金永玲，楊蘇寧，叢 斌，王麗艷

(1．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110161;2．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶163319)

黑龍江省草原面積較大，多分布于西部松嫩平原的大慶、杜蒙、肇源及肇州等地區(qū)，蝗蟲(chóng)發(fā)生種類較多，危害嚴(yán)重［1］。近幾年，由于北方降水量下降，氣候干旱，冬季氣溫偏高等氣象因素的影響，蝗蟲(chóng)的發(fā)生率逐年上升，蟲(chóng)口密度最高達(dá)到300 ～500 頭·m－2，甚至更高，嚴(yán)重影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展［2］。草原蝗蟲(chóng)綜合治理中，化學(xué)防治仍是主要的治理手段。但是，隨著殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用，害蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題越來(lái)越突出。解毒酶活性提高是導(dǎo)致昆蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生最直接的生化表現(xiàn)。參與昆蟲(chóng)體內(nèi)殺蟲(chóng)劑代謝的解毒酶主要包括羧酸酯酶，細(xì)胞色素P450 單加氧酶和谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶［3］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)以及昆蟲(chóng)基因組學(xué)的發(fā)展，昆蟲(chóng)抗藥性分子機(jī)理有了突破性進(jìn)展，與抗藥性相關(guān)的細(xì)胞色素單加氧酶、羧酸酯酶以及谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶3 個(gè)解毒酶家族基因也得到廣泛驗(yàn)證［4-6］。已有研究針對(duì)蝗蟲(chóng)，分析了東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)和中華稻蝗(Oxya chinensis)體內(nèi)解毒酶的變化與有機(jī)磷農(nóng)藥和菊酯類農(nóng)藥抗性的關(guān)系［7-10］，其他種類蝗蟲(chóng)抗藥性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

黃脛小車蝗(Oedaleus infernalis)屬直翅目、蝗總科昆蟲(chóng)，是我國(guó)北方地區(qū)草原及農(nóng)牧交錯(cuò)地帶的優(yōu)勢(shì)種蝗蟲(chóng)，危害嚴(yán)重［11］。目前，對(duì)黃脛小車蝗的生物學(xué)特性、發(fā)生分布與植被的關(guān)系、遺傳多樣性、危害與防治等［12-20］方面進(jìn)行了大量的研究。雖然關(guān)于黃脛小車蝗等土蝗對(duì)常用殺蟲(chóng)劑會(huì)產(chǎn)生抗性已有報(bào)道［19］，譬如氰戊菊酯(Fenvalerate)是治理蝗蟲(chóng)的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑之一［21］，通過(guò)觸殺和胃毒維持長(zhǎng)效防治效果［22］，但其對(duì)黃脛小車蝗體內(nèi)解毒酶的影響尚不清晰。因此，研究氰戊菊酯作用對(duì)黃脛小車蝗解毒酶抗性產(chǎn)生的影響，有助于揭示氰戊菊酯治理黃脛小車蝗的機(jī)制。為此，本研究以黃脛小車蝗為研究對(duì)象，利用氰戊菊酯誘導(dǎo)室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源，分析黃脛小車蝗體內(nèi)代謝解毒酶的變化情況，以確定參與氰戊菊酯抗性形成的解毒酶種類。

1 材料與方法

1．1 供試蝗蟲(chóng)

室內(nèi)蟲(chóng)源:黃脛小車蝗于2009 年采集于黑龍江省大慶市紅崗地區(qū)的天然草甸草原。采集回室內(nèi)后，在養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)籠罩飼養(yǎng)［溫度(26 ±2)℃，RH 為75%，光周期L∶ D = 14∶ 10］，每日飼喂新鮮麥苗繼代飼養(yǎng)，不接觸任何農(nóng)藥。選擇5 齡若蟲(chóng)作為試驗(yàn)材料。

田間蟲(chóng)源:采集于黑龍江省大慶市紅崗(HG)、肇源(ZY)和林甸(LD)地區(qū)草原(均為草甸草原)，標(biāo)記為田間蟲(chóng)源HG、田間蟲(chóng)源ZY 和 田間蟲(chóng)源LD。采回室內(nèi)后用小麥(Triticum aestivum)嫩葉飼養(yǎng)至5齡若蟲(chóng)待用。

1．2 試驗(yàn)藥品

90%氰戊菊酯原藥:山東華陽(yáng)農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 毒力測(cè)定 參考慕衛(wèi)等［23］的方法，采用點(diǎn)滴法測(cè)定氰戊菊酯對(duì)黃脛小車蝗5 齡若蟲(chóng)的毒力。以丙酮為溶劑，將氰戊菊酯稀釋為6 個(gè)濃度。用微量注射器吸取2．5 μL 配制好的藥劑點(diǎn)滴在5 齡若蟲(chóng)腹部，每一濃度處理點(diǎn)滴20 頭若蟲(chóng)，雌雄各半。每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，共60 頭若蟲(chóng)。以點(diǎn)滴純丙酮作為對(duì)照。藥劑處理后，正常室溫條件下飼養(yǎng)，24 h 檢查死蟲(chóng)數(shù)。以毛筆輕觸蟲(chóng)體，不動(dòng)為死亡。對(duì)照自然死亡率在5%內(nèi)為有效試驗(yàn)。

抗性比=抗性種群LD50/敏感種群LD50。

1．3．2 酶抑制劑對(duì)氰戊菊酯的增效作用測(cè)定 參考李春生等［24］的方法，將3 種酶抑制劑增效醚(PBO)、磷酸三苯酯(TPP)和順丁烯二酸二乙酯(DEM)用丙酮稀釋一定的濃度(10 g·L－1)后，用微量注射器點(diǎn)滴2 μL 在5 齡黃脛小車蝗若蟲(chóng)腹部(20 μg·頭－1)，酶抑制劑作用1 h 再用微量注射器點(diǎn)滴殺蟲(chóng)劑，操作方法參見(jiàn)1．3．1。將測(cè)定結(jié)果與不使用增效劑的測(cè)定結(jié)果相比較，計(jì)算增效比。

1．3．3 解毒酶活性測(cè)定

對(duì)照組:分別選取室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源ZY 的5齡若蟲(chóng)制備酶液。

藥劑誘導(dǎo)組:首先利用氰戊菊酯亞致死劑量(LD10=3．72 ×10－3μg·頭－1)分別處理室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源ZY 的5 齡若蟲(chóng)(方法同1．3．1)，24 h 后取活蟲(chóng)制備酶液。酶活性測(cè)定方法如下:

1)酯酶活性測(cè)定

取蝗蟲(chóng)雌雄各一頭放入玻璃勻漿器，加1 mL 勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸緩沖液)勻漿，將勻漿液(15 000 g，4 ℃)離心20 min 后取上清液作為酶源備用。酯酶活性的測(cè)定參考van Asperen［25］的方法，加以修改。以α-NA 為底物測(cè)定酯酶活性，加入0．3 mmol·L－1α-NA 底物溶液，0．15 mL 待測(cè)酶液，0．75 mL 0．1 mol·L－1、pH 7．5、0．3% Triton X-10 的磷酸緩沖液，在37 ℃條件下，溫浴30 min，然后加入0．5 mL 固藍(lán)BSDS 溶液終止反應(yīng)，立即在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD值。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶源蛋白含量，計(jì)算酶比活力。

2)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定

取蝗蟲(chóng)雌雄各1 頭放入玻璃勻漿器，加入1 mL勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5、含0．3% Triton X-100 的磷酸緩沖液)勻漿，將勻漿液(15 000 g，4℃)離心20 min 后取上清液作為酶源備用。以CDNB 為反應(yīng)底物測(cè)定谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶活性，參考Oppnoorth 等［26］的方法，根據(jù)試驗(yàn)情況加以修改。取100 μL 稀釋的酶液加入2． 65 mL 磷酸緩沖液(0．1 mol·L－1pH 7． 5)和150 μL 20 mol·L－1GSH，然后放在25 ℃水浴鍋中溫浴5 min;加入100 μL 30 mmol·L－1CDNB，在25 ℃，340 nm 下立刻測(cè)試5 min 內(nèi)吸光值的變化(每隔20 s 測(cè)一次)。記錄反應(yīng)速度(OD340·min－1)，以每分鐘催化生產(chǎn)1 nmol 產(chǎn)物為1 個(gè)活性單位，酶活力公式為:GSTS(nmol·min－1)= (△OD340·V)/(ε·L)，式中，△OD340為每分鐘光吸收的變化值;V 為酶促反應(yīng)體積;ε 為消光系數(shù):0．009 6 L·μmol－1·cm－1;L 為比色杯光程(cm)。

3)多功能氧化酶O－脫甲基活性測(cè)定

多功能氧化酶O －脫甲基活性測(cè)定，參照Hansen 和Hodgson［27］的方法。取蝗蟲(chóng)雌雄各一頭放入玻璃勻漿器，加入1 mL 勻漿緩沖液(0．1 mol·L－1、pH 7．5 磷酸緩沖液，含1 mmol·L－1的EDTA、DTT、PTU、PMSF 和20%的甘油)進(jìn)行勻漿，將勻漿液(10 000 g，4 ℃)離心15 min 后取上清液作為酶源備用。取0．7 mL 酶液加入試管中，再依次加入1 mL 3．0 mmol·L－1的對(duì)硝基苯甲醚，在37 ℃下水浴5 min，再加入0．3 mL 20 mmol·L－1的還原型NADPH，迅速在405 nm 下測(cè)定20 min 內(nèi)的吸光值變化(每20 s 記錄一次)。以反應(yīng)速度表示酶活力OD405·min－1。

1．4 蛋白含量測(cè)定

酶原蛋白質(zhì)含量測(cè)定，采用Bradford［28］的考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS13．0 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算毒力回歸式及LD10、LD50值;解毒酶活性用Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2．1 氰戊菊酯對(duì)黃脛小車蝗的毒力測(cè)定

毒力回歸方程是經(jīng)過(guò)多次重復(fù)測(cè)定求出的，r值均大于0．98，求出的LD50值可信(表1)。對(duì)于室內(nèi)蟲(chóng)源，LD50為4．38 ×10－3μg·頭－1。田間蟲(chóng)源HG、LD 和ZY 的LD50分別為7．30 ×10－3、7．21 ×10－3和2．298 ×10－2μg·頭－1。田間蟲(chóng)源HG、LD和ZY 對(duì)氰戊菊酯的抗性比分別為室內(nèi)蟲(chóng)源的1．67、1．65 和5．25 倍。表明紅崗地區(qū)和林甸地區(qū)蝗蟲(chóng)對(duì)氰戊菊酯較敏感，毒力相對(duì)較大，而肇源地區(qū)蝗蟲(chóng)對(duì)氰戊菊酯的敏感性則下降，已經(jīng)到達(dá)了低抗水平。

2．2 3種酶抑制劑對(duì)氰戊菊酯的增效作用

PBO 對(duì)室內(nèi)蟲(chóng)源、田間蟲(chóng)源ZY 的增效比分別為2．16、3．91 倍，TPP 對(duì)室內(nèi)蟲(chóng)源、田間蟲(chóng)源ZY的增效比分別為2．00 和2．15倍。DEM 對(duì)室內(nèi)蟲(chóng)源、田間蟲(chóng)源ZY 的增效比分別是0．97 和1．04倍(表2)。說(shuō)明增效醚和磷酸三苯酯對(duì)氰戊菊酯有增效作用，且對(duì)田間蟲(chóng)源ZY 的增效作用好于室內(nèi)蟲(chóng)源;而順丁烯二酸二乙酯則沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的增效作用。

表1 氰戊菊酯對(duì)黃脛小車蝗毒力測(cè)定結(jié)果Table 1 Toxicity determination of fenvalerate on Oedaleus infernalis

表2 3 種酶抑制劑對(duì)氰戊菊酯增效作用Table 2 The synergism of three enzyme inhibitors to fenvalerate

2．3 氰戊菊酯亞致死劑量誘導(dǎo)對(duì)蝗蟲(chóng)解毒酶比活力影響

未經(jīng)氰戊菊酯誘導(dǎo)的對(duì)照組，田間蟲(chóng)源ZY 體內(nèi)酯酶活性顯著高于室內(nèi)蟲(chóng)源(P ＜0．05)(表3)。經(jīng)過(guò)氰戊菊酯LD10誘導(dǎo)后，室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源ZY酯酶活力均極顯著上升，室內(nèi)蟲(chóng)源上升比值為2．25，田間蟲(chóng)源ZY 上升比值為1．59。說(shuō)明田間蟲(chóng)源ZY 對(duì)氰戊菊酯敏感性下降可能與酯酶活性增加有關(guān)。同時(shí)，也說(shuō)明氰戊菊酯亞致死劑量能夠顯著激活蝗蟲(chóng)體內(nèi)酯酶的活力。

無(wú)論是對(duì)照組還是氰戊菊酯誘導(dǎo)組，田間蟲(chóng)源ZY 和室內(nèi)蟲(chóng)源黃脛小車蝗體內(nèi)谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶活性均在11．244 5 ～12．370 8 nmol·min－1·mg－1范圍內(nèi)，彼此間無(wú)顯著差異(P ＞0．05)(表3)。說(shuō)明黃脛小車蝗經(jīng)氰戊菊酯誘導(dǎo)沒(méi)有顯著激活谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶的活性。

田間蟲(chóng)源ZY 體內(nèi)多功能氧化酶O －脫甲基活性均顯著高于室內(nèi)蟲(chóng)源(P ＜0．05)(表3)。經(jīng)過(guò)氰戊菊酯LD10誘導(dǎo)后，室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源ZY 體內(nèi)多功能氧化酶活性均顯著升高，增加比值分別是1．21和1．45。說(shuō)明多功能氧化酶O －脫甲基被氰戊菊酯激活，推斷田間蟲(chóng)源ZY 對(duì)氰戊菊酯敏感性下降與該酶有關(guān)聯(lián)。

3 討論與結(jié)論

3．1 3 種酶抑制劑對(duì)氰戊菊酯的增效作用

本研究測(cè)定的室內(nèi)蟲(chóng)源經(jīng)過(guò)室內(nèi)5 代以上連續(xù)飼養(yǎng)，對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性較高，擬定為相對(duì)敏感蟲(chóng)源，與田間采集蟲(chóng)源進(jìn)行毒力比較，發(fā)現(xiàn)采集于黑龍江大慶肇源田間蟲(chóng)源對(duì)氰戊菊酯敏感性顯著下降(P ＜0．05)，已經(jīng)表現(xiàn)出低水平的抗性。利用酶抑制劑進(jìn)行體外增效作用的結(jié)果說(shuō)明，TPP、PBO 作用于室內(nèi)蟲(chóng)源和田間蟲(chóng)源對(duì)氰戊菊酯都表現(xiàn)出增效作用，由于酶抑制劑對(duì)解毒酶系有特異性的抑制作用，可以作為殺蟲(chóng)劑抗性機(jī)制的診斷工具，所以可以判斷黃脛小車蝗氰戊菊酯抗性形成與酯酶、多功能氧化酶有關(guān)聯(lián)。

當(dāng)前已有大量不同類型增效劑用于昆蟲(chóng)的防治和抗性治理研究中。以甜菜夜蛾為研究對(duì)象，研究表明，PBO、TPP 和增效磷(SV1)對(duì)氰戊菊酯和順式氯氰菊酯均表現(xiàn)出明顯的增效作用［29］;PBO 對(duì)高效氯氰菊酯增效作用顯著，TPP 增效作用較差［24］;PBO、TPP 和DEF 對(duì)氯氰菊酯均表現(xiàn)出了增效作用，其中PBO 增效最高［30］。以棉鈴蟲(chóng)為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，PBO 對(duì)氰戊菊酯增效倍數(shù)最高［31-32］。曾鑫年和趙善歡［33］研究柑橘潛葉蛾氰戊菊酯抗性發(fā)現(xiàn)，PBO對(duì)氰戊菊酯的增效指數(shù)達(dá)2 430．3 倍，表明多功能氧化酶是柑桔潛葉蛾對(duì)氰戊菊酯抗藥性產(chǎn)生的主要機(jī)制。以上這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果相同，PBO 對(duì)菊酯類殺蟲(chóng)劑均有很好的增效作用。說(shuō)明多功能氧化酶可能是菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性形成的機(jī)制。同時(shí)，也說(shuō)明針對(duì)昆蟲(chóng)種類不同，藥劑品種不同，各種增效劑表現(xiàn)出的增效作用也各有不同。為確定解毒酶與抗性的關(guān)系，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 不同處理黃脛小車蝗解毒酶比活力比較Table 3 Comparison of the specific detoxifying enzymes activity of Oedaleus infernalis by different treatments

3．2 解毒酶活性比較

昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶活性變化是判斷昆蟲(chóng)抗性產(chǎn)生的直接依據(jù)。解毒酶活性測(cè)定表明，田間蟲(chóng)源的酯酶和多功能氧化酶活性均顯著高于室內(nèi)蟲(chóng)源(P ＜0．05)。與毒力測(cè)定和增效劑測(cè)定結(jié)果相統(tǒng)一，均表明黃脛小車蝗對(duì)氰戊菊酯的敏感性下降。經(jīng)過(guò)氰戊菊酯亞致死劑量誘導(dǎo)，田間蟲(chóng)源和室內(nèi)蟲(chóng)源蟲(chóng)體內(nèi)的酯酶和多功能氧化酶活性均明顯上升;而蟲(chóng)體內(nèi)谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶活性變化不顯著。說(shuō)明黃脛小車蝗對(duì)氰戊菊酯抗性形成與多功能氧化酶、酯酶有一定的聯(lián)系。蘭亦全和趙士熙［29］研究表明，羧酸酯酶活性的提高是甜菜夜蛾對(duì)氰戊菊酯和順式氯氰菊酯產(chǎn)生抗性的重要原因，谷胱甘肽S －轉(zhuǎn)移酶與兩種藥劑的抗性無(wú)關(guān)。金濤等［34］測(cè)定了9 個(gè)地理品系和相對(duì)敏感品系的桔小實(shí)蠅成蟲(chóng)3 種解毒酶活性與抗性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)解毒酶活性增強(qiáng)，抗性水平高，且表現(xiàn)出MFO － O － 脫甲基活性、GST 活性和CarE 活性對(duì)高效氯氰菊酯抗性水平均起到正向作用;劉永杰和沈晉良［35］發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾抗性品系中腸微粒體甲氧試鹵靈O－脫甲基酶的活性比敏感品系的酶活性提高1．33 倍，說(shuō)明甜菜夜蛾對(duì)氯氟氰菊酯的抗藥性與微粒體多功能氧化酶活性的提高密切相關(guān)。褐飛虱對(duì)噻嗪酮的抗性變化中，抗性品系的羧酸酯酶比活力增加到4．2 倍，說(shuō)明其抗性形成可能與羧酸酯酶有關(guān)［35］。Rauch 和Nanen［36］報(bào)道，在煙粉虱中多功能氧化酶活性提高2 ～3 倍，但是抗性已經(jīng)達(dá)到了30 倍，說(shuō)明多功能氧化酶活性提高只是抗性產(chǎn)生的原因之一。根據(jù)以上分析，結(jié)合本研究結(jié)果說(shuō)明，針對(duì)不同昆蟲(chóng)和不同殺蟲(chóng)劑，抗藥性產(chǎn)生的原因是比較復(fù)雜的，酯酶和多功能氧化酶只是黃脛小車蝗對(duì)氰戊菊酯抗性產(chǎn)生的原因之一，關(guān)于其抗性機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

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