發(fā)育階段或生理條件下，細胞中的整套轉(zhuǎn)錄本及其數(shù)量。轉(zhuǎn)錄組包含的mRNAs，非編碼RNA和小RNAs對研究插入基因的表達情況十分重要[7]。目前比較常用的技術(shù)為DNA微陣列（DNA microarray）技術(shù)和大規(guī)模平行測序（massively parallel signature sequencing，MPSS）技術(shù)，基因表達系列分析技術(shù)（serial analysis of gene expression，SAGE）或表達序列標簽文庫測序技術(shù)數(shù)字表達譜（digital gene expression profiling，DGE）也是獲得轉(zhuǎn)錄組表達譜的技術(shù)[8-9]。其中，微陣列芯片技術(shù)無論從特異性還是經(jīng)濟角度都是較佳選擇，而SAGE或DGE數(shù)字表達譜所具有的高通量和大數(shù)據(jù)特點成為獲得完整基因表達譜的重要方法，且有取代基因芯片的趨勢。蛋白組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象，應用相關(guān)研究技術(shù)，從整體水平上來認識蛋白質(zhì)的存在及活動方式（表達、修飾、功能、相互作用等）的學科[10]。應用蛋白組學評價轉(zhuǎn)基因作物主要關(guān)注差異蛋白的鑒定，蛋白質(zhì)表達分析及蛋白質(zhì)可能存在的活性調(diào)節(jié)。高通量定量蛋白質(zhì)組學可分為兩種不同的方法：蛋白質(zhì)的相對和絕對定量。相對定量揭示了蛋白質(zhì)應答刺激時的豐度變化[11]。絕對定量基于蛋白質(zhì)染色或穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析方法，可以給定某個蛋白質(zhì)的準確含量。目前研究方法主要有雙向電泳（twodimensional electrophoresis，2-DE）、多維液相色譜（multidimensional liquid chromatography，MD-LC）、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、同位素親和標簽技術(shù)（isotope-coded affinity tag，ICAT）等穩(wěn)定同位素標記的蛋白質(zhì)相對定量技術(shù)和同位素相對標記（isotopic tagging for relative and absolute quantification，iTRAQ）等通過同位素標記質(zhì)譜測定的絕對定量技術(shù)[12]。代謝組學是對一個生物系統(tǒng)的細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析，從而定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應答規(guī)律的組學技術(shù)[13]。代謝組學能夠研究生物體在外界刺激下所做出的反應，因此可以作為對轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學的補充。由于代謝組學的研究對象為各種代謝產(chǎn)物，因此最常見的鑒定化合物的技術(shù)，如核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[16]都是常用的方法。這些化合物鑒定技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析模型就可以找出主要變化的代謝物并與參照比較，從而在生物代謝的終端對基因插入進行評價。常用的數(shù)據(jù)分析模型包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（cluster analysis，CA）及偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等[17]。

在選取分析方法的時候，以SAGE技術(shù)為代表的、以測序為基礎的表達譜分析是轉(zhuǎn)錄組學使用最廣泛的方法；2-DE技術(shù)分離結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定體系較為成熟，適合于分析蛋白組差異，成本也較為低廉，是蛋白組學研究使用最廣泛的分離技術(shù)，而代謝組學則沒有普遍使用的技術(shù)路線，研究者將不同方法和不同分析模型結(jié)合會產(chǎn)生不同的結(jié)果[18]。除此之外，另一個選取分析方法需考慮的要素是方法結(jié)合問題。任何一種組學技術(shù)都能對轉(zhuǎn)基因食品進行評價，這些結(jié)論能夠用來綜合的從某一個生物層次分析基因轉(zhuǎn)移的影響。然而，由于轉(zhuǎn)基因mRNA是基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，它與蛋白質(zhì)的表達水平雖存在著相互關(guān)系，但其相關(guān)系數(shù)通常不高[19]，且某個蛋白酶濃度的變化對代謝物和表現(xiàn)型的影響往往很小。因此忽略代謝物方面的變化對分析基因轉(zhuǎn)移帶來的影響是不可取的。反過來說，代謝層面的微小變化背后往往意味著某種蛋白的顯著表達，這種相互作用使得單獨組學很難滿足轉(zhuǎn)基因安全評價的要求。因此，將這些組學綜合到一起分析，形成多組學分析技術(shù)，可以探明生物體從基因到化合物一整條通路的變化，能夠更全面地分析基因轉(zhuǎn)移對親本作物的安全性。

2 不同轉(zhuǎn)基因作物組學研究情況

2014年，轉(zhuǎn)基因作物在全球的總種植面積已經(jīng)超過了1.81億hm2，比2013年增加了3%。這個數(shù)據(jù)相對于1996年轉(zhuǎn)基因作物種植面積增加了100倍。在全世界范圍內(nèi)獲得批準的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物中，玉米是獲批事件最多的作物，其次是棉花、馬鈴薯、油菜和大豆[20]。我國進口的轉(zhuǎn)基因作物主要是大豆、玉米和油菜，主要用途是榨油和飼料[21]。結(jié)合世界轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展趨勢及我國飲食習慣，以下就較為常見的轉(zhuǎn)基因作物在組學層面的分析作簡要歸納。

2.1玉米

轉(zhuǎn)基因玉米是全世界商業(yè)化程度最高的轉(zhuǎn)基因作物，累積有27個國家130個事件獲得批復，對其研究也最為成熟。Coll等[22-23]以常見抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米MON810為實驗組，分別利用體外實驗、田間耕種實驗組及非轉(zhuǎn)對照組做了轉(zhuǎn)錄組學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種情況下MON810與親本的轉(zhuǎn)錄組水平都沒有較大差異，且這些差異已不能從田間耕種中發(fā)現(xiàn)。此后Coll等[24]又設置常規(guī)和低氮兩種生長環(huán)境研究MON810和親本的轉(zhuǎn)錄組差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境（常規(guī)育種和低氮育種）對轉(zhuǎn)錄組水平的影響比基因插入要大的多。Coll等[25]繼續(xù)利用2-DE和質(zhì)譜技術(shù)分析MON810的蛋白組信息，發(fā)現(xiàn)2-DE中差異的點幾乎全部為外源插入基因所表達的蛋白，其余的蛋白圖譜幾乎沒有差異，這樣就從轉(zhuǎn)錄組和蛋白組兩個層面評價了MON810與非轉(zhuǎn)親本的差異。這一結(jié)論也和Albo等[26]得出的實驗結(jié)果一致。Manetti等[27]開始在代謝組層面分析MON810和非轉(zhuǎn)親本的差異，發(fā)現(xiàn)初級氮代謝中4種化合物的含量差異。而Piccioni等[28]就以同樣的方法鑒定了40種水溶性代謝物，發(fā)現(xiàn)了5種與Manetti等[27]結(jié)論不同的顯著變化的化合物。Leon等[29]利用毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（capillary electrophoresis-time-offlight-mass spectrometry，CE-MS）和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS）從3株田間種植的轉(zhuǎn)基因玉米MON810中鑒定出包括嘌呤、氨基酸、花生四烯酸等代謝物的升高。

從上面的研究結(jié)果可以看到，不同學者對轉(zhuǎn)基因玉米的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組圖譜的研究基本趨于一致，總結(jié)來說就是轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平差異微小，基因轉(zhuǎn)移的影響要小于種間差異。而代謝組學結(jié)果較為復雜，造成這一現(xiàn)象的原因主要有兩個：一是不同技術(shù)帶來的影響。代謝組學沒有一套通用的數(shù)據(jù)分析方法，無論是主成分分析還是聚類分析都會存在一些差異。而另一個原因則是實驗樣品選取的問題。Frank等[30]利用GC-MS分析基因轉(zhuǎn)移和環(huán)境影響對轉(zhuǎn)基因玉米MON810和NK603及親本的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素造成的影響比基因轉(zhuǎn)移本身帶來的影響要大的多，因此與轉(zhuǎn)基因玉米做對照的非轉(zhuǎn)樣本需要和轉(zhuǎn)基因玉米在同一種植條件下獲得才能得到比較客觀的數(shù)據(jù)。Batista等[31]從雙向電泳圖中找了相同植株之間差異明顯的蛋白，這些差異在樣品混合時會存在被掩蓋的現(xiàn)象，從而對實際評價工作造成困難。因此，在利用組學技術(shù)分析非期望效應時必須消除種間差異帶來的負面影響。la Paz等[32]等通過分析MON810轉(zhuǎn)錄RNA的序列發(fā)現(xiàn)MON810插入基因表達CryIAb蛋白的終止子有一部分缺失，導致實際外源基因表達蛋白增加了兩個氨基酸。這一結(jié)果可能是因為MON810后代進行了多輪自交，因此外源基因插入的環(huán)境受到極大改變[33]，這也就解釋了Manetti[27]和Piccioni[28]等的結(jié)果之所以存在差異的原因。而la Paz等[32]的實驗同時表明MON810在后代繁殖的過程中mRNA的數(shù)量大小及蛋白層面均沒有影響，這也從側(cè)面證明了MON810在轉(zhuǎn)錄組及蛋白組層面與非轉(zhuǎn)樣本實質(zhì)等同。

從上面的分析還可以得出，MON810的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及代謝組所表現(xiàn)的差異不同。排除一些客觀條件，我們還是能看到單一組學對轉(zhuǎn)基因評價的局限性。Coll等[22-25]研究團隊前后幾年的研究代表了多組學結(jié)合的研究思路。Barros等[34]將轉(zhuǎn)錄組學，蛋白組學和代謝組學結(jié)合起來分析轉(zhuǎn)基因玉米MON810和非轉(zhuǎn)親本，同樣發(fā)現(xiàn)了環(huán)境因素的影響比基因轉(zhuǎn)移顯著。然而，Barros[34]依然沒能找到一條代謝通路揭示從基因到代謝物的變化與基因轉(zhuǎn)移的關(guān)系，因此還需要進一步研究找出影響轉(zhuǎn)基因玉米非期望效應產(chǎn)生的原因。

2.2水稻

水稻是全球主要糧食作物之一，全球一半人口通過水稻獲得所需的碳水化合物和蛋白質(zhì)[35]。轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)是為了達到抗蟲抗病的效果，而水稻又主要作為食物被人體利用，對于轉(zhuǎn)基因水稻的安全評價至關(guān)重要。Montero等[36]通過轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻（轉(zhuǎn)化體Senia-afp R25.12、Senia-afp R25.14、Senia-afp R25.15）與親本相比只有0.4%轉(zhuǎn)錄組差異，而這0.4%差異中35%是由轉(zhuǎn)基因操作方法（體外培養(yǎng)、細胞去分化、植株再生）引起的，只有15%是由于基因插入引起的。Montero等認為大部分產(chǎn)生非期望差異的序列是由于轉(zhuǎn)基因作物在種植過程中應對外界刺激而產(chǎn)生的變化，而不是基因轉(zhuǎn)移引起的。這也與2.1節(jié)中玉米組學分析結(jié)果一致。Batista等[37]為了比較誘變水稻和轉(zhuǎn)基因水稻（ScFvT84.66）在非期望效應方面的差異，同樣利用微陣列分析技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻及其后代和γ射線誘變水稻后代做了轉(zhuǎn)錄組學的比較，發(fā)現(xiàn)誘變體和轉(zhuǎn)基因樣本都會產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組層面的變化，且誘變體的變化更為明顯。Wang Yan等[38]利用雙向電泳和電子噴霧飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析含有Cry1ab/ac蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻的信息。Gong Chunyan等[39]利用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因水稻Bar68-1和2036-1a與親本的蛋白組差異，該研究還選取了自然基因突變的植株作為參照。而結(jié)論則指出轉(zhuǎn)基因與親本在蛋白圖譜上的差異不如自然育種及基因突變植株與親本的差異顯著，從而消除了基因轉(zhuǎn)移帶來非期望效應的憂慮。

目前對水稻的改良更多的集中于品質(zhì)提升，因此其初級及次級代謝產(chǎn)物就為這些品質(zhì)改良型水稻提供了很好的科學評價依據(jù)。這些代謝產(chǎn)物的過渡積累會導致植物生理上的非期望效應發(fā)生。Wu Jiao等[40]利用GC-MS技術(shù)，結(jié)合CA和PCA等計算模型找出轉(zhuǎn)基因水稻C418-Xa21和C418-Xa23與不同播種時間和地點的親本的代謝指紋圖譜差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻除了在琥珀酸表達水平上有顯著差異，其余的差異均沒有親本之間的差異明顯。Chang Yuwei等[41]利用LC-MS方法結(jié)合PCA等模型對不同的轉(zhuǎn)cry1Ac和sck抗蟲基因水稻和親本水稻做了驗證得出了類似的結(jié)論。Long Xiaohang等[42]通過基因工程技術(shù)獲得了高賴氨酸的轉(zhuǎn)基因水稻，由于該轉(zhuǎn)基因品系的表達型即為賴氨酸表達量提高，因此該研究團隊利用LC-MS技術(shù)對賴氨酸代謝通路中11種中間化合物做了代謝圖譜，并證明了該轉(zhuǎn)基因水稻的預期表型。Ioset等[43]研究了抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的黃酮化合物圖譜，也發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)樣本之間的微小差異及非轉(zhuǎn)樣本種間的顯著性差異。從該分析來看，通過代謝組學技術(shù)能夠完成預期及某些非預期效應的分析，但是對于催化產(chǎn)物合成的蛋白酶，及調(diào)控蛋白表達的基因沒有進一步探討。由于該轉(zhuǎn)基因水稻是通過RNA干擾獲得的，其轉(zhuǎn)錄組和蛋白組可能發(fā)生的變化還是未知的，而代謝物發(fā)生的變化僅僅是這些酶發(fā)揮的一部分功能，因此有必要通過其他組學技術(shù)對其進行補充評價。這也反映了水稻組學分析的一個問題，即單一組學分析會發(fā)現(xiàn)遺傳信息傳遞過程中不同層面發(fā)生的變化，卻無法看到一條受調(diào)控的通路。如果想看到基因轉(zhuǎn)移對其代謝通路從基因到代謝產(chǎn)物的變化，還需要多組學合作才能更好的評價轉(zhuǎn)基因水稻的安全問題。

此外，動物實驗既是了解食用轉(zhuǎn)基因作物后體內(nèi)代謝情況的良好途徑，也是國家轉(zhuǎn)基因食用安全評價的標準方法之一。利用動物實驗的數(shù)據(jù)做組學分析也能夠?qū)D(zhuǎn)基因作物進行安全評價，而又由于動物實驗為經(jīng)口喂養(yǎng)實驗，其更加貼近人體進食轉(zhuǎn)基因作物后的反應，因此合理的動物實驗結(jié)合組學分析技術(shù)能夠很好的模擬體內(nèi)代謝的變化。Cao Sishuo等[44-45]按照這樣的思路分別對抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻T1c-19和T2A-1做了大鼠90 d喂養(yǎng)實驗并進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)大鼠個體差異比轉(zhuǎn)基因的影響要大，這一數(shù)據(jù)分析結(jié)果與90 d喂養(yǎng)實驗常規(guī)檢測指標得到的結(jié)論一致。

2.3大豆

Cheng等[46]將耐草甘膦大豆與與非轉(zhuǎn)基因大豆進行轉(zhuǎn)錄組學分析也發(fā)現(xiàn)了普通大豆的種間差異比轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因之間的差異大的規(guī)律，且非轉(zhuǎn)基因的參照壽命越長，種間差異越明顯，因而這一現(xiàn)象對陰性對照的選取有著重要意義。García-Villalba等[47]通過代謝組學從45種耐草甘膦大豆目標代謝物中分析出8種顯著變化的代謝物，而其中絕大部分都可以從外源插入基因的代謝通路中找到。Inaba等[48]對耐草甘膦大豆不同組織進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)了酪氨酸和苯丙氨酸含量的提高，并推測出其可能是由插入基因引起的原因。Clarke等[49]將49種非轉(zhuǎn)基因大豆與轉(zhuǎn)基因大豆SYHT06W共同分析，通過代謝圖譜確定基因插入帶來的非期望效應，并從圖譜中得出代謝物之間除了預計改變的通路以外無顯著差異的結(jié)論。Kusano等[50]利用CE-MS、GC-MS、LC-MS、ICR-MS等多種分析方法對連續(xù)育種多年的傳統(tǒng)大豆品系與耐草甘膦大豆進行代謝組分析，不僅能夠根據(jù)代謝物的不同鑒定樣品，還能推理出基因轉(zhuǎn)移對代謝物的影響不如育種時長的影響明顯，進而可以看出基因轉(zhuǎn)移并不是代謝差異的主要原因。目前，對于大豆的研究以代謝組學為主[35]，對于其基因表達情況并沒有深入的研究，而相關(guān)報道也反映了僅僅從代謝組學數(shù)據(jù)的差異不能判斷出基因轉(zhuǎn)移對生物體影響的問題，意味著多組學分析的必要性。

2.4小麥

Gregersen等[51]從轉(zhuǎn)錄組角度比較分析了植酸酶高表達轉(zhuǎn)基因小麥在籽粒發(fā)育過程中的基因轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小麥差異表達的基因數(shù)目很少，不足以產(chǎn)生預期效應。Baudo等[52]選取的材料為品質(zhì)改良型轉(zhuǎn)基因小麥，其胚乳與葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和其親本的相應位置相比只有6個基因差異，但是在親本和另一株非轉(zhuǎn)基因水稻之間卻發(fā)現(xiàn)了最多有527個基因差異，進一步分析還表明該株非轉(zhuǎn)基因水稻與轉(zhuǎn)基因組的轉(zhuǎn)錄組也具有最多154個基因的差異，從而說明基因轉(zhuǎn)移對生物體的影響小于物種之間的差異。Baker等[53]也利用相同的轉(zhuǎn)基因小麥進行代謝組學分析，分析出極性代謝物的一些由環(huán)境引起的差異，且親本之間體現(xiàn)出更大的差異。

小麥雖然是全球主要糧食作物之一，但是由于其重要的食用價值，國內(nèi)目前還沒有關(guān)于轉(zhuǎn)基因小麥的安全證書獲批，全球也僅有一個轉(zhuǎn)基因小麥的商業(yè)化品系[20]。而且，關(guān)于轉(zhuǎn)基因小麥的組學評價目前也處于單一組學研究階段，大多數(shù)研究者并沒有找出代謝差異與基因轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系，進一步研究多組學分析對于轉(zhuǎn)基因小麥的安全評價意義重大。

2.5馬鈴薯

Iwaki等[54]采用靶標代謝組學和非靶標代謝組學分析抗脅迫轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的代謝物，發(fā)現(xiàn)乙烯合成途徑中的副產(chǎn)物——谷胱甘肽代謝物，γ-氨基丁酸和β-氰的含量顯著升高，從而印證了插入基因的功能，自然也可說明該轉(zhuǎn)基因馬鈴薯未發(fā)現(xiàn)非期望效應。但是這個結(jié)論沒有非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯之間的對比數(shù)據(jù)。Lehesranta等[55]從轉(zhuǎn)基因馬鈴薯（W2GBSS、MAL1、SamDC）、非轉(zhuǎn)樣本及當?shù)氐鸟R鈴薯樣本的2-DE圖中分析出差異蛋白，同樣得到了非轉(zhuǎn)樣本組之間的蛋白差異比轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因之間差異大的結(jié)論。Defernez[56]和Shepherd[57]等也分別用代謝組學和成分分析證明了這一現(xiàn)象，即種間差異比基因轉(zhuǎn)移帶來的差異大。同時，關(guān)于轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究還發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，由于馬鈴薯的無性變異現(xiàn)象較為明顯，在分析組織培養(yǎng)的塊莖和轉(zhuǎn)空載質(zhì)粒的塊莖時發(fā)現(xiàn)其組學層面存在較大差異，由此推斷體細胞無性變異可能也是造成這些差異的原因之一[58]。此外，保存時間也是影響轉(zhuǎn)基因馬鈴薯代謝物差異的原因之一[59]。

Kondrák等[60]首次在轉(zhuǎn)錄組和代謝組兩個層面評價轉(zhuǎn)抗旱基因馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)了57個受到調(diào)控的基因，其中有與抗旱性狀和淀粉合成途徑密切相關(guān)的，而脯氨酸等與抗旱通路有關(guān)的代謝物在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中均含量提高。但是，僅僅通過轉(zhuǎn)錄RNA和代謝物的水平很難完整找到一條受調(diào)控的通路，基因表達和代謝物之間的調(diào)控并沒有明確的對應關(guān)系可能是該評價方法的缺陷之一。

2.6番茄

番茄是全球廣泛食用的作物之一，對其的改造主要在于延緩軟化，后熟，也有一些抗蟲抗病的性狀?，F(xiàn)階段番茄的基因修飾主要在于提高番茄的品質(zhì)，又鑒于番茄主要為人所食用，必須探明番茄的基因修飾對生物體生命活動產(chǎn)生的影響。Noteborn等[61]最早對轉(zhuǎn)cry1Ab5抗蟲番茄進行代謝物評價，他利用NMR分析轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)樣本的代謝化合物，沒有看到顯著性差異。Roessner-Tunali等[62]在前者基礎上從代謝組層面分析超表達己糖激酶的轉(zhuǎn)基因番茄，通過不同生長階段的番茄不同組織的代謝組數(shù)據(jù)能夠發(fā)現(xiàn)，隨著番茄的生長其代謝物的差異逐漸縮小，且轉(zhuǎn)基因番茄較非轉(zhuǎn)基因樣品己糖激酶的活性提高。le Gall等[63]利用NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)超表達轉(zhuǎn)錄因子LC和C1轉(zhuǎn)基因番茄除了其預期效應之外還有至少15種化合物含量不同，然而它們都在植物自然生長的變異范圍內(nèi)；Long等[64]嘗試通過LC-MS探究類胡蘿卜素和黃酮合成通路的調(diào)控是否會影響其他次級代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其他次級代謝產(chǎn)物并沒有明顯變化；Nicoletti等[65]也發(fā)現(xiàn)了關(guān)于轉(zhuǎn)基因番茄類似的結(jié)論。

由于代謝組學研究方法沒有固定的標準，不同方法會存在一些差異。Kusano等[66]嘗試結(jié)合CE-MS、GC-MS、LC-MS 3個代謝組學分析平臺分析神秘果蛋白超表達轉(zhuǎn)基因番茄7C和56B。3個平臺共同鑒定到了超過175種代謝物，已經(jīng)涵蓋了LycoCyc數(shù)據(jù)庫的85%，而如此多的代謝物相互比較的結(jié)果也證實了轉(zhuǎn)基因番茄的安全性。

3 轉(zhuǎn)基因食品組學分析技術(shù)的評價與思考

3.1組學評價技術(shù)實驗設計

由世界主要轉(zhuǎn)基因糧食作物的組學評價情況可以看到轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)育種的作物相比是實質(zhì)等同的。在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組兩個層面上轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組除了插入基因表達之外沒有顯著差異，而代謝組的數(shù)據(jù)由于實驗方法和樣本選取等問題比較復雜，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因組雖有差異，但除了基因插入帶來的差異之外其余的變化在合理范圍內(nèi)。從3種組學方法分析結(jié)果來看，基因轉(zhuǎn)移對生物體帶來的影響不如傳統(tǒng)物種之間的差異明顯，甚至不如不同生長情況下的相同樣本差異顯著，且樣本選取部位、實驗方法都會改變遺傳信息傳遞過程，基因轉(zhuǎn)移的影響就被相應縮小。因此，利用組學評價技術(shù)與傳統(tǒng)安全評價的方法相結(jié)合，在非期望效應方面加以佐證，能夠更好的評價轉(zhuǎn)基因食品的安全性[67]。

從現(xiàn)有研究者的組學數(shù)據(jù)來看，轉(zhuǎn)基因組學評價在一些實驗設計方面還存在明顯的矛盾點。組學研究所具有的非靶標性決定了組學實驗設計之初的無目的性，因此在組學實驗中很容易帶來偏見，研究者在分析數(shù)據(jù)時不容易發(fā)現(xiàn)想要發(fā)現(xiàn)的，這在一定程度上就削弱了組學技術(shù)本身的優(yōu)勢[68]；采用非靶標的組學分析方法能夠相應減弱偏見帶來的影響，但就忽視了組學存在之初的優(yōu)越性；通過增大數(shù)據(jù)量可以減少樣本帶來的影響，但也會更容易產(chǎn)生偏差性結(jié)論，從而沒有找到生物體在代謝過程中發(fā)生變化的前因后果。因此在設計組學評價實驗時合理的處理這三方面矛盾是數(shù)據(jù)真實可靠的關(guān)鍵。除此之外，在實驗設計時還存在一個統(tǒng)計學誤區(qū)：大量的測量數(shù)據(jù)能夠彌補少量樣本帶來的誤差。然而從實驗結(jié)果看，同一物種的組學數(shù)據(jù)也可能存在很大差異[69]，少量樣本的大量數(shù)據(jù)雖然可以使顯著性檢驗P值足夠小，但其造成假陽性的概率（false-positive-report probability，F(xiàn)PRP）同樣很大，這是因為FPRP同樣受到先驗概率的影響[70-71]。先驗概率指的是根據(jù)正式的推理和觀測值所得的概率，在轉(zhuǎn)基因組學分析上，提高檢測樣本的數(shù)量是保證先驗概率高的前提，所以在組學實驗設計之初就需要對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因樣品的數(shù)量有所要求。

3.2樣本選取

不但樣本的數(shù)量會影響組學分析結(jié)果，樣本的生長情況同樣影響實驗結(jié)果。同一種植物在不同時間不同地點種植的情況會有不同，而研究者發(fā)現(xiàn)這些情況造成的差異比基因插入帶來的差異要大[72]。因此進行實驗的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣本一定要嚴格挑選。最理想的情況就是選擇轉(zhuǎn)基因作物的親本作為陰性對照，且兩者的生長狀況要保持一致。如果親本樣品不好獲取，就應該選擇近等基因系的對應作物[18]。而像MON810轉(zhuǎn)基因玉米的情況則更為復雜一些，多代育種造成的自交與回交問題使得找尋合適的陰性對照較為困難，因此研究者在開展組學分析時也要自己分析下所選樣本的性質(zhì)。

傳統(tǒng)的育種方法一直以來都被認為是安全的方法，然而環(huán)境變化對這些植物造成的影響同樣尚未知曉，將這些影響和基因插入帶來的影響混在一起就會對組學分析結(jié)果帶來影響。因此必須尋找相同生長狀況下的轉(zhuǎn)基因樣品和陰性對照[73]。此外，采用組織培養(yǎng)和田間耕種，采用葉片和塊莖得到的組學數(shù)據(jù)可能會有差異，甚至基因工程上游工程可能帶來的問題都會影響轉(zhuǎn)基因安全評價工作，這也是樣本選擇時需要注意的一個問題。

3.3 分析方法

目前我國關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的安全評價主要是依照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）和國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）提供的指南，對轉(zhuǎn)基因食品進行營養(yǎng)成分分析，對毒理性和過敏性等方面進行評價，主要針對的是50～150 種化合物[74]。代謝組學技術(shù)能夠分析大約幾百種化合物的成分，其中某些物質(zhì)是極其微量且在不同物種或不同生長環(huán)境的同一物種之間差異較大。然而這并不是說組學技術(shù)將代替原有的評價方法。目前常用的評價方法包括成分分析、動物營養(yǎng)及毒理學評價等，它們的一個突出特點就是靶標，評價體系的建立就是根據(jù)基因插入預期的變化才進行的；而組學分析是一種非靶標技術(shù)，它追求的是生物體某一層面物質(zhì)的總和，從這些變化的物質(zhì)中找出對應的通路進行研究，因此二者是有區(qū)別的。當然，利用常規(guī)的成分分析方法增加分析的范圍也可以完成組學分析能夠做的工作[75-76]。但是，正如3.1節(jié)中所述的一樣，關(guān)于如何使用組學技術(shù)是一個矛盾的問題，組學技術(shù)也可以針對預期可能的變化設計思路進行轉(zhuǎn)基因食品的安全評價，同時它也可以進行大數(shù)據(jù)分析發(fā)掘非期望效應。因此，如何正確的利用組學分析技術(shù)為轉(zhuǎn)基因食品的評價服務是研究者需要考慮的一個重要問題。

此外，同樣的材料利用不同代謝組學方法得到的結(jié)果出現(xiàn)顯著差別也意味著分析方法選擇的復雜性[29]。同時如第2節(jié)中分析的一樣，單一組學對研究生物體代謝規(guī)律方面也存在局限性，對于轉(zhuǎn)基因作物評價的理想結(jié)果是找出一條從基因表達到代謝物均受到調(diào)控的代謝通路，如果從單一組學的數(shù)據(jù)分析會造成差異不統(tǒng)一的問題，從代謝物能夠明顯看到化合物對生物體的影響，但也很難看清遺傳信息在受體內(nèi)的變化情況，因此從多組學角度分析轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)和代謝物的差異能夠全面的分析差異，找出規(guī)律，這也使得多組學分析顯得更有意義。

4 結(jié) 語

轉(zhuǎn)基因安全評價是當今社會的一個熱門話題，其是否安全，如何判斷安全也是一個爭議話題。傳統(tǒng)分析方法在非期望效應方面的缺陷讓組學技術(shù)逐漸應用到安全評價中。雖然將這一體系應用到標準評價方法中還存在一些難度，但從科學研究角度來說，組學技術(shù)能夠很好的完成安全評價的工作。根據(jù)實際分析的需求，未來的轉(zhuǎn)基因食品組學分析需要多組學結(jié)合分析，找出影響顯著的代謝通路，形成從基因表達到代謝物方面的整體變化，才能真正了解基因轉(zhuǎn)移對生物帶來的影響，進而，轉(zhuǎn)基因食品的安全問題也能得到很好的印證。轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了近30a，基因轉(zhuǎn)入也由原來的抗蟲、抗除草劑、抗逆性狀發(fā)展到品質(zhì)改良型，民眾更加關(guān)心新產(chǎn)品的食用問題，如人們熟知的“黃金大米”。組學的應用自始至終都是一個矛盾問題，合理選擇設計分析方法會更加客觀全面的確定基因轉(zhuǎn)移對生物體造成的影響，轉(zhuǎn)基因食品的安全性也會得到更為確切的證明。

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Recent Progress in “Omics” Technologies for Safety Assessment of Genetically Modified Crops

WANG Chenguang1,2, XU Wentao2,3, ZHU Pengyu2, FU Wei1,*
(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. The Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

Transgenic technology has attracted worldwide attention, and genetically modified (GM) crops are related to human health and ecological environment. Therefore, the safety assessment of GM crops is of vital importance, and various evaluation methods have been developed and constantly improved. It is particularly noted that “omics” technologies have provided new ideas for the safety assessment of GM crops. This paper discusses the necessity and history of the development of “omics” technologies and reviews the current status and future trends of the leading “omics” technologies for the safety assessment of GM crops in order to provide new directions for GM crop safety assessment.

genetically modified crops;“omics” analysis; “omics”strategy; multi-omics analysis technology

TS201.6

1002-6630（2015）17-0288-08

10.7506/spkx1002-6630-201517053

2014-12-03

科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08012-001）

王晨光（1991—），男，碩士研究生，研究方向為轉(zhuǎn)基因食品分析與檢測技術(shù)。E-mail：italy10.wang@gmail.com

*通信作者：付偉（1983—），女，副研究員，博士，研究方向為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評價。E-mail： fuwei0212@163.com