SLP—2基因在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對(duì)MCF—7細(xì)胞增殖的影響

謝貴娥等

摘 要 人的SLP-2基因在乳腺癌組織的高表達(dá)與病人的存活率相關(guān).為了研究SLP-2在乳腺癌中的功能，應(yīng)用免疫印記的方法檢測(cè)SLP-2在不同乳腺癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞癌化程度的增強(qiáng)其表達(dá)也增強(qiáng). 成功構(gòu)建pCMV-Myc-SLP-2重組質(zhì)粒，證明了其在MCF-7細(xì)胞的表達(dá)，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SiRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7可以抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SLP-2在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量與HER2/nue呈負(fù)相關(guān).這些結(jié)果為深入研究乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞 乳腺癌；SLP-2；免疫印記；細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2014）06-0019-05

Abstract High-level Human stomatin like protein 2 （SLP-2） expression was associated with significantly decreased survival in breast cancer. To study the function of SLP-2 in breast cancer furtherly， the expression of SLP-2 protein was detected in different breast cancer cells by western blotting， and the expression of its protein in breast cancer cells was found to increase with the increase of the degree of cancer. Recombinant plasmid pCMV-Myc-SLP-2 was successfully constructed and demonstrated that it can express well in MCF-7. The MTT assay showed that the cell proliferation was significantly inhibited after transfection of pCMV-Myc-SLP-2， the expression of SLP-2 was negatively correlated with HER2/nue in MCF-7， thus providing a useful clue to further research on the occurring and development of breast cancer.

Key words breast cancer； SLP-2； western blotting； cell proliferation

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女身體健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確[1-2].人的Stomatin like protein 2（SLP-2）基因由Wang首先從人心臟cDNA文庫(kù)中克隆，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，編碼約1.5 kb的mRNA形成含有356個(gè)氨基酸的多肽[3].該蛋白在人體組織中都有表達(dá)，其中在心臟和骨骼肌中表達(dá)較高.研究表明SLP-2在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)較高，如上皮性卵巢癌組織和食管鱗狀細(xì)胞癌組織，且有研究報(bào)道，SLP-2基因與子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)[4-6].有研究表明在乳腺癌組織中，病人的存活率與SLP-2的高表達(dá)負(fù)相關(guān)，因此在乳腺癌的發(fā)生中SLP-2基因很可能發(fā)揮著重要作用[2，7] .在本研究中，作者通過(guò)Western blotting分析SLP-2基因在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌化程度越高的細(xì)胞中SLP-2表達(dá)越高，并運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將外源SLP-2基因轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中，使之得到穩(wěn)定表達(dá)，以探討SLP-2基因在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為從乳腺癌細(xì)胞增殖周期入手來(lái)探討乳腺癌治療新途徑打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α，細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453均為本實(shí)驗(yàn)室保存， pCMV-Myc（載體）為Clontech公司產(chǎn)品；pMD18-T（vector）購(gòu)自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及EX TaqDNA聚合酶購(gòu)自Qiagen公司；各種限制性內(nèi)切酶以及T4DNA連接酶等購(gòu)自New England Biolabs公司； LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen 公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；Myc單抗和碘化丙啶（propidium iodine， PI） 為Sigma 產(chǎn)品；SLP-2多抗購(gòu)自Proteintech Group公司；anti-Myc單抗購(gòu)自Sigma 公司；GAPDH的單抗購(gòu)自Santa Cruz公司；actin的單抗購(gòu)自Boster生物公司.

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增以及重組載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中小鼠SLP-2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物， 其反向引物為5′GGTACCGTCCCCAGACTCCCTGGCC 3′正向引物為5′-GGAATTCATGGGAAATGCTGGCGCG-3′，（引物中劃線部分的堿基序列分別為Kpn I和EcoR I的酶切位點(diǎn)）.以人腦cDNA 文庫(kù)為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR， PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94 ℃×5 min； 94 ℃×30 s，60 ℃×30 s， 72 ℃×1 min， 30個(gè)循環(huán)，72 ℃×10 min結(jié)束擴(kuò)增.1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離純化PCR 產(chǎn)物， 然后先直接連接到pMD18-T載體上，再用Kpn I和EcoR I雙酶切消化、分離、純化，將純化得到的SLP-2目的片段與真核表達(dá)載體pCMV-Myc連接.酶切驗(yàn)證， 選擇鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序，確認(rèn)序列的正確性.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃及5%CO2條件下置于培養(yǎng)箱中用DMEM 完全培養(yǎng)基（補(bǔ)加10%新生牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和2 mol/L谷氨酰胺）培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453細(xì)胞.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western-blot檢測(cè) 用購(gòu)自Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑將pCMV-Myc-SLP-2 質(zhì)粒和SiRNA轉(zhuǎn)染（方法參考LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)）到MCF-7細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24～72 h，收集細(xì)胞并抽提總蛋白.取50 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-GAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別用anti-Myc單抗（1∶1 000 稀釋和SLP-2為一抗，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗IgG（1∶1 000 稀釋） 為二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影.

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 MCF-7細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染NC RNA和SiRNA后24、48和72 h，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力.實(shí)驗(yàn)分組：MCF-7細(xì)胞組、NC RNA組、SiRNA組，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上使用490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，記錄吸光度，每組3個(gè)平行孔.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以A值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）定為0.05，用SPSS 13.0軟件處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞間SLP-2的表達(dá)水平

MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453細(xì)胞株都是人乳腺癌細(xì)胞，它們的侵襲轉(zhuǎn)移能力和癌化程度按以上順序逐漸增強(qiáng).收集此3種細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白經(jīng)過(guò)Western blotting檢測(cè)內(nèi)源SLP-2的表達(dá)情況，結(jié)果表明隨著細(xì)胞癌化程度的增強(qiáng)，SLP-2表達(dá)水平也相應(yīng)增強(qiáng).GAPDH作內(nèi)參（見(jiàn)圖1）.

2.2 SLP-2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞增殖的影響與調(diào)節(jié)作用

2.2.1 Western檢測(cè)SiRNA干擾后不同時(shí)間SLP-2表達(dá)水平 為了研究SLP-2在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的作用，作者設(shè)計(jì)了SiRNA干擾SLP-2的表達(dá).用NC RNA和SiRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞組以及MCF-7細(xì)胞組（Mock），分別于24、48和72 h收細(xì)胞做Western檢測(cè)SLP-2的表達(dá)情況（如圖2）.Western結(jié)果顯示，24 h時(shí)干擾效果不太明顯，隨著時(shí)間的推移，干擾效果越來(lái)越明顯，72 h時(shí)干擾效果最好.

2.2.2 MTT檢測(cè)SLP-2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞活力的影響 分別比較NC RNA和SiRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞組以及MCF-7細(xì)胞組（Mock）的細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiRNA干擾組的吸光度低于NC RNA轉(zhuǎn)染組和MCF-7細(xì)胞組（見(jiàn)圖3），二者增殖活性比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.001），說(shuō)明SLP-2可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞活力.MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48 h效果開(kāi)始顯現(xiàn)，72 h效果最佳，與Western干擾效果相符.

2.3 SLP-2與HER2/nue相關(guān)性研究

2.3.1 SLP-2過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)檢測(cè) 以人腦cDNA 文庫(kù)為模板，用SLP-2特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得SLP-2 基因編碼區(qū)片段，1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示其分子大小與1 071 bp預(yù)期值一致， 且陰性對(duì)照中無(wú)此大小的條帶（資料未顯示）.將線性pCMV-Myc及回收的SLP-2片段以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并用氨芐青霉素篩選擴(kuò)增， 提取質(zhì)粒，用Kpn I和EcoR I 酶雙切，產(chǎn)生1 071 bp左右的DNA條帶，與預(yù)期相符（見(jiàn)圖4），說(shuō)明目的片段SLP-2已成功插入pCMV-Myc的多克隆位點(diǎn)上.

利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000將質(zhì)粒pCMV-Myc-SLP-2轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，24 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白用anti-Myc單抗進(jìn)行Western分析外源SLP-2的表達(dá).SLP-2基因編碼的天然蛋白分子含356個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為39 000，加上Myc接頭和多克隆位點(diǎn)表達(dá)的氨基酸，則大小為42 000左右.Myc單抗檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pCMV-Myc-SLP-2的細(xì)胞組應(yīng)在42 000左右有條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV-Myc組和Mock組是沒(méi)有明顯條帶的，結(jié)果與預(yù)期相符（見(jiàn)圖5），GAPDH作內(nèi)參.結(jié)果提示，利用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染的pCMV-Myc-SLP-2重組質(zhì)粒后，可在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中高表達(dá)SLP-2.

2.3.2 MCF-7細(xì)胞中SLP-2與HER2/nue基因表達(dá)量的關(guān)系 neu基因編碼一種與表皮生長(zhǎng)因子受體同源的磷酸蛋白， 具有酪氨酸激酶的活性，在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有neu基因的擴(kuò)增和過(guò)量表達(dá).為了探究乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中SLP-2與HER2/neu基因的關(guān)系，利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000分別將pCMV-Myc空載體和質(zhì)粒pCMV-Myc-SLP-2轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞，過(guò)表達(dá)SLP-2蛋白，48 h后收集細(xì)胞，Western分析SLP-2與HER2/nue基因表達(dá)量的關(guān)系.Western結(jié)果顯示：SLP-2與HER2/nue基因呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說(shuō)明在MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SLP-2可以抑制HER2/nue的表達(dá).

3 討論

SLP-2是stomatin基因家族的一員[8]，在脊椎動(dòng)物中的同源基因有兩類，分別是SLP-1和SLP-3.其中SLP-1主要分布在大腦，SLP-3是從嗅覺(jué)上皮中分離的嗅覺(jué)神經(jīng)元蛋白[9].Stomatin家族的基因都具有決定stomatin基因家族的一致氨基酸序列和N端的疏水性結(jié)構(gòu)域，這表明它們可能作為細(xì)胞骨架和離子通道之間的連接分子，從而影響通道質(zhì)膜的組織和穩(wěn)定性 [5].因?yàn)镾LP-2基因具有stomatin家族的共有氨基酸序列，而缺乏N端疏水性結(jié)構(gòu)域，所以它可能作為外周膜蛋白將其他細(xì)胞骨架蛋白與膜蛋白連接起來(lái)，調(diào)控離子通道的傳導(dǎo)等[5，10].而現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明，SLP-2基因在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，比如食管癌、宮頸鱗癌等，很可能是一種腫瘤相關(guān)蛋白[4-7，11]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SLP-2與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān) [4].而SLP-2基因在乳腺癌組織的高表達(dá)還與乳腺癌病人的存活率呈負(fù)相關(guān)性，這說(shuō)明SLP-2基因在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但其在乳腺癌中具體的作用機(jī)制還不清楚.

為了進(jìn)一步研究SLP-2基因的功能，有必要構(gòu)建其真核表達(dá)載體并檢測(cè)其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平.本文通過(guò)免疫印記的方法分析SLP-2在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)SLP-2的表達(dá)隨著乳腺癌細(xì)胞癌化程度的增高而遞增.然而，用SiRNA干擾SLP-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)24 h干擾效果很小，48 h效果顯著，72 h效果最佳，與Wang等[12-15]在食管鱗狀癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致.MTT法檢測(cè)其對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明SiRNA干擾后細(xì)胞活力受到抑制，即SLP-2可以增加細(xì)胞活力.

在探究SLP-2與HER2/neu基因的關(guān)系時(shí)，作者過(guò)表達(dá)SLP-2蛋白發(fā)現(xiàn)HER2/neu表達(dá)受抑制，SLP-2能下調(diào)HER2/neu的表達(dá).HER2/neu是一種癌基因，在多種癌細(xì)胞（ 如乳腺、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、肺、十二指腸、胃、胰、鼻咽、唾液腺等的癌變細(xì)胞） 中發(fā)現(xiàn)有neu基因的擴(kuò)增和（ 或） 過(guò)量表達(dá)[16]，成為癌癥的重要預(yù)后因子.在乳腺癌中，HER2/neu表達(dá)量與乳腺癌的轉(zhuǎn)移情況有重要相關(guān)性，曹等[2，7]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，缺少HER2/neu基因表達(dá)的情況下，SLP-2可以促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.作者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，隨著癌化程度的升高SLP-2的表達(dá)量也會(huì)上升，而在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中過(guò)表達(dá)SLP-2會(huì)使HER2/neu表達(dá)量下降，與曹等觀點(diǎn)一致.在很多癌癥中，HER2/neu表達(dá)量與癌癥轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，與病患術(shù)后5年生存率成反比，然而在乳腺癌中HER2/neu表達(dá)量與癌癥轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)，而具體的機(jī)制還不清楚，進(jìn)一步探索其機(jī)制對(duì)乳腺癌治療具有重大意義.

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（編輯 王 健）