肖俊 徐旸 鄭潔瑩 劉利群 馮浩

摘要卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）編碼的G蛋白偶聯(lián)受體（vGPCR）是病毒致瘤蛋白，能夠促使宿主血管增生以及腫瘤發(fā)生.本研究采用顯微注射法將vGPCR基因?qū)雴渭?xì)胞期斑馬魚(yú)受精卵；利用形態(tài)學(xué)觀察、RTPCR、血管生成定量分析和血管染色法分析vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯影響，但能導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎腸下靜脈血管形態(tài)產(chǎn)生畸形.本研究首次表明斑馬魚(yú)能夠成為vGPCR致病機(jī)理研究的模式生物.

關(guān)鍵詞vGPCR；斑馬魚(yú)；血管生成

中圖分類(lèi)號(hào)R7322；R51291文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002537（2015）01001706

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposis sarcomaassociated herpesvirus， KSHV）又名人類(lèi)第8型皰疹病毒（HHV8），是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤病毒，隸屬于γ皰疹病毒.KHSV是卡波氏肉瘤（KS）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）和多中心性巨大淋巴結(jié)增生癥（MCD）的直接病因[13]. KSHV為DNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約165～170 kb， 編碼 80個(gè)以上的病毒多肽.KSHV編碼的諸多病毒蛋白能調(diào)節(jié)宿主炎癥反應(yīng)、促進(jìn)宿主血管增生或腫瘤發(fā)生， 其中G蛋白偶聯(lián)受體（vGPCR或ORF74）就是典型代表之一[4].

vGPCR是持續(xù)活化的受體，即vGPCR不管是否同配體結(jié)合都能夠激活下游信號(hào)通道；然而配體的結(jié)合也能夠調(diào)節(jié)vGPCR介導(dǎo)的信號(hào)通道，諸如：GROα上調(diào)、IP10抑制其信號(hào)傳導(dǎo).vGPCR的表達(dá)能夠激活多個(gè)信號(hào)通路和諸多轉(zhuǎn)錄因子，從而增強(qiáng)促炎癥細(xì)胞因子和血管生成細(xì)胞因子的產(chǎn)生，諸如：GROα、人類(lèi)白細(xì)胞介素8受體（IL8）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等.vGPCR是KSHV中被確認(rèn)的癌基因，其在裸鼠中的表達(dá)能夠引起腫瘤發(fā)生，vGPCR轉(zhuǎn)基因小鼠也能夠形成類(lèi)似人類(lèi)KS的病變[57].

在人類(lèi)疾病研究中較常采用的模型為小鼠，然而由于小鼠自身的生物學(xué)特性，其在疾病研究中存在操作較復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)等局限性.斑馬魚(yú)較其他脊椎動(dòng)物模型相比具有許多優(yōu)勢(shì)，諸如懷卵量大、胚胎透明和胚胎生長(zhǎng)發(fā)育快等.隨著對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的遺傳學(xué)修飾技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善，利用斑馬魚(yú)建立人類(lèi)疾病研究模型逐步成為新的研究熱點(diǎn)[89].現(xiàn)已成功建立的斑馬魚(yú)腫瘤研究模型有黑色素瘤模型和白血病模型等[1011].除腫瘤研究外，斑馬魚(yú)已成功應(yīng)用于造血系統(tǒng)疾病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼相關(guān)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥物成癮等方面的研究[12]，然而，有關(guān)以斑馬魚(yú)為模型來(lái)探究人類(lèi)病毒致病機(jī)理的報(bào)道卻十分罕見(jiàn).

卡波氏肉瘤（KS）是一種KSHV感染導(dǎo)致的血管增生腫瘤，研究KS中血管增生過(guò)程并在其基礎(chǔ)上研制抑制新生血管生成的方法有可能是防治KS的有效手段之一.斑馬魚(yú)血管系統(tǒng)與高等脊椎動(dòng)物血管系統(tǒng)具有一定相似性，斑馬魚(yú)腫瘤病變中也存在血管扭曲、形態(tài)不規(guī)則及管壁厚度改變等現(xiàn)象.雖然斑馬魚(yú)是一種理想的血管疾病研究模型，有關(guān)采用斑馬魚(yú)對(duì)KSHV致病機(jī)理進(jìn)行研究尚無(wú)報(bào)道.

本研究首次以斑馬魚(yú)為模型，采用顯微注射的方式將vGPCR基因?qū)氚唏R魚(yú)單細(xì)胞期受精卵，探究vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育尤其是胚胎血管發(fā)育的影響.研究結(jié)果表明vGPCR能在斑馬魚(yú)胚胎中表達(dá)，且對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期形態(tài)發(fā)育和胚胎血管生成總量無(wú)明顯影響，但能導(dǎo)致注射后72 h幼魚(yú)腸下靜脈血管形態(tài)產(chǎn)生畸形.這也證明了斑馬魚(yú)可以成為KSHV致病機(jī)制研究的模式生物.

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

本研究所用AB系斑馬魚(yú)購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心；pCDHCMVMCSEF1copGFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；抗HA單抗（HA3663），氮藍(lán)四唑（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）， 5溴4氯3吲哚基磷酸鹽（5bromo4chloro3indolylphosphate，BCIP） 和苯硫脲（Phenylthiourea，PTU）購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自BioRad公司；PNPP底物試劑盒購(gòu)自Thermo Scientfic公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Total RNA提取及cDNA合成試劑盒購(gòu)自Promega公司.

1.2顯微注射載體的構(gòu)建

以pcDNA5/FRT/TOHAvGPCR為模板，利用PCR方法擴(kuò)增HAvGPCR的DNA片段[4]，回收后將其與空載體pCDHCMVMCSEF1copGFP同時(shí)進(jìn)行XbaI和NotI雙酶切，再用T4連接酶連接，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定，構(gòu)建成pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP載體.

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及蛋白印跡

HEK293T細(xì)胞保存于本實(shí)驗(yàn)室，使用含10%胎牛血清、5 mmol/L L谷氨酰胺、100單位/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將目的載體pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組.轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，提取總蛋白， 10%SDSPAGE凝膠電泳分離目的蛋白.以AntiHA為一抗（稀釋比例1∶2 000）對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，使用ECL反應(yīng)液對(duì)目的帶顯色.

1.4顯微注射

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)循環(huán)水裝置中，水恒溫28.5 ℃，14 h/10 h光暗周期，每日喂食3次.產(chǎn)卵前一日取野生型斑馬魚(yú)按照雌雄比1∶2的比例放于產(chǎn)卵器內(nèi)，隔開(kāi)并遮光過(guò)夜.第二日清晨給予光照并使雌雄魚(yú)交配，每對(duì)魚(yú)可產(chǎn)100～150顆卵.收集魚(yú)卵，用曝氣水清洗后平均分為兩組用于顯微注射.

將受精卵分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，當(dāng)受精卵發(fā)育至1細(xì)胞期時(shí)，在體視顯微鏡下采用顯微注射儀將質(zhì)粒注射至受精卵動(dòng)物極.實(shí)驗(yàn)組注射pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP質(zhì)粒，對(duì)照組注射pCDHCMVMCSEF1copGFP空載體，每個(gè)受精卵注射約2 nL質(zhì)粒（濃度為100 ng/μL）.經(jīng)過(guò)注射的胚胎置于28.5 ℃培養(yǎng)，注射后22 h添加苯硫脲（PTU）至濃度為0.2 mmol/L，以防止胚胎黑色素形成.

1.5胚胎觀察

顯微注射后，在28.5℃環(huán)境下持續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組受精卵形態(tài)發(fā)育及綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)胚胎存活率、熒光表達(dá)率，拍照并篩選出表達(dá)熒光蛋白的斑馬魚(yú)胚胎作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料.

1.6RTPCR

注射約72 h后，分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組已出膜斑馬魚(yú)幼魚(yú)用Trizol試劑提取總RNA后使用DNase I在37 ℃條件消化1 h，RTPCR檢測(cè)vGPCR在斑馬魚(yú)胚胎中的轉(zhuǎn)錄水平.引物Pa（ATGGCGGCCGAGGATTTC）位于vGPCR基因編碼區(qū)5′端，Pb （CTACGTGGTGGCGCCGG） 位于vGPCR基因編碼區(qū)3′端.選取βactin作為內(nèi)參基因，引物AF（CATGTTCGAGACCTT）和AR（AGGCAGCTCATAGCT）來(lái)擴(kuò)增350 bp的βactin片段.

1.7血管生成檢測(cè)

整胚內(nèi)源性堿性磷酸酶（Endogenous alkaline phosphatase， EAP）定量分析：選取24 hpf和72 hpf的胚胎進(jìn)行堿性磷酸酶定量分析，測(cè)定血管生成量[13].

血管染色：選取72 hpf的胚胎使用NBT與BCIP染液進(jìn)行血管染色[14]并采集圖像進(jìn)行分析.

1.8數(shù)據(jù)處理

分別統(tǒng)計(jì)25次顯微注射重復(fù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組胚胎的存活數(shù)目、GFP表達(dá)數(shù)目及血管發(fā)育畸形的胚胎數(shù)目，并計(jì)算存活率、GFP表達(dá)率和血管發(fā)育畸形率.數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（oneway ANOVA）進(jìn)行比較.

2結(jié)果

2.1vGPCR表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HAvGPCR并將其插入pCDHCMVMCSEF1copGFP的XbaⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)之間，酶切、測(cè)序鑒定證明vGPCR序列已正確插入（圖1A）.采用vGPCR表達(dá)載體pCDHCMVHAvGPCRcopGFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取全細(xì)胞蛋白并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡雜交.結(jié)果顯示在37～47 kD附近出現(xiàn)特異性目的條帶，表明CDHvGPCRcopGFP在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)vGPCR蛋白（圖1B）.

2.2vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯影響

顯微注射后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎置于28.5 ℃培養(yǎng)，在熒光倒置顯微鏡下觀察胚胎各時(shí)期的發(fā)育情況 （圖2，彩圖見(jiàn)封三）.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎均可最早在囊胚期（約受精后6 h）檢測(cè)到綠色熒光蛋白copGFP的表達(dá)，并且GFP可持續(xù)強(qiáng)烈表達(dá)至胚胎出膜（72 hpf）.GFP幾乎在整個(gè)胚胎中都有表達(dá)，包括頭部、軀干和卵黃囊.從開(kāi)始注射到72 hpf過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組胚胎與對(duì)照組胚胎發(fā)育進(jìn)程基本同步且形態(tài)發(fā)育均正常.

分別收集實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（72 hpf）中表達(dá)綠色熒光蛋白的胚胎，每30個(gè)胚胎為一組提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA并采用Pa和Pb引物對(duì)vGPCR基因在斑馬魚(yú)胚胎中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè).實(shí)驗(yàn)組RTPCR擴(kuò)增出大小約為1 000 bp的目的條帶，符合預(yù)計(jì)的vGPCR擴(kuò)增結(jié)果；將該條帶進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組RTPCR擴(kuò)增所得為vGPCR片段（圖3）.

本研究共進(jìn)行了25次顯微注射實(shí)驗(yàn)，有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：顯微注射后，實(shí)驗(yàn)組平均存活率為5080%，對(duì)照組平均存活率為55.02%（n=25，P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存活胚胎中平均GFP表達(dá)率分別為53.58%和48.16%（n=25，P>0.05）（表1）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在存活率及熒光表達(dá)程度上均不存在顯著性差異.顯微注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯影響.

2.3vGPCR影響斑馬魚(yú)胚胎血管發(fā)育

斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育時(shí)期（0～72 hpf）血管的生成量可以通過(guò)測(cè)量胚胎內(nèi)源性堿性磷酸酶的含量來(lái)進(jìn)行檢測(cè).斑馬魚(yú)胚胎在24 hpf時(shí)背主動(dòng)脈、腹主靜脈等主要血管已經(jīng)形成，在72 hpf時(shí)腸下靜脈等血管已經(jīng)生成.在24 hpf和72 hpf兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集發(fā)綠色熒光的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎，以20顆為一組進(jìn)行EAP定量檢測(cè).反應(yīng)產(chǎn)物在405 nm處的吸光值，可以反映胚胎內(nèi)源性堿性磷酸酶的含量.24 hpf實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的測(cè)量值分別為0.285與0.260， 72 hpf實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的測(cè)量值分別為0.997與1.011，這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組胚胎內(nèi)源性堿性磷酸酶含量均相差不大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射vGPCR質(zhì)粒的胚胎和注射對(duì)照空載體的胚胎在血管生成總量上并無(wú)太大區(qū)別（圖4）.

在72 hpf時(shí)分別收集發(fā)綠色熒光的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎，采用NBT和BCIP為染色劑對(duì)斑馬魚(yú)胚胎血管進(jìn)行染色，可清楚直觀地觀察斑馬魚(yú)胚胎血管的生成情況.結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組約有28%的胚胎（圖5）在注射vGPCR基因后，腸下靜脈（Subintestinal Vein，SIV）出現(xiàn)了形狀扭曲與血管排布紊亂，而對(duì)照組SIV則正常（圖6）.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血管畸形率具有顯著性差異，說(shuō)明vGPCR的表達(dá)影響斑馬魚(yú)胚胎血管的形狀和排布.

3討論

卡波氏肉瘤（KS）是與艾滋病相關(guān)的惡性腫瘤，也是艾滋病致死的主要原因之一.KSHV是KS的直接病因，vGPCR是KSHV編碼的病毒癌基因，其表達(dá)能夠促進(jìn)血管增生并導(dǎo)致腫瘤形成.斑馬魚(yú)具有早期胚胎體外發(fā)育、透明和幾乎所有血管可視化等特點(diǎn)，使其成為研究血管發(fā)生理想的活體模型，但目前尚未見(jiàn)其用于KSHV及其病毒蛋白研究的相關(guān)報(bào)道.

為了探究斑馬魚(yú)能否成為研究KSHV及其病毒蛋白的新模型，本文以CDHCMVMCSEF1copGFP載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了vGPCR的重組熒光表達(dá)載體CDHCMVvGPCREF1copGFP.采用顯微注射技術(shù)將vGPCR重組質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚(yú)單細(xì)胞期受精卵后，能夠用熒光顯微鏡觀察到GFP在胚胎的表達(dá)； RTPCR結(jié)果證明了vGPCR在斑馬魚(yú)體內(nèi)的mRNA轉(zhuǎn)錄，這些均說(shuō)明vGPCR重組質(zhì)粒在斑馬魚(yú)胚胎中得到成功表達(dá).實(shí)驗(yàn)組RTPCR擴(kuò)增vGPCR條帶較微弱說(shuō)明vGPCR在斑馬魚(yú)胚胎中的mRNA水平較低，本工作組曾嘗試冰凍切片和原位雜交法檢測(cè)vGPCR在斑馬魚(yú)胚胎中的蛋白表達(dá)，但由于vGPCR表達(dá)水平過(guò)低而無(wú)法鑒定，這些都符合之前的相關(guān)報(bào)道： vGPCR是KHSV中裂解表達(dá)基因，具有持續(xù)活化的特性，其持續(xù)表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有毒性.因而，vGPCR在KS組織中表達(dá)水平較弱，且只有少數(shù)KS細(xì)胞表達(dá)vGPCR；表達(dá)vGPCR的KS細(xì)胞通過(guò)旁分泌的形式來(lái)誘導(dǎo)周?chē)?xì)胞增生和導(dǎo)致腫瘤發(fā)生.與此同時(shí)，KSHV也進(jìn)化形成了諸多方式抑制vGPCR的表達(dá)來(lái)確保KSHV的潛伏感染和致病性，諸如KSHV編碼的膜蛋白K7可以結(jié)合vGPCR并誘導(dǎo)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的快速降解，從而削弱vGPCR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)和致瘤性[4].

顯微注射后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎在存活率及熒光表達(dá)程度上無(wú)太大區(qū)別；實(shí)時(shí)跟蹤觀察結(jié)果表明vGPCR對(duì)斑馬魚(yú)早期胚胎形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯影響.vGPCR的表達(dá)能促進(jìn)血管增生和腫瘤發(fā)生，本文采用堿性磷酸酶定量法檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎血管生成情況，結(jié)果表明vGPCR的表達(dá)并未導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎血管生成量增加.

堿性磷酸酶血管染色的結(jié)果表明，注射vGPCR基因（發(fā)綠色熒光）的實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)胚胎中，有28%的胚胎腸下靜脈（SIV）出現(xiàn)了形狀扭曲與血管排布紊亂，而注射空載體的對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎沒(méi)有出現(xiàn)此現(xiàn)象.考慮到CDHCMVMCSEF1copGFP中目的基因vGPCR和copGFP是分別位于不同的啟動(dòng)子即CMV及EF1之后，28%的比例應(yīng)該是比較高的.因此該實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明vGPCR在斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎新生血管的形成具有致畸作用.

有研究表明將血管生成相關(guān)的因子FGF2（fibroblast growth factor）或VEGF（vascular endothelial growth factor）注射到斑馬魚(yú)受精卵中，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)胚胎（48hpf）腸下靜脈血管（SIV）有增生和畸形的現(xiàn)象[15].血管生成抑制性藥物如SU5416和TNP470能夠抑制腫瘤中血管的生成，使用SU5416或TNP470浸泡斑馬魚(yú)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎SIV的生成得到了明顯的抑制[14].與此同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)采用注射morpholino至斑馬魚(yú)受精卵來(lái)敲降其內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VGFR2/flk1時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎（48 hpf）SIV出現(xiàn)畸形[16].這些研究結(jié)果均表明斑馬魚(yú)血管生成模型是研究腫瘤及血管系統(tǒng)的良好平臺(tái).KSHV是血管增生腫瘤KS的直接病因，本文將KSHV中致癌基因vGPCR導(dǎo)入斑馬魚(yú)受精卵，導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎（72 hpf）腸下靜脈血管（SIV）出現(xiàn)畸形，證明斑馬魚(yú)可以成為研究vGPCR甚至KSHV致病機(jī)理的有效模式生物.

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)血管的增生，腫瘤組織中血管生成過(guò)程受到一系列因子的調(diào)控.Notch信號(hào)通路中的Delta配體（Deltalike ligand 4/DLL4）在血管生成過(guò)程中具有有重要作用.研究者注射microRNA30靶向抑制斑馬魚(yú)胚胎中DLL4的表達(dá)，導(dǎo)致斑馬魚(yú)節(jié)間血管（intersegmental vessel， ISV）出芽、分枝等畸形現(xiàn)象[17].KSHV感染后的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（lymphatic endothelial cells /LECs）中DLL4的表達(dá)明顯增強(qiáng)，其原因主要在于vGPCR經(jīng)由ERK信號(hào)通路刺激胞內(nèi)DLL4的表達(dá)[18].這些暗示我們將來(lái)可通過(guò)分析vGPCRMAPKDLL4途徑來(lái)闡明vGPCR導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎SIV畸形的機(jī)理.

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（編輯王?。?