馬艷紅，徐先良，汪軍成，任盼榮，楊 柯，2，孟亞雄，2，李葆春，3，馬小樂，2，王化俊，2

（1．甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070；2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；3．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

肌動蛋白（Actin）普遍存在于生物細(xì)胞中，是生物體中微絲的一個單節(jié)結(jié)構(gòu)，而微絲則是細(xì)胞骨架三大組成結(jié)構(gòu)之一，參與細(xì)胞內(nèi)許多很重要的生理過程，比如細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動、內(nèi)吞作用、成核作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1］，在植物的生長發(fā)育方面具有至關(guān)重要的作用。由于肌動蛋白基因是一種古老保守的蛋白，并且表達(dá)水平受環(huán)境影響很小，因而常被看作生物細(xì)胞生理過程中的管家基因，在基因表達(dá)中被廣泛用作分子內(nèi)標(biāo)［2－4］。

鹽生草（Halogeton glomer atus）為黎科鹽生草屬一年生草本鹽生植物，在我國分布于甘肅西部、青海、新疆及西藏等地區(qū)，生于海拔400～1 700 m 的山腳，在戈壁灘、沙丘荒地、礫質(zhì)荒漠、河灘及河谷階地等地帶的干旱山坡間歇性河床等地方生長比較旺盛［5－6］，地上多分枝的莖具有很強(qiáng)的防風(fēng)固沙、保持水土、耐鹽和抗旱能力，是一種典型的鹽生植物［7］。當(dāng)前，植物鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制研究的不斷深入，生物技術(shù)發(fā)展迅速以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷成熟，為通過生物技術(shù)手段提高植物耐鹽性和改良鹽堿土奠定了基礎(chǔ)。鹽生植物由于長期生長在鹽漬化土壤中，在其漫長的進(jìn)化過程中形成了一系列生理生化適應(yīng)機(jī)制，具有與非鹽生植物截然不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制［8－9］。研究發(fā)現(xiàn)鹽生草在500 mmol·L－1NaCl脅迫下生長狀況良好，鹽脅迫下可將鹽分貯存于葉片組織細(xì)胞中［10］。發(fā)掘鹽生草本身所蘊(yùn)含的、豐富的耐鹽基因資源，來改善和提高當(dāng)前作物的抗鹽性，對培育耐鹽作物新品種具有重要意義。對鹽生草Actin基因的克隆，無疑對其耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)模式研究起到重要的參考作用。

截至目前，在甜菜（Beta vul garis）、堿蓬（Suaeda salsa）、梭梭（Hal oxylon a mmodendr on）等鹽生植物中克隆到了Actin 基因片段，然而關(guān)于鹽生草Actin基因的研究還未見報道。所以，本研究擬以鹽生草葉片為材料，用RT－PCR 方法克隆得到鹽生草Actin 基因片段，并對其在根、莖、葉器官中的表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鹽生草（Hal ogeton glomer atus）種子采自甘肅省會寧縣河灘鹽堿地。Plant RNAkit（R6827－01）植物組織RNA 提取試劑盒購自O(shè)mega公司；p MD19－T 快速連接試劑盒均購自Ta Ka Ra（大連）有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker購自天根生化科技有限公司；IPTG、X－Gal、DMF、Amp及β－巰基乙醇等均為進(jìn)口分析純級試劑；樣品測序由華大基因研究院完成。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 總RNA 提取 根據(jù)Omega植物總RNA提取試劑盒操作說明提取RNA。利用Nanophoto meter Pearl微量紫外分光光度計測定RNA 樣品230、260及280 n m 的光吸收值，確定RNA 純度及濃度。

1．2．2 RT－PCR 擴(kuò)增 用Ta Ka Ra Pri meScriptⅡ1st strand c DNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到c DNA 第一鏈。根據(jù)Gen Bank中已登錄的堿蓬（Suaeda salsa），海濱堿蓬（S．mariti ma），鹽節(jié)木（Halocnemu m strobil aceum）的保守序列設(shè)計上下游引物，序列如下：

上游：5′GTGGTCGTACAACWGGTATTGTG 3′，下游：5′GAHCCTCCAATCCAGACACTG 3′。PCR 反應(yīng)體系：dd H2O 17．3μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2＋Plus）2．5μL，d NTP Mixture（各2．5 mmol·L－1）2μL，上游1μL，下游1μL，c DNA 1 μL，Ex Taq酶（5 U·L－1）0．2μL。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，32個循環(huán)，最后72℃延伸6 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

1．2．3 PCR 產(chǎn)物純化回收 擴(kuò)增產(chǎn)物均使用Ta Ka Ra Mini BEST DNA 膠回收試劑盒回收。

1．2．4 陽性克隆的篩選與鑒定 參照Ta Ka Ra p MD19－T 載體克隆試劑盒說明書，在PCR 管中建立連接體系，并且連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨之挑取白色菌落于Amp／LB 液體培養(yǎng)基中，同時挑取一個藍(lán)色菌落作為對照，37 ℃，236 rp m 振蕩培養(yǎng)過夜。第2天菌液PCR，將擴(kuò)增出目的條帶的菌液分裝保存，并且送華大基因研究院測序。

1．2．5 序列分析 序列的比對和分析分別運(yùn)用NCBI網(wǎng)站和DNAman軟件完成。

1．2．6 Actin 基因不同器官的表達(dá)特性分析 用熒光定量RT－PCR 來分析鹽生草Actin基因在不同器官的相對表達(dá)水平，具體做法如下：將8周齡大小的鹽生草植株用含200 mmol·L－1Na Cl的Hoagland營養(yǎng)液處理后取根、莖、葉用于q PCR 分析，每天更換一次營養(yǎng)液?？俁NA 的提取及c DNA 第一鏈的合成同1．2．1 及1．2．2。根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則設(shè)計引物，引物由ABI公司Pri mer Express Soft ware v 2．0 軟 件 設(shè) 計，序 列 上 游：5′－TGTTCTCAGTGGTGGTACAA－3′， 下 游：5′－GTGCCACCACCTTAATCTTC－3′。反 應(yīng) 在ABI 7300實(shí)時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，采用SYBR Green 染料法進(jìn)行相對熒光定量檢測。反應(yīng)體系：2×PCR mix （QIAGEN）10μL，Pri mer 上 游（10 μmol·L－1）1μL，下游（10μM）1μL，c DNA 1μL，dd H2O 7μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用ABI 7300實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)軟件和Excel 2003軟件。

2 結(jié)果與分析

2．1 鹽生草葉片總RNA 的提取

以鹽生草葉片為材料提取的總RNA 經(jīng)凝膠電泳檢測其完整性且其亮度比基本呈（1．5～2）∶1，可以看出28S r RNA 和18S r RNA 的條帶清晰（圖1），為了確定其值，用微量紫外分光光度計測定樣品在230、260及280 n m 處的光吸收值。結(jié)果顯示其A260／A230為1．8～2．0，A260／A280在1．9～2．1左右，表明RNA 純度較高，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 鹽生草總RNA凝膠電泳Fig．1 Total RNA of Halogeton glomer atus

2．2 RT－PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA 為模板，用特異性引物上游和下游進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測，在600 bp左右有一亮帶（圖2），符合預(yù)期產(chǎn)物大小。將目的片段純化回收后連接T 載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定為陽性克隆的菌液送測。測序結(jié)果表明該片段大小為598 bp，與RT－PCR 結(jié)果一致，表明已克隆得到該基因的核心片段。

圖2 Actin核心片段擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．2 The core fr agment PCR pr oduct of Actin

2．3 序列測定結(jié)果與分析

圖3 鹽生草Actin基因片段的核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig．3 The nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of Actin gene fragment from Halogeton glomeratus

圖4 鹽生草Actin基因氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的同源性比較Fig．4 Halogeton glomer atus Actin and other plants amino acid sequences homology comparison

測序得到的鹽生草Actin 基因序列為598 bp，編碼198個氨基酸（圖3）。運(yùn)用DNAman軟件將隨機(jī)挑選的幾種植物與鹽生草進(jìn)行氨基酸多重性比較（圖4），比較結(jié)果顯示鹽生草的保守氨基酸達(dá)176個，非保守氨基酸僅有22個，這表明克隆的鹽生草Actin基因處于高度保守區(qū)域。將此序列在Gen－Bank中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果表明，Actin 基因編碼的氨基酸與所選取的這幾種植物基因編碼的氨基酸具有較高的同源性（圖5）。其中與同科的堿蓬（Suaeda salsa）、甜菜（Beta vul garis）的同源性均達(dá)到94%。與不同科植物擬南芥（Ar abidopsis thaliana）、牽?；ǎ≒harbitis nil）、白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）、小花堿茅（Puccinellia tenuif lora）、白刺（Nitr aria tangutor u m）的氨基酸同源性亦高，均在94%以上，這幾種植物均是選自不同科的鹽生植物，但他們Actin基因氨基酸的同源性卻很高，這又進(jìn)一步說明Actin是一種高度保守的蛋白。

2．4 Actin基因不同器官的表達(dá)特性分析

利用熒光定量RT－PCR 分析從鹽生草中分離Actin基因的表達(dá)情況，鹽生草Actin基因在鹽生草植株的根、莖、葉中都有表達(dá)，且各器官的表達(dá)量結(jié)果恒定，無顯著差異（P＞0．05）（圖6），進(jìn)一步說明了克隆的Actin基因具有表達(dá)穩(wěn)定性的特點(diǎn)。

圖5 鹽生草與其他植物Actin基因氨基酸序列同源性分析Fig．5 Amino acid sequence homology analysis of Halogeton glomer atus with other plant Actin

圖6 Actin基因在植株不同器官的表達(dá)量Fig．6 Expression of Actin gene in different organs

3 討論

3．1 Actin基因是一種高度保守的管家基因

Actin基因編碼的肌動蛋白是一種在植物中普遍存在而又非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白［11］。通常，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上都具有高度的同源性和保守性，因而在研究植物生命活動過程中其作為管家基因發(fā)揮著不可替代的作用［12－14］。本試驗(yàn)克隆到的鹽生草Actin 基因片段為598 bp，與選定的這幾種植物的Actin基因編碼的氨基酸序列同源性則在94%之上，這無疑表明鹽生草Actin 基因是一種高度保守的管家基因。

3．2 鹽生草Actin基因表達(dá)穩(wěn)定

隨著植物肌動蛋白研究方法的不斷改進(jìn)提高，對其結(jié)構(gòu)與功能有了越來越多的認(rèn)識。高等植物的Actin基因編碼的肌動蛋白主要有兩類：營養(yǎng)型和生殖型，其表達(dá)具有組織特異性，并且在大部分的組織和器官至少有兩種以上的肌動蛋白異型 體 同 時 表 達(dá)［15－17］。比 如，在 擬 南 芥（Ar abidopsis thaliana）中的肌動蛋白基因超過20 個，楊樹（Popl ar）的肌動蛋白基因也不少于22 個［18］。選擇一個滿意的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同組織和器官中具有穩(wěn)定表達(dá)的特性。本研究用熒光定量RTPCR技術(shù)分析了鹽生草Actin 基因不同器官的表達(dá)模式結(jié)果表明，鹽生草Actin 基因表達(dá)穩(wěn)定，無顯著差異性。

3．3 鹽生草Actin基因是適宜的內(nèi)參基因

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最重要的一步反應(yīng)是植物肌動蛋白的動力學(xué)變化。不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白通過直接作用于肌動蛋白來改變細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞接收某些信號，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)給目標(biāo)，使所有細(xì)胞有應(yīng)答反應(yīng)［19－20］。在動物和植物細(xì)胞中，細(xì)胞骨架都是一個很主要的信號級聯(lián)放大的靶目標(biāo)，植物肌動蛋白是細(xì)胞骨架的重要組成部分［21］。鹽生草作為一種典型的鹽生植物，其自身蘊(yùn)含著豐富的耐鹽基因，具有與非鹽生植物截然不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控機(jī)制，研究鹽生草基因耐鹽調(diào)控機(jī)制及相關(guān)表達(dá)模式，內(nèi)標(biāo)參照是不可缺少的，而本試驗(yàn)研究得出的鹽生草Actin基因具有高度保守并且表達(dá)量恒定的特性，可作為內(nèi)標(biāo)參照，為下一步研究鹽生草耐鹽堿相關(guān)功能基因表達(dá)提供了內(nèi)參依據(jù)。

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