鄧一飛，徐佳敏，張文舉，鄧志瑞

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444）

匍匐剪股穎（Agrostis stolonifer a）原產(chǎn)于歐亞大陸，是最抗寒的冷季型草坪草之一。其草質(zhì)柔軟、細嫩、生長迅速、草坪優(yōu)美、觀賞性強，已被世界各國廣泛用于建植高檔觀賞型草坪和運動型草坪，如城市中心廣場、高爾夫球場的果嶺草坪和保齡球場等［1］。這類草坪建植所需用地面積較大，往往選在開采過的礦區(qū)或受過污染的土地上，另外由于本身抗性不強及日益嚴重的重金屬污染現(xiàn)狀，所以其抗重金屬脅迫能力還有待提高。

Cd因為遷移性強且極易被植物吸收并積累，已經(jīng)成為對植物毒性最強的重金屬元素之一，僅次于汞［2］。環(huán)境中Cd之所以過量主要是人為原因，從化肥和農(nóng)藥的濫用，到污水污泥的亂排亂放，這種現(xiàn)象多見于東歐，現(xiàn)在在印度等發(fā)展中國家這種現(xiàn)象越來越普遍［3－6］，近年來伴隨著采礦、冶金以及Cd處理等工業(yè)的發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)土壤受Cd污染也日趨嚴重［7］，貴陽市郊區(qū)受污染的土壤Cd含量達5.6 mg·kg－1［8］。Cd、Pb已成為南方土壤污染中常見的重金屬元素，一般土壤中的Cd、Pb含量已超過土壤正常值的3～4倍［9］。上海螞蟻浜地區(qū)受重金屬污染的土壤平均Cd含量21.4～130 mg·kg－1［10］。本研究分析重金屬Cd對匍匐剪股穎種子萌發(fā)、幼苗和植株生長的影響，旨在探究匍匐剪股穎遭受Cd脅迫的生理生態(tài)響應(yīng)，從而為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗重金屬Cd的新種質(zhì)提供量化線索［11］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

匍匐剪股穎Penn A－4 品種的成熟種子，由上海交通大學(xué)王兆龍教授惠贈［11］。

1.2 匍匐剪股穎幼苗培養(yǎng)與Cd處理

參照曾泉和徐子勤［12］、張遠兵等［13］的方法處理接種種子。先用70%酒精處理5 min，蒸餾水清洗3次，然后用10%次氯酸鈉滅菌20 min，蒸餾水清洗3次，再置于無菌蒸餾水中浸泡12 h后用消毒過的牙簽將種子每皿100粒轉(zhuǎn)移到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。用Cd Cl2·2.5 H2O 和蒸餾水配制Cd2＋濃度分別為0（CK）、50、100、200和400 mg·L－1處理液，各處理組培養(yǎng)皿分別加入上述氯化鎘溶液，每皿10 mL，每處理設(shè)5個重復(fù)，于光照培養(yǎng)箱［（25±1）℃，光照為12 h］培養(yǎng)。第7天從光照培養(yǎng)箱中取出含有發(fā)芽種子培養(yǎng)皿，倒掉內(nèi)部溶液，換用Cd2＋濃度分別與種子處理相同的1／2 Hoagland營養(yǎng)液，每皿5 mL，在同樣條件下進行光照培養(yǎng)，以后每天更換處理液。

1.3 匍匐剪股穎種子萌發(fā)率、幼苗生長生理指標測定

種子接種于培養(yǎng)皿，第7天測發(fā)芽率，發(fā)芽率＝（第7天發(fā)芽種子數(shù)／接種總數(shù)）×100%；第15天測芽長、根長和苗鮮重，第30天測定各項生理指標，超氧化物歧化酶（SOD）活力采用NBT 法，以抑制光化還原的50%為一個SOD 酶活性單位［14］；過氧化物酶（POD）活力采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為一個POD 活性單位［14］；葉綠素和丙二醛（MDA）的含量按照王學(xué)奎［15］的方法測定。

1.4 匍匐剪股穎植株培養(yǎng)與Cd處理

種子播于花盆，自然條件下生長，90 d后從土中移出長勢一致的植株，洗凈附著在根部的土，用固根器（定植籃）作支持物，用Cd2＋濃度為0、2、10、50和100 mg·L－1的1／2 Hoagland營養(yǎng)液進行溶液培養(yǎng)，每處理3個重復(fù)。處理后的0、5、10、15和20 d分別取植株的葉和根，測各項生理指標，方法同1.3。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS分析軟件，Duncan多重比較法分析處理間方差，5%水平差異［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對匍匐剪股穎種子發(fā)芽的影響

匍匐剪股穎種子發(fā)芽率隨著Cd2＋濃度的上升呈顯著下降趨勢（P＜0.05）（圖1）。當Cd2＋濃度為50 mg·L－1時，下降幅度較大，發(fā)芽率＜50%，不到CK 的1／2，說明50 mg·L－1的Cd2＋已經(jīng)對種子發(fā)芽具有較大的毒害作用。當Cd2＋濃度為100 mg·L－1時，發(fā)芽率為21%，僅為對照的1／4，400 mg·L－1的Cd2＋已經(jīng)完全抑制了種子的發(fā)芽（未計入圖），后續(xù)試驗已不再包括400 mg·L－1處理。

圖1 Cd脅迫對匍匐剪股穎種子發(fā)芽的影響Fig.1 Effects of Cd stress on creeping bentgrass seed ger mination

2.2 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗的影響

2.2.1 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗芽長、根長及苗鮮重的影響 Cd2＋對幼苗芽、根的生長都具有抑制作用（圖2）。隨著Cd2＋濃度的增加，幼苗芽長顯著減小（P＜0.05）。當Cd2＋濃度為50 mg·L－1時，平均芽長為1.71 c m，比對照低13%；當Cd2＋濃度為100 mg·L－1時，平均芽長為1.54 c m，比對照低22%；當Cd2＋濃度為200 mg·L－1時，平均芽長為1.29 c m，只有對照的65%（圖2）。當Cd2＋濃度為50 mg·L－1時，根長下降幅度較大，平均根長為0.89 c m，是對照的54%，之后的變化趨勢較為平緩（圖2），說明50 mg·L－1的Cd2＋已經(jīng)對幼苗根長的生長產(chǎn)生了較大的傷害，更高濃度的Cd2＋進一步抑制了幼苗根的生長。幼苗的鮮重具有和芽長同樣的變化趨勢。

圖2 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗芽長、根長及整體幼苗鮮重的影響Fig.2 Effects of Cd stress on shoot length，r oot length and fresh weight of creeping bentgrass seedlings

2.2.2 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗葉綠素含量的影響 隨著Cd2＋濃度的增加，匍匐剪股穎幼苗葉綠素含量呈顯著下降的趨勢（P＜0.05）（圖3）。從濃度為50 mg·L－1時開始，葉綠素含量就顯著低于對照，只有對照的58%。100和200 mg·L－1處理間差異不顯著（P＞0.05），但二者均顯著低于CK 和50 mg·L－1處理，這表明在Cd脅迫下匍匐剪股穎幼苗葉綠素含量急劇減少，會影響幼苗對光能的吸收和利用，從而影響幼苗的正常生長。

圖3 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of Cd stress on chlorophyll content of creeping bentgrass seedlings

2.2.3 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗SOD 和POD 活性的影響 隨著Cd脅迫濃度的升高，SOD 酶活性呈“拋物線”變化，在Cd2＋濃度為50 mg·L－1時，SOD 活性達到最大，為1 314 U·h－1·g－1，是對照的1.7倍，與對照差異顯著（P＜0.05）。濃度為100和200 mg·L－1Cd2＋處理的幼苗，SOD 活性較濃度為50 mg·L－1時下降，但都高于對照，分別比對照高出22%和13%（圖4）；Cd脅迫對POD活性的影響與SOD相似，活性的變化整體過程也是隨濃度的升高先上升后下降（圖4），在Cd2＋濃度為100 mg·L－1時POD活性達到最大，為225 U·s－1·g－1，是對照的2.04倍，與對照差異顯著（P＜0.05）。

2.2.4 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗MDA 含量的影響 MDA 是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量高低代表過氧化的傷害程度。匍匐剪股穎幼苗中MDA 含量隨著Cd2＋濃 度 的 增 高 而 不 斷 升 高，50、100 和200 mg·L－1的Cd2＋處理，匍匐剪股穎幼苗MDA 含量分別是對照的5、7和9倍（P＜0.05）（圖5），說明Cd脅迫強度越大，對幼苗膜系統(tǒng)的傷害作用越大。

2.3 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株部分生理指標的影響

2.3.1 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株葉綠素含量的影響 植株葉綠素含量隨著Cd脅迫時間延長整體呈下降趨勢，Cd2＋濃度越高下降幅度越大（圖6）。處理5 d時，≥10 mg·L－1的Cd2＋濃度對葉綠素含量產(chǎn)生了較大影響，在10 mg·L－1時，葉綠素含量僅約為同期對照的68%；處理20 d時，2、10、50和100 mg·L－1處理的植株葉綠素含量為同期對照的86%、71%、57%和49%（圖6）。

圖4 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗葉中SOD和POD活性的影響Fig.4 Effects of Cd stress on SOD and POD activity in creeping bentgr ass seedling leaves

圖5 Cd脅迫對匍匐剪股穎幼苗葉中MDA含量的影響Fig.5 Effects of Cd stress on MDA content in creeping bentgrass seedling leaves

2.3.2 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株SOD 和POD 活性的影響 在Cd脅迫過程中，2和10 mg·L－1的Cd2＋處理，匍匐剪股穎植株葉片SOD 活性逐漸升高，20 d時分別為同期對照的1.3和1.5倍，50和100 mg·L－1的Cd2＋處理，SOD活性在前15 d逐漸升高直到達到峰值，峰值時活性分別是同期對照的1.7和1.8倍，之后開始下降，到20 d時活性分別是峰值的86%和74%，但都高于對照（圖7）。2、10和50、100 mg·L－1的Cd2＋處理引起的根部SOD活性變化趨勢和葉片的SOD 活性變化趨勢完全一致（圖7）。

圖6 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株葉綠素含量的影響Fig.6 Effects of Cd stress on creeping bentgrass plant chlor ophyll content

Cd脅迫導(dǎo)致植株葉片的POD變化情況與SOD相 似（圖7）。在低濃度Cd2＋處 理 下（2 和10 mg·L－1），匍匐剪股穎植株葉片POD活性總體保持升高的趨勢，20 d時分別比同期對照增加了156%和100%。濃度繼續(xù)升高為50和100 mg·L－1，POD活性先上升后下降，15 d時活性最高，分別為427和480 U·s－1·g－1。到20 d時活性值下降至187和320 U·s－1·g－1，分別是同期對照的1.6和2.7倍。

Cd脅迫對根部POD 活性的影響與葉片POD活性的影響存在一定的差異（圖7）。Cd處理為10 mg·L－1時，POD 活性不再是一直升高，而是在15 d時達到峰值，為245 U·s－1·g－1，20 d 時降至192 U·s－1·g－1。50 和100 mg·L－1處理的POD 活性雖然總體變化趨勢依然是先上升后下降，但是在10 d 時已達到峰值，分別為266 和293 U·s－1·g－1，之后開始下降，20 d時分別降至149和133 U·s－1·g－1。盡管總體變化趨勢與葉片變化趨勢存在一定的差異，但是各處理POD 活性和葉片一樣，都大于對照。

2.3.3 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株MDA 含量的影響 葉片中MDA 的含量隨著Cd脅迫時間的延長不斷上升，且隨著Cd2＋濃度的增加而增多（圖8）。低濃度Cd處理（2和10 mg·L－1）下，匍匐剪股穎植株MDA 含量隨著Cd脅迫時間的延長與對照相比上升幅度并不是很大，而高濃度Cd處理（50 和1 0 0 mg·L－1）則使MDA含量增加，5 d時已經(jīng)較對照分別增加了2 和3 倍。20 d 時，各處理MDA 含量分別是同期對照的3、5、9和14倍。

圖7 Cd脅迫對匍匐剪股穎葉和根中SOD和POD活性的影響Fig.7 Effects of Cd stress on creeping bentgrass plant on SOD and POD activity

圖8 Cd脅迫對匍匐剪股穎植株葉片中MDA含量的影響Fig.8 Effects of Cd stress on MDA content in creeping bentgrass plant leaves

3 討論與結(jié)論

本試驗中，Cd2＋濃度的增加導(dǎo)致匍匍剪股穎發(fā)芽率、芽長、根長、苗鮮重下降，而且隨著Cd脅迫濃度的增加，根受到的脅迫傷害重于芽，這說明匍匐剪股穎不同器官對在Cd脅迫敏感性有差異。脅迫首先影響根系的生長和其所承擔的吸收功能，進而影響到葉片等地上部分組織。Cd對根系造成傷害，原因可能是Cd造成根尖細胞分裂受阻［16］，破壞了根系細胞結(jié)構(gòu)［17－18］，特別是造成根表皮細胞的崩解脫落，導(dǎo)致根內(nèi)層細胞的死亡，降低了根的吸收能力［19］，進而降低了根的正常生理代謝，阻礙了根系生長。

葉綠素是綠色植物光合作用的主要色素，是評價草坪草葉色和觀賞品質(zhì)的重要指標。本研究中，隨著Cd2＋濃度的增加或脅迫時間的延長，幼苗和植株葉綠素含量都呈現(xiàn)下降趨勢。Cd脅迫下葉綠素含量下降的原因可能是進入植株體內(nèi)的過量Cd抑制了葉綠素生物合成途徑中幾種酶活性，從而阻礙了葉綠素合成，或葉綠素分子中Mg2＋可被Cd2＋取代，或Cd2＋毒害產(chǎn)生過多自由基攻擊直接導(dǎo)致葉綠素分子結(jié)構(gòu)的破壞所致［13］，降解的加速和合成的減慢引起葉綠素含量降低，進而降低了植株的光合功能，導(dǎo)致植株生長緩慢，植株表現(xiàn)出矮小發(fā)黃的外部形態(tài)。

植物在新陳代謝過程中會產(chǎn)生有害物質(zhì)活性氧·O2－，·OH 等，植物體內(nèi)同樣也存在著一套清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)。正常情況下，植物細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，當植物受到外界脅迫時，體內(nèi)活性氧積累的速度就會超過清除的速度。SOD 是抗氧化系統(tǒng)中重要的成員，是清除活性氧的第一個關(guān)鍵酶［20］，POD 作為活性較高的適應(yīng)性酶，廣泛存在于植物體內(nèi)不同組織中［21］。本研究中幼苗和植株的SOD 和POD 活性在Cd脅迫下，均呈先上升后下降。Cd脅迫導(dǎo)致匍匐剪股穎體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧含量升高，抗氧化酶活性開始增加，以清除氧自由基，抵御傷害。當Cd脅迫濃度過高時，活性氧的數(shù)量超出了抗氧化酶的清除能力，導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損，機體受到傷害，抗氧化酶的合成和其自身活性也可能受到抑制，導(dǎo)致匍匍剪股穎幼苗及植株生長受阻［14］。

MDA 是細胞膜脂過氧化的末端產(chǎn)物，常被作為脂質(zhì)過氧化指標。當細胞組織受到傷害時，膜脂過氧化加劇，葉片MDA 含量增加［22］。100 mg·L－1的Cd處理使匍匍剪股穎幼苗及植株葉片中MDA 含量比對照明顯增加。其主要原因可能是Cd脅迫下，體內(nèi)活性氧大量積累，超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，最終引起膜脂的過氧化，產(chǎn)生了大量的MDA［14］。

［1］ 朱雅安，陳智勇，易自力.幾種匍匐翦股穎愈傷組織再生系統(tǒng)的建立［J］.湖南林業(yè)科技，2004，31（2）：26－27.

［2］ 趙中秋，朱永官，蔡運龍.鎘在土壤－植物系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化及其影響因素［J］.生態(tài)環(huán)境，2005，14（2）：282－286.

［3］ Kra mer U.Phytore mediation：Novel approaches to cleaning up polluted soils［J］.Current Opinion in Biotechnology，2005，16：133－141.

［4］ Liu H，Probst A，Liao B.Metal conta mination of soils and crops affected by the Chenzhou lead／zinc mine spill（Hunan，China）［J］.The Science of t he Total Environ ment，2005，339：153－166.

［5］ 崔玉靜，趙中秋，劉文菊，陳世寶，朱永官.鎘在土壤－植物人體系統(tǒng)中遷移積累及其影響因子［J］.生態(tài)學(xué)報，2003，23（10）：2133－2143.

［6］ 李靜，俞天明，周潔，謝正苗.鉛鋅礦區(qū)及周邊土壤鉛、鋅、鎘、銅的污染健康風險評價［J］.環(huán)境科學(xué)，2008，29（8）：2327－2330.

［7］ 曾詠梅，毛昆明，李永梅.土壤中鎘污染的危害及其防治對策［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，20（3）：360－365.

［8］ 王慧忠，何翠屏.土壤重金屬污染對草坪性狀影響的調(diào)查研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2003，20（1）：53－55.

［9］ 王慧忠，何翠屏.重金屬離子脅迫對草坪草根系生長及其活力的影響［J］.中國草地，2002，24（3）：55－63.

［10］ 周毅.土壤Cd對作物的影響［J］.國外農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，1986（4）：1－3.

［11］ 鄧一飛，戴佳鶯，吳雯君，張文舉，陳沁，鄧志瑞.鎘對匍匐翦股穎成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生的影響［J］.上海大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，19（6）：636－640.

［12］ 曾泉，徐子勤.幾種匍匐翦股穎成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生［J］.西北植物學(xué)報，2006，26（10）：2033－2038.

［13］ 張遠兵，劉愛榮，禹智輝，李發(fā)院.9個高羊茅品種初期生長對鎬脅迫的響應(yīng)［J］.激光生物學(xué)報，2011，20（4）：510－517.

［14］ 付正.匍匐翦股穎耐鹽性及抗壞血酸調(diào)控效果和機理研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009：63.

［15］ 王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2006：134－136，280－281.

［16］ 段昌群，王煥校.重金屬對蠶豆的細胞遺傳學(xué)毒理作用和對蠶豆根尖微核技術(shù)的探討［J］.植物學(xué)報，1995，37（1）：14－24.

［17］ 彭鳴，王煥校.鎘、鉛誘導(dǎo)的玉米幼苗細胞超微結(jié)構(gòu)的變化［J］.中國環(huán)境科學(xué)，1991，11（6）：426－431.

［18］ 袁祖麗，馬新明，韓錦峰，李春明，吳葆存.鎘污染對煙草葉片超微結(jié)構(gòu)及部分元素含量的影響［J］.生態(tài)學(xué)報，2005，25（11）：2919－2927.

［19］ Vitoria A P，Rodriguez A P M，Cunha M，Lea P J，Azevedo R A.Str uctural changes in radish seedlings exposed to cad miu m［J］.Biologia Plantar u m，2003，47（4）：561－568.

［20］ 趙中秋，席梅竹.Cd對植物的氧化脅迫機理研究進展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（增刊）：47－51.

［21］ 周希琴，莫燦坤.植物重金屬脅迫及其抗氧化系統(tǒng)［J］.新疆教育學(xué)院學(xué)報，2003，19（2）：103－108.

［22］ 金蘭，羅桂花.鹽脅迫對紫花苜宿SOD、丙二酸及SOD 同工酶的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（5）：15－16.