同位素稀釋—固相萃取—LC/MS/MS法測定嬰幼兒配方食品中雙酚類化合物

高夢婕等

摘 要 建立了同位素稀釋固相萃取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定嬰幼兒配方食品中14種雙酚類化合物的方法。嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方谷粉和嬰幼兒輔食果泥等試樣經(jīng)乙腈提取，ProElut PLS 固相萃取小柱（500 mg/6 mL）凈化，14種雙酚類化合物經(jīng)Waters Atlantis T3 色譜柱（150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）分離后，正負(fù)離子同時(shí)掃描模式下多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），基質(zhì)匹配BPAd16、TBBPAd10和BPSc13同位素內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，14種雙酚類化合物線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，回收率為83.0%～107.1%（n=6）， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.1%～9.8%（n=6），方法的定量限（LOQ）為1.0～2.0 μg/kg，檢出限（LOD）為0.3～0.7 μg/kg。方法操作簡單、高效、重現(xiàn)性好，滿足現(xiàn)行法規(guī)要求的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了嬰幼兒食品中雙酚類化合物的定性定量檢測。

關(guān)鍵詞 雙酚類； 嬰幼兒食品； 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法； 同位素稀釋

1 引 言

隨著消費(fèi)者對健康、營養(yǎng)追求越來越高，尤其是對嬰幼兒食品的高度重視，目前市場上嬰幼兒配方食品種類越來越多，如嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方谷物粉、嬰幼兒配方米粉、嬰幼兒輔食果泥等。在嬰幼兒食品制造過程中不可避免使用的接觸性包裝材料中雙酚類化合物會遷移到食品中，嚴(yán)重危害嬰幼兒的大腦發(fā)育和免疫遺傳功能[1～6]。雙酚類化合物主要包括雙酚A（BPA）及環(huán)氧化物、雙酚F（BPF）及環(huán)氧化物、雙酚S（BPS）、四氯雙酚A（TCBPA）和四溴雙酚A（TBBPA）等，屬內(nèi)分泌干擾物，具有擬雌激素活性，微量甚至痕量即可能對人類和動物的生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響[3～6]。由于配方食品為嬰幼兒的主要營養(yǎng)來源，對嬰幼兒配方食品雙酚類化合物遷移帶來的食品安全問題也越來越受到重視。

目前，對于雙酚類化合物的遷移限量規(guī)定并不完善。歐盟法規(guī)（EC/1895/2005號指令）規(guī)定， 自2006年1月1日以后禁止在食品接觸的涂料中使用雙酚F二縮水甘油醚（BFDGE），并規(guī)定雙酚A二縮水甘油醚（BADGE）、雙酚A（2，3二羥基丙基甘油醚）（BADGE H2O）和雙酚A雙（2，3二羥基丙基醚）（BADGE2H2O）在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過9 mg/kg，單一各類在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過1 mg/kg[7]。同時(shí)，歐盟塑料法規(guī)（EU No.10/2011）和我國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB96852008）均規(guī)定雙酚S在食品或食品模擬物中的遷移限量為0.05 mg/kg[8，9]。我國行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 31502012）對出口食品中BADGE、BFDGE及其衍生物測定方法的定量限（LOQ）為10 μg/kg[10]。

雙酚類化合物檢測涉及測定樣品有環(huán)境水樣、土壤、生物、食物等[11～17]，但嬰幼兒食品中同時(shí)測定10余種雙酚類化合物的方法還未見報(bào)道。同時(shí)遷移到嬰幼兒食品中的雙酚類化合物通常是痕量的，且復(fù)雜的基質(zhì)會對目標(biāo)物的分析造成干擾。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低的特點(diǎn)。同位素稀釋法已被廣泛用于痕量污染物的定量研究，可以有效提高方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度[6，17]。本研究采用固相萃取進(jìn)行前處理，同位素內(nèi)標(biāo)稀釋，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）同時(shí)測定嬰幼兒食品中14種雙酚類化合物的遷移量，電噴霧離子化正模式（ESI+）和負(fù)模式（ESI

）同時(shí)掃描，用時(shí)少， 操作簡單， 適用范圍廣泛。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

API4000型四極桿串聯(lián)線性質(zhì)譜儀（美國AB公司）； UFLC XR高效液相色譜儀（日本島津公司）； 電子分析天平（精度為0.0001 g，德國Sartorius ME公司）； XW80A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）； MilliQ超純水一體機(jī)（Millipore公司）； NEVAP氮吹儀（美國Organomation公司）； 固相萃取儀（美國Supelco公司）； Allegia X22R高速冷凍離心機(jī)（Beckman公司）； ProElut PLS 固相萃取小柱（500 mg/6 mL， Dikma公司）； 0.22 μm有機(jī)相濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

BPA和BPF標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%，日本TCI公司）； BFDGE標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）； BPS標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，美國Admas公司）； BADGE、BADGEH2O、BADGE2H2O、雙酚A（3氯2羥丙基甘油醚）（BADGEHCl）、雙酚A雙（3氯2羥丙基）甘油醚（BADGE2HCl）、雙酚A（3氯2羥丙基）（2，3二羥丙基醚）（BADGEH2OHCl）、雙酚F雙（2，3二羥基丙基醚）（BFDGE2H2O）、雙酚F雙（3氯2羥丙基）甘油醚（BFDGE2HCl）、TCBPA和TBPBA標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，瑞士Fluka公司）。乙腈、甲醇（ACS純，美國Merck公司）； 甲酸（ACS純，J.T.Baker公司）； 3種同位素內(nèi)標(biāo)購自上海市化工研究院，雙酚A內(nèi)標(biāo)（BPAd16），四溴雙酚A內(nèi)標(biāo)（TBBPAd10）（100 mg/L）和雙酚S內(nèi)標(biāo)（BPSc13）（純度>96%）； 實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore系統(tǒng)處理的超純水。

嬰幼兒配方食品罐取自不同的生產(chǎn)企業(yè)， 均為未接觸過食品。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取0.0100 g 標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中， 用甲醇溶解并定容， 4 ℃下保存。BPA， BPF， BADGE， BADGEH2O， BADGEHCl， BADGE2H2O， BADGEHClH2O， BADGE2HCl， BFDGE， BFDGE2H2O， BFDGE2HCl， BPS， TCBPA和TBBPA標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為1.000 g/L。用甲醇稀釋為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光于4 ℃保存。根據(jù)需要移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醇水（1∶1， V/V）稀釋，配制成0.5， 1.0， 2.0， 10.0和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，內(nèi)標(biāo)BPAd16， TBBPAd10和BPSc13的濃度分別為25， 50和25 μg/L。endprint

2.3 樣品前處理

稱取均質(zhì)樣品2 g于10 mL玻璃離心管中，加入3 mL水、2 mL乙腈， 渦旋振蕩1 min， 4000 r/min 離心5 min， 取上層澄清液凈化。依次用5 mL乙腈和5 mL甲醇水（1∶1， V/V）溶液活化 PLS 固相萃取小柱， 調(diào)節(jié)流速約2～3 mL/min； 將玻璃離心管中的上層澄清液轉(zhuǎn)入固相萃取小柱， 棄去流出液； 再用5 mL水淋洗， 棄去流出液； 用5 mL 乙腈洗脫， 洗脫液收集于試管中， 40 ℃下氮吹至近干； 用1 mL含0.1%甲酸的甲醇水（1∶1， V/V）定容， 并于渦旋混合器上混勻， 過0.22 μm濾膜過濾后， 供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

2.4 色譜質(zhì)譜條件

液相色譜條件： Waters Atlantis T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.0 μm）。流動相A為甲醇， 流動相B為水； 進(jìn)樣量： 10 μL； 流速： 0.25 mL/min； 柱溫： 30 ℃。梯度洗脫： 0～4 min， 45% A； 4～8 min， 45%～80% A； 8～14 min， 80% A； 14～18 min， 80%～45% A。

質(zhì)譜條件： 離子源： 電噴霧離子化正模式（ESI+）和負(fù)模式（ESI

）同時(shí)掃描； 掃描方式： 多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）； 電噴霧電壓（IS）： 5500 V（ESI+）和4500 V（ESI

）； 霧化氣壓力（GS1）： 413.8 kPa； 氣簾氣壓力（CUR）： 172.4 kPa； 輔助氣壓力（GS2）： 413.8 kPa； 離子源溫度（TEM）： 500 ℃； CAD： High； 掃描時(shí)間： 50 ms。14種雙酚類化合物及3種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

比較了3種不同類型的色譜柱： Thermo Aquasil C18柱（150 mm × 4.6 mm， 3.0 μm）、Agilent XDBC18柱（100 mm × 4.6 mm， 3.5 μm）和Waters Atlantis T3柱（150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）對14種雙酚類化合物的分離效果。在本實(shí)驗(yàn)條件下， C18色譜柱完全洗脫14種雙酚類化合物時(shí)間較長。而Waters Atlantis T3柱在18 min內(nèi)即能對14種雙酚類化合物形成較好的分離，且峰形和響應(yīng)值均高于C18柱，對雙酚類等極性藥物具有較好的保留[6]。故本實(shí)驗(yàn)選擇T3柱進(jìn)行分析。

3.2 流動相的選擇

比較了甲醇水和乙腈水流動相對目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，以甲醇為有機(jī)相時(shí)，各待測物響應(yīng)強(qiáng)度較穩(wěn)定，且峰形均較好； 而乙腈為有機(jī)相時(shí)的響應(yīng)值明顯降低，分離度也不佳，不適合同時(shí)檢測。 故選用甲醇為有機(jī)相，對雙酚類具有較好的分離效果。流動相比例初始為甲醇水（45∶55， V/V）， 在10 min內(nèi)，甲醇的比例最高達(dá)到80%， 可完全洗脫所有雙酚類化合物。14種雙酚類化合物正負(fù)模式同時(shí)掃描多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取1.0 mg/L 雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以流動注射的方式在ESI+和ESI

模式下進(jìn)行電離監(jiān)測。果表明， BPA， BPF， TCBPA和TBBPA在ESI

模式下有更好的響應(yīng)，其余10種雙酚類化合物在ESI+模式下有更好的響應(yīng)。在MRM模式下對每種化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析（Q1掃描）， 得到每種化合物的分子離子峰。根據(jù)歐盟第2002/657/EC號[18]中有關(guān)規(guī)定，選擇2對離子進(jìn)行MRM監(jiān)測。選取相應(yīng)母離子峰，對其子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析（Q2掃描），得到碎片離子信息。選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對子離子作為定性、定量離子，優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數(shù)條件，以達(dá)到最佳靈敏度（見表1）。本方法在ESI+和ESI模式下同時(shí)掃描14種雙酚類化合物，時(shí)間更快，響應(yīng)度高。

3.4 線性范圍與檢出限

向空白基質(zhì)溶液中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，以峰面積對應(yīng)的濃度作圖。表2結(jié)果表明，14種化合物在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999。分別以10倍信噪比（S/N>10）和3倍信噪比（S/N>3）計(jì)算得到14種雙酚類化合物的定量限（LOQ）及檢出限（LOD）分別為1.0～2.0 μg/kg及0.3～0.7 μg/kg。14種雙酚類化合物的相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表2。

3.5 加標(biāo)回收率與精密度

選擇3種不含雙酚類的樣品（嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方谷粉、嬰幼兒輔食果泥）進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，添加14種雙酚類標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行3種水平的標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，平均回收率為83.0%～107.1%（n=6），回收率情況良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.1%～9.8%（n=6）?？瞻兹榉蹣悠返退较录訕?biāo)和空白乳粉樣品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）圖譜見圖2。

3.6 樣品分析

采用本方法對市售的30余種不同品牌的嬰幼兒食品（嬰幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方谷粉和嬰幼兒輔食果泥）進(jìn)行測定，在嬰幼兒輔食果泥中檢出BPA、BADGE2H2O和BADGE2HCL，含量為0.6～5.9 μg/kg，說明雙酚類化合物在嬰幼兒食品包裝材料中痕量存在，并遷移到食品內(nèi)容物中，但含量相對較低，并未超過歐盟對食品中遷移總量的規(guī)定。

上述結(jié)果表明， 本方法操作簡便、高效、重現(xiàn)性好、回收率佳，滿足現(xiàn)行法規(guī)要求同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了嬰幼兒配方食品中雙酚類化合物的定性定量檢測，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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歐盟第2002/657/EC號決議. 歐盟. L 221/8， 2002

Abstract A method based on isotope dilutionsolid phase extraction （SPE） and liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） for the simultaneous determination of 14 bisphenol substances migration in infant food （infant milk powder， infant nutritious cereal and infant supplement puree） was presented. The samples were extracted by acetonitrile followed by ProElut PLS （500 mg/6 mL） to remove matrix interference. The separations of 14 bisphenol substances were performed on a Waters Atlantis T3 （150 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）， respectively， in the positive and negative MRM mode by HPLCMS/MS. The quantification was carried out by matrixmatched calibration curve and internal standard （BPAd16， TBBPAd10 and BPSc13）. The results demonstrated that the calibration curves showed good linearity in each range and the correlation coefficients （r） were greater than 0.999. The average recoveries at three spiked levels were ranged from 83.0% to 107.1% with the relative standard deviations （RSD） of 5.1% to 9.8%. The limits of quantitation （LOQ， S/N>10） were 1.0-2.0 μg/kg and the limits of detection （LOD， S/N>3） were in the range of 0.3-0.7 μg/kg. The established method was simple， timesaving and efficient， and could meet the requirements for current regulations while achieving qualitative and quantitative determination of 14 bisphenol substances in infant food.

Keywords Bisphenol substances； Infant food； Liquid chromatographytandem mass spectrometry； Isotope dilution

（Received 1 December 2014； accepted 30 December 2014）endprint