商 瑜，張啟明，李 悅，王瑩冰

(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875)

動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展和應(yīng)用

商 瑜，張啟明，李 悅，王瑩冰

(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875)

隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究對動物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷擴大和提高，無血清培養(yǎng)基的研制和開發(fā)已經(jīng)成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷經(jīng)了無血清來源、無動物源、無蛋白和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等四個階段，逐步使得無血清培養(yǎng)基的成分更為明確和簡單，進(jìn)一步提升了無血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)中可避免外源物污染等的優(yōu)勢，使其在生物制品和生命科學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。本文主要系統(tǒng)總結(jié)了無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程、組分構(gòu)成和優(yōu)化方法，尤其對無血清培養(yǎng)基近年來在生物制品、干細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤研究等方面的最新開發(fā)應(yīng)用進(jìn)行了扼要分析述論，以期對無血清培養(yǎng)基在生物學(xué)前沿領(lǐng)域的應(yīng)用和優(yōu)化提供可借鑒的方向，尤其在腫瘤干細(xì)胞的方面可以進(jìn)行更深入的探索。

無血清培養(yǎng)基；生物制品；細(xì)胞培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)近年來發(fā)展迅速，已經(jīng)成為生物工程領(lǐng)域中的前沿研究課題之一。其在生物制品的生產(chǎn)、腫瘤細(xì)胞的體外建模、病毒的分離鑒定和機體發(fā)育功能研究等方面均有重要應(yīng)用。通常，為了提供細(xì)胞生長所需的激素、生長因子等物質(zhì)，動物細(xì)胞是在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的。但血清成分復(fù)雜且不完全明確，批次間容易產(chǎn)生較大差異，培養(yǎng)中易發(fā)生外源物污染，并且血清本身價格也比較昂貴等；這些均使得血清在生產(chǎn)和研究中的應(yīng)用存在諸多不利。目前，已有大量實驗數(shù)據(jù)證實無血清培養(yǎng)基不僅能避免或改善含血清培養(yǎng)基所帶來的上述缺陷，也能獲得良好的培養(yǎng)效果并維持原有生物學(xué)功能[1]。歐洲替代方法研究中心科學(xué)咨詢委員會(The ECVAM Scientific Advisory Committee, ESAC)和歐洲體外毒理學(xué)會(European Society of Toxicology In vitro, ESTFV)等多個機構(gòu)組織均發(fā)表聲明，強烈建議減少細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中血清等動物源性物質(zhì)的添加，盡可能在現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域使用無血清培養(yǎng)基[2]。由此可見，無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益受到人們的關(guān)注，并逐漸成為當(dāng)今動物細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域的主流與趨勢。

1 無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程

無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，既能滿足細(xì)胞在體外長時間培養(yǎng)的要求，又能避免動物血清所帶來的不利因素。無血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程一般分為無血清培養(yǎng)基、無動物源培養(yǎng)其、無蛋白培養(yǎng)基及化學(xué)成分限定培養(yǎng)基等四類[3]。

1.1 無血清培養(yǎng)基(Serum-Free Medium, SFM)

無血清培養(yǎng)基，即為不添加動物血清。但是為了滿足細(xì)胞的生長，會添加替代血清功能的生物材料，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和動植物的提取物等。這使得此類培養(yǎng)基中含大量動植物來源蛋白，添加物質(zhì)的化學(xué)成分也不夠明確[4]。因此，會對后續(xù)處理應(yīng)用造成部分不利影響(如目標(biāo)蛋白的分離純化)，同時成本也較高。由于人們可以就實際需求對其進(jìn)行相對簡單的成分改進(jìn)，使得其應(yīng)用仍較為廣泛。

1.2 無動物源培養(yǎng)基(Animal Component Free Medium, ACFM)

此類培養(yǎng)基采用蛋白水解物、重組蛋白或其他化學(xué)物質(zhì)來取代動物源蛋白。它既可以滿足細(xì)胞生長及增殖的需要，還能夠降低培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本，提高重組蛋白類藥物安全性[5]。目前主要應(yīng)用于生物藥品的研發(fā)和生產(chǎn)中。

1.3 無蛋白培養(yǎng)基(Protein-Free Medium, PFM)

該類培養(yǎng)基完全不含有血清和動物來源的蛋白，但仍包含來源于植物蛋白的水解物或合成多肽片段等其他衍生物。由于所含蛋白極低，并且蛋白成分明確，有利于重組蛋白的下游生產(chǎn)、分離和純化，總體成本也會大幅下降[6-7]。但其通用性較差，需要針對目標(biāo)細(xì)胞株進(jìn)行特異性的優(yōu)化[8]。目前主要應(yīng)用于生命科學(xué)研究和基因工程藥物開發(fā)等領(lǐng)域。

1.4 化學(xué)成分限定培養(yǎng)基(Chemically Defined Medium, CDM)

此類培養(yǎng)基完全無血清、無蛋白，成分完全明確，可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性。它既有利于跟蹤細(xì)胞培養(yǎng)的代謝情況，在后續(xù)的分離純化中也非常方便，是目前最為安全和理想的培養(yǎng)基?？墒遣⒎撬械募?xì)胞都能在化學(xué)限定培養(yǎng)基中達(dá)到較高的表達(dá)水平，需要不斷改進(jìn)設(shè)計方案和配方[9]。

2 無血清培養(yǎng)基的組分構(gòu)成和 設(shè)計優(yōu)化

2.1 無血清培養(yǎng)基的組分構(gòu)成

無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充因子兩部分組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基通常是按一定比例的葡萄糖、氨基酸、無機鹽和維生素等組合而成的合成培養(yǎng)基，它是維持組織或細(xì)胞生長代謝必不可少的物質(zhì)。而補充因子，替代了傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的血清，既能有效避免血清帶來的諸多問題，也能滿足動物細(xì)胞培養(yǎng)的要求。補充因子根據(jù)需求的必要性一般分為必需補充因子和特殊補充因子。必需補充因子是所有細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時都需要的，包括胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白等。特殊補充因子一般含有激素、生長因子微量元素、貼壁和鋪展因子、維生素和酶抑制劑等。

2.2 無血清培養(yǎng)基的設(shè)計優(yōu)化

在無血清培養(yǎng)基的具體應(yīng)用中，可以通過選擇或優(yōu)化適當(dāng)?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基和補充因子的種類及用量，使其更符合培養(yǎng)要求。例如，細(xì)胞工程的常用細(xì)胞CHO往往是利用DMEM∶F12∶RPMI1640 (2∶1∶1)[10]或者EX-CELLTM302[11]作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而Vero的常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基則為M199、DMEM或F12等。對于補充因子，更是不斷嘗試優(yōu)化開發(fā)新的替代品。如必需補充因子中的胰島素，因其費用昂貴，目前有研究報道可利用金精三羧酸(Aurin Tricarboxylic Acid, ATA)作為胰島素替代物培養(yǎng)CHO細(xì)胞，細(xì)胞的生長正常，并極大降低了成本[11]。轉(zhuǎn)鐵蛋白是細(xì)胞無血清培養(yǎng)最重要的補充因子之一，它的缺失會抑制細(xì)胞的生長，同時它也是一些有害微量元素的螯合劑。Rourou等在研究Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基時認(rèn)為，維生素C和檸檬酸鐵混合使用可以替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，這為尋求轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品提供了參考[12]。

通常，為了更好地達(dá)到無血清培養(yǎng)基組分優(yōu)化開發(fā)，研究人員可采用培養(yǎng)過程分析法、分子生物技術(shù)法和統(tǒng)計學(xué)設(shè)計法等方法進(jìn)行系統(tǒng)分析，進(jìn)而獲得滿足目標(biāo)細(xì)胞生長要求的無血清培養(yǎng)基[13]。

2.2.1 培養(yǎng)過程分析法 培養(yǎng)過程分析法是以動態(tài)的細(xì)胞代謝為基礎(chǔ)，通過對細(xì)胞培養(yǎng)過程中各培養(yǎng)基的組分進(jìn)行實時監(jiān)測，了解細(xì)胞的生理狀態(tài)變化，根據(jù)需求調(diào)整培養(yǎng)基組分及補料策略的設(shè)計方法。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，各培養(yǎng)組分必須維持在一定水平。因此可以通過消耗組分分析法來對葡萄糖、谷氨酰胺、維生素和氨基酸等組分進(jìn)行設(shè)計；也可以通過化學(xué)計量分析法，建立培養(yǎng)基各組分與細(xì)胞能量代謝、生物量或蛋白合成量之間的化學(xué)計量函數(shù)，從而對基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基及補料策略進(jìn)行設(shè)計。

2.2.2 分子生物技術(shù)法 分子生物技術(shù)法是以基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)為依托的一種高通量的設(shè)計方法。研究人員可以應(yīng)用基因芯片、抗體芯片和雙向凝膠電泳等技術(shù)，在mRNA和蛋白水平上獲得細(xì)胞培養(yǎng)過程中關(guān)鍵基因或蛋白的變化情況，用以確定培養(yǎng)基中調(diào)控這些基因或蛋白表達(dá)的成分的添加類型和比例，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和凋亡等生理指標(biāo)[14]。

2.2.3 統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計法 統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計法是通過在培養(yǎng)基的設(shè)計、優(yōu)化及數(shù)據(jù)結(jié)果分析中運用統(tǒng)計學(xué)方法，經(jīng)濟地獲得可靠結(jié)果，并將誤差降到最低的一種設(shè)計方法。由于其省時省力，具有快速獲得大量參數(shù)的優(yōu)勢，近年來被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)及過程優(yōu)化中，并取得了卓有成效的研究成果。如2010年Jeon等人利用分式析因設(shè)計和響應(yīng)面的統(tǒng)計學(xué)方法對人細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的卵磷脂、多胺、抗氧化劑和膽固醇進(jìn)行設(shè)計優(yōu)化，最終獲得最高活細(xì)胞密度比有血清培養(yǎng)基高1.5倍的無血清培養(yǎng)基，而且其T淋巴細(xì)胞效應(yīng)功能仍然保留[15]。

3 無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用

3.1 生物制品和生物藥物研制與生產(chǎn)方面的應(yīng)用

目前，生產(chǎn)生物活性蛋白、疫苗、單克隆抗體和基因治療藥物的表達(dá)載體等生物制品時一般都采用可高密度生長的動物工程細(xì)胞。無血清培養(yǎng)技術(shù)的運用，給動物工程細(xì)胞提供了更優(yōu)的生長條件，進(jìn)而表達(dá)更多的目的產(chǎn)物，并有利于后續(xù)目的產(chǎn)物的分離和純化，顯示了其強大的優(yōu)勢。Kutsuzawa等在研究新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，無血清培養(yǎng)基較有血清培養(yǎng)基可提高大約3倍的重組蛋白產(chǎn)量，使該系統(tǒng)能更好地適用于生物制藥生產(chǎn)[16]。為避免生物制品的血清污染，Toriniwa等研究得到一種用無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)Vero細(xì)胞源乙型腦炎疫苗的方法，而且其疫苗可通過添加穩(wěn)定劑(如山梨醇或甘氨酸)，實現(xiàn)在室溫下儲存[17]。Rodrigues等利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體時發(fā)現(xiàn)，在無血清條件下培養(yǎng)，就無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基適應(yīng)性進(jìn)行了對比評價，指出相比于DEME培養(yǎng)基，EX-CELL培養(yǎng)基更有利于單克隆抗體的生產(chǎn)，這為后續(xù)單抗的研發(fā)生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)[18]。Kuroda等在研發(fā)慢病毒載體生產(chǎn)方法時，開發(fā)了培養(yǎng)人胚腎HEK 293細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，從而獲得了低成本、無批次差異且高滴度的慢病毒載體[19]。所以說，無血清培養(yǎng)基清晰明確的成分以及完善的質(zhì)控體系，使得制備生物制品和生物藥物的宿主細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中更加穩(wěn)定，產(chǎn)物表達(dá)效率更高，產(chǎn)品質(zhì)量更加安全可靠。

3.2 干細(xì)胞培養(yǎng)和研究方面的應(yīng)用

干細(xì)胞(Stem Cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，因此對其培養(yǎng)條件的質(zhì)量控制成為關(guān)鍵。目前，鑒于無血清培養(yǎng)基擁有明確成分的特性，它已被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和研究中。Swamynathan等通過體外實驗驗證MesencultTM間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基相較有血清培養(yǎng)基，完全可以為臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞提供體外大規(guī)模培養(yǎng)所需的營養(yǎng)條件；無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞保留了臨床治療所需要的干細(xì)胞特性，并且減少了因血清帶來的后續(xù)治療中的潛在危險[1]。另一方面，研究人員不斷開發(fā)新型無血清培養(yǎng)基，以提高培養(yǎng)效率或者適用于不同誘導(dǎo)分化需求。Zhang等利用含有SCF、TPO、FGF-1、ngiopoietin-like 5和IGFBP2等五種因子的無血清培養(yǎng)基可以使人臍血造血干細(xì)胞(HSC)在體外生長速度提高20倍，為臨床應(yīng)用提供培養(yǎng)條件上的支持[20]。Pick等則開發(fā)了一個無血清無滋養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)，他們利用該系統(tǒng)成功從人胚胎干細(xì)胞分化獲得可產(chǎn)生血小板樣細(xì)胞的骨髓巨核細(xì)胞，這使得人類朝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化獲得治療用人類血小板又邁進(jìn)了一大步[21]。最近研究報道，為了應(yīng)對腸道組織天然干細(xì)胞來源不足的問題，Mahmoud等開發(fā)出一種適宜腸道干細(xì)胞體外增殖的無血清培養(yǎng)基，他們添加了乙醇胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗壞血酸磷酸鹽、亞硒酸鈉和谷胱甘肽等五種補充因子[22]。該成果對于基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用均具有積極意義。

3.3 腫瘤研究方面的應(yīng)用

目前惡性腫瘤已經(jīng)成為人類健康的主要威脅之一，其相關(guān)研究是生命科學(xué)最廣泛、最活躍的領(lǐng)域。細(xì)胞培養(yǎng)是腫瘤研究最基本的實驗平臺，而無血清培養(yǎng)基為該領(lǐng)域的研究提供了有效的工具，如用于研究腫瘤細(xì)胞的生長和遷移機理的研究等[23]。最新研究顯示，利用無血清培養(yǎng)基可以從病人原位腫瘤中提取并培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞，這類細(xì)胞保留了原有腫瘤的基本特征，并能在免疫缺陷小鼠中誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。目前，研究人員已成功獲得了乳腺癌[24]、結(jié)腸癌[25]和神經(jīng)母細(xì)胞瘤[26]等的腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制提供了有力的工具和模型。更為重要的是，無血清培養(yǎng)基去除了血清中的促分化劑，適宜腫瘤干細(xì)胞的富集和培養(yǎng)。Lei等的研究表明，無血清培養(yǎng)可以增加前列腺癌細(xì)胞系DU145中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和CD44陽性的細(xì)胞比例(從0.1%±0.01%上升至10.3%)，并使得原本無CD133和CD44陽性腫瘤干細(xì)胞的PC-3細(xì)胞獲得了3%的腫瘤干細(xì)胞陽性比率[27]。

在腫瘤治療方面，免疫治療方法已經(jīng)成為腫瘤治療的前沿領(lǐng)域，尤其是基于樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells, DC)的腫瘤疫苗被認(rèn)為是治療惡性腫瘤的一種有效的途徑。在利用DC腫瘤疫苗治療時，所需要的樹突狀細(xì)胞和用于抗原致敏的腫瘤細(xì)胞，往往在胎牛血清(Fetal Calf Serum, FCS)中進(jìn)行培養(yǎng)，這使得很難分辨哪些免疫應(yīng)答是由血清引起而非真正的先天免疫系統(tǒng)的作用。Bouwer等研究顯示，他們利用無血清培養(yǎng)可以徹底解決DC腫瘤疫苗治療中血清干擾的問題，并且還保持類似血清培養(yǎng)狀態(tài)下的生物學(xué)功能[28]。這為進(jìn)一步安全地應(yīng)用DC腫瘤疫苗治療腫瘤提供了有效方法和理論依據(jù)。

4 展望

目前，無血清培養(yǎng)基在理論研究和實踐應(yīng)用方面均已取得諸多切實有效的成果，為科學(xué)研究和國民生產(chǎn)做出了卓有成效的貢獻(xiàn)。但是，由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞類型具有明顯的多樣性，而現(xiàn)有無血清培養(yǎng)基往往適用范圍較為狹窄，因此亟待需要研發(fā)出普適性強的無血清培養(yǎng)基配方，提高培養(yǎng)通用性，以能同時滿足不同細(xì)胞的要求。另外，雖然無血清培養(yǎng)基較有血清培養(yǎng)基節(jié)約了血清的成本，可是有些無血清培養(yǎng)基的補充因子的價格仍較為昂貴，應(yīng)進(jìn)一步研發(fā)相對廉價而有效的替代品，降低總體成本。相信隨著代謝組學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷完善，資源共享的無血清培養(yǎng)基在線數(shù)據(jù)庫的建立[29]，以及更多科學(xué)設(shè)計方法的運用，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化必將會得到更快的發(fā)展。特別是生產(chǎn)高效性、培養(yǎng)通用性、安全風(fēng)險和降低成本等方面應(yīng)成為今后無血清培養(yǎng)基深入改進(jìn)的重點方向，從而使其能在生物醫(yī)藥行業(yè)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域得到更為廣泛而安全的應(yīng)用。

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〔責(zé)任編輯 王 勇〕

Progress on serum-free media of zooblast

SHANG Yu, ZHANG Qiming, LI Yue, WANG Yingbing

(College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China)

With the expanding scale, efficiency and safety requirements during mammalian cell culture in biomedical industry and research of life sciences, development of serum-free media (SFM) has become a major task in the field of cell engineering. The technology of SFM has experienced four stages including no serum source, no animal source, no proteins and chemically defined medium, and now reached to a status where SFM has more clear components and is easy-handling, allowing users to avoid the potential contaminants of pathogens from environment during cell culture, therefore, to bring a splendid progress and wide applications in the fundamental research of life sciences and bio-pharmaceutical industry. In this review, the classification, components and optimization of SFM were summarized, and latest applications in biological products, stem cells and cancer researches were briefly discussed. This will be helpful for the exploration of SFM in the research of biology, especially in the aspect of tumor stem cells.

serum free medium; biological products; cell culture

1672-4291(2015)04-0068-05

10.15983/j.cnki.jsnu.2015.04.344

2015-03-20

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120003120025)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(2013NT31)；國家自然科學(xué)基金(81301701)

商瑜，女，講師,博士,主要從事腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及抗癌藥物開發(fā)等研究。E-mail: shangyu@bnu.edu.cn

Q81

A