張璐 李煥娟 潘婷 楊元 許舒婭 陳唯 彭平 石任兵

遠(yuǎn)志湯來(lái)源于《圣濟(jì)總錄》卷五十五，由遠(yuǎn)志、石菖蒲(1∶1)配比組成，具有寧心安神、抗抑郁、改善記憶的作用。

本研究運(yùn)用藥物成分藥代動(dòng)力學(xué)—藥效動(dòng)力學(xué)與相互作用關(guān)聯(lián)性研究方法學(xué)體系(pharmacokineticspharmacodynamics-drug interactions，PK-PD-DI)［1］，采用嗅球損毀復(fù)制大鼠抑郁模型［2］，以抗抑郁藥效為指標(biāo)，基于藥物體系三大特性:自然性、協(xié)同性、親和性發(fā)現(xiàn)與確定遠(yuǎn)志湯抗抑郁的藥物體系［3］。研究發(fā)現(xiàn)以西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、香草酸、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6’-二芥子?；崽?、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚為其緊密關(guān)聯(lián)的部分藥物成分，并以此建立了同時(shí)測(cè)定遠(yuǎn)志湯藥物制備物7 種有效指標(biāo)性成分的含量的HPLC 測(cè)定分析方法，并通過(guò)其藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析［4-5］，確定出遠(yuǎn)志湯的最佳藥物制備物形式，并基于自然藥學(xué)觀對(duì)創(chuàng)造最佳抗抑郁藥物途徑進(jìn)行探索［6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，Empower Pro 軟件系統(tǒng)，2998PDA 二極管陣列檢測(cè)器;METTLERAE240 型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-S6 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

香草酸(批號(hào)120915，純度≥98%)、α-細(xì)辛醚(批號(hào)100298-201203，純度100%)均購(gòu)自北京方程生物科技有限公司，β-細(xì)辛醚(批號(hào)00011017-T9K，純度95%)購(gòu)自天津一方科技有限公司，西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5(批號(hào):121102，純度≥98%)、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6(批號(hào):121102，純度≥98%)、遠(yuǎn)志酮Ⅲ(批號(hào):1210928，純度≥98%)、3，6’-二芥子?；崽?批號(hào):120929，純度≥96%)、乙腈(色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific 公司)，甲醇(AR 分析純，北京化工廠)，磷酸(AR 分析純，北京化學(xué)試劑公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，其余試劑均為分析純。

鹽酸氟西汀(美國(guó)禮來(lái)公司，生產(chǎn)批號(hào):0745A);利血平(天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020905);去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)試劑盒，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

遠(yuǎn)志飲片(產(chǎn)地:陜西)購(gòu)自GAP 基地，石菖蒲飲片(產(chǎn)地:湖南)購(gòu)自北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司。

遠(yuǎn)志湯藥物制備物:按照基于藥物體系的遠(yuǎn)志湯藥物制備工藝對(duì)全方飲片進(jìn)行水提取、稀醇提取和大孔吸附樹脂純化，分別得到水提取物、稀醇提取物和富集物(由稀醇提取物富集獲得)，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR，體質(zhì)量為18 ～20 g，雌雄各半，許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行多組間的比較，組間兩兩比較采用LSD。

2 方法與結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志湯藥物制備物有效指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的配制 精密稱取西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、香草酸、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6’-二芥子?；崽?、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚對(duì)照品適量，純甲醇溶解并定容至棕色容量瓶中。配成濃度為0.0072 mg/mL、0.0143 mg/mL、0.0215 mg/mL、0.0286mg/mL、0.0358 mg/mL、0.0430 mg/mL 的西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5，配成濃度為0.0059 mg/mL、0.0119 mg/mL、0.0178 mg/mL、0.0238 mg/mL、0.0297 mg/mL、0.0356 mg/mL 的西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6，配成濃度為0.0043 mg/mL 香草酸、0.0054 mg/mL遠(yuǎn)志酮Ⅲ、0.0237 mg/mL3，6’-二芥子?；崽?、0.2760 mg/mL β-細(xì)辛醚、0.0147 mg/mL α-細(xì)辛醚的對(duì)照品溶液。0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取遠(yuǎn)志湯醇提取物100.11 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入70%甲醇超聲使充分溶解，定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.1.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Thermo Hypersil GOLD(C18)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，洗脫梯度(0 ～5 分鐘，0% ～5%A;5 ～10 分鐘，5% ～10%A;10 ～15 分鐘，10% ～12%A;15 ～30 分鐘，12%A;30 ～55 分鐘，12% ～25%A;55 ～65 分鐘，25% ～40%A;65 ～75 分鐘，40% ～70%A;75 ～90 分鐘，70% ～75%A)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、3，6’-二芥子?；崽菫?30 nm，香草酸、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚為256 nm。

依據(jù)上述色譜條件，分別吸取各對(duì)照品溶液及供試品溶液，進(jìn)樣。在對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，在各自檢測(cè)波長(zhǎng)處與其他成分分離良好，見圖1。

圖1 遠(yuǎn)志湯對(duì)照品(A)及供試品(B、C、D)HPLC 色譜圖

分別吸取各對(duì)照品適量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各有效指標(biāo)性成分線性關(guān)系良好。精密吸取供試品溶液進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察，計(jì)算RSD 均小于3%，表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。另精密稱取已知含量的供試品溶液6 份，分別加入各對(duì)照品溶液適量，按2.1.2 方法制備供試品溶液。進(jìn)液相色譜儀，測(cè)色譜峰面積，并分別計(jì)算回收率，結(jié)果:西伯利亞遠(yuǎn)志糖A5、西伯利亞遠(yuǎn)志糖A6、香草酸、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3，6’-二芥子?；崽?、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚平均加樣回收率分別為100.01%(RSD =2.04%)、96.68%(RSD =1.17%)、101.72% (RSD= 2.33%)、102.94% (RSD = 1.30%)、100.59%(RSD = 1.81%)、100.66% (RSD = 2.96%)、97.29%(RSD=1.45%)。該方法的加樣回收率合格，符合定量分析。

2.2 質(zhì)量表征體系研究

2.2.1 基于含量表征 分別精密稱取遠(yuǎn)志湯復(fù)方飲片、水提取物、稀醇提取物和富集物適量，按上述所建的含量測(cè)定方法測(cè)定遠(yuǎn)志湯各制備物中有效指標(biāo)性成分的含量［7］，結(jié)果見表1。由表1可知，遠(yuǎn)志湯中7 種有效指標(biāo)性成分從水提物到醇提物到富集物含量有增大趨勢(shì)。

表1 不同藥物制備物形式中7 種有效指標(biāo)性成分的平均含量(%;n=3)

2.2.2 基于出膏率的質(zhì)量表征 遠(yuǎn)志湯水提取物、稀醇提取物和富集物的出膏率及其參比富集物的相對(duì)比值結(jié)果見表2。由表2可知，相同生藥量下，遠(yuǎn)志湯富集物的出膏率最小，約為水提物和稀醇提取物的1/3.2。

表2 基于藥物制備物出膏率的遠(yuǎn)志湯藥物制備物的質(zhì)量表征

2.2.3 基于相對(duì)量的質(zhì)量表征 遠(yuǎn)志湯各制備物制備過(guò)程中，7 種有效指標(biāo)性成分的相對(duì)量會(huì)不同程度的減小。以飲片中7 種有效指標(biāo)性成分的量為1，根據(jù)含量測(cè)定和出膏率結(jié)果，得到相同生藥量的遠(yuǎn)志湯不同藥物制備物形式中7 種有效指標(biāo)性成分的相對(duì)量(相對(duì)量用含量×出膏率表示)，結(jié)果見表3。由表3可知，隨著遠(yuǎn)志湯的制備過(guò)程，7 種有效指標(biāo)性成分的量會(huì)不同程度的減少。

表3 不同藥物制備物形式中7 種有效指標(biāo)性成分的相對(duì)量

表4 不同藥物制備物形式中6 種有效指標(biāo)性成分含量的相對(duì)比值

2.2.5 基于抗抑郁藥效作用的質(zhì)量表征 本文采用利血平致小鼠抑郁動(dòng)物模型［8］，除空白組不作處理外，其余各組動(dòng)物均予以腹腔注射利血平(4 mg/kg)注射液。造模后，給藥組灌胃相應(yīng)藥液，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水。灌胃30 分鐘后將小鼠豎起，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2 分鐘內(nèi)眼瞼下垂情況，根據(jù)眼瞼下垂情況評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:全睜為1分，眼閉2/4 為0.5 分，眼閉3/4 為0.25 分，全閉為0 分。灌胃1 小時(shí)后小鼠斷頭于冰臺(tái)上取腦組織，分離海馬，放免法檢測(cè)海馬組織中5-HT、NE 的含量。以5-HT、NE 含量為檢測(cè)指標(biāo)，研究遠(yuǎn)志湯在相同生藥量下各制備物的藥物量對(duì)抑郁的治療作用。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行多組間的比較，組間兩兩比較差異采用LSD，結(jié)果見表5。由表5可知，與正常組相比，模型組各指標(biāo)含量均顯著降低，二者有極顯著性差異(P ＜0.01)。遠(yuǎn)志湯富集物組5-HT、NE 與模型組有極顯著性差異(P ＜0.01)，眼瞼下垂程度有顯著性差異(P ＜0.05)，綜合分析結(jié)果顯示其對(duì)抗抑郁有顯著藥效作用。遠(yuǎn)志湯醇提物也具有一定的抗抑郁作用，而遠(yuǎn)志湯水提物抗抑郁作用不明顯。三種制備物的藥效大小為:富集物＞醇提物＞水提物;與陽(yáng)性藥相比，遠(yuǎn)志湯富集物組NE 的含量明顯高于陽(yáng)性藥組，體現(xiàn)其對(duì)NE 的調(diào)節(jié)作用特性。

表5 遠(yuǎn)志湯制備物抗抑郁藥效結(jié)果

2.3 遠(yuǎn)志湯藥物制備物的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 基于有效指標(biāo)性成分含量的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 遠(yuǎn)志湯藥物制備物中的7 種有效指標(biāo)性成分從水提物到醇提物到富集物依次增加，見圖2。其中，富集物中7 種有效指標(biāo)性成分的含量增加幅度最大，稀醇提取物次之，水提物最弱，與抗抑郁藥效結(jié)果:富集物＞稀醇提取物＞水提取物相一致。提示在設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝過(guò)程中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注增幅大的各指標(biāo)性成分，保證其具有較高含量。結(jié)合藥學(xué)和藥效關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)志湯藥物制備物中，隨著藥物體系各指標(biāo)性成分含量和純度的提高，抗抑郁作用顯著提高。說(shuō)明有效指標(biāo)性成分的含量變化與藥效呈正相關(guān)。

圖2 遠(yuǎn)志湯藥物制備物中7 種有效指標(biāo)性成分含量變化

2.3.2 基于有效指標(biāo)性成分含量相對(duì)比值的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 以遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量為參比(含量相對(duì)比值為1)，將不同藥物制備物形式中7 種有效指標(biāo)性成分含量與遠(yuǎn)志酮Ⅲ含量的比值予以表征。其中，富集物與醇提物中的7 種有效指標(biāo)性成分含量相對(duì)比值相似，與水提物差別較大，見圖3。關(guān)聯(lián)藥效推測(cè)，遠(yuǎn)志湯藥物內(nèi)部各類成分以一定的比例存在時(shí)，藥效最佳?？梢娺h(yuǎn)志湯藥物制備物中，除有效成分含量增量外，藥物體系組成中有效成分之間的比例，同樣對(duì)藥效產(chǎn)生較大影響。

圖3 遠(yuǎn)志湯藥物制備物中有效指標(biāo)性成分含量相對(duì)比值的變化

2.3.3 基于藥物制備物的出膏率的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 由表2可知，在相同生藥量下，遠(yuǎn)志湯藥物制備物的出膏率大幅度減小，約為水提物、稀醇提取物的1/3.2，為全方飲片的1/10。關(guān)聯(lián)遠(yuǎn)志湯抗抑郁藥效質(zhì)量表征，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志湯富集物的服用量最小，但藥效卻最強(qiáng)。說(shuō)明在中藥藥物制備中，藥物成分合理富集是提高藥效的關(guān)鍵因素之一。

2.3.4 基于有效指標(biāo)性成分的相對(duì)制備量的藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析 遠(yuǎn)志湯中各類成分的制備量隨著制備工藝過(guò)程的損失，在全方飲片、稀醇提取物和富集物中逐漸減少，見圖4。與相同生藥量藥效結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)在一定藥物成分轉(zhuǎn)移率范圍內(nèi)，藥物成分在藥物制備物中制備量的適當(dāng)降低，未顯現(xiàn)出對(duì)藥物藥效的關(guān)聯(lián)影響。

圖4 遠(yuǎn)志湯藥物制備物各類成分相對(duì)量的變化

綜上，基于藥物體系的基本組成，制備物中藥成分的含量及相對(duì)比值是遠(yuǎn)志湯抗抑郁作用的關(guān)鍵因素。即在相同生藥量下，其富集物藥物服用量大大減少，由于仍保持藥物體系組成成分完整，且藥物純度較高，各類成分的相對(duì)比值更為合理，因而顯示出藥效得以提高，具有最強(qiáng)的抗抑郁作用，故確定遠(yuǎn)志湯富集物為其最佳藥物制備物形式。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)運(yùn)用藥物藥代動(dòng)力學(xué)—藥效動(dòng)力學(xué)與相互作用關(guān)聯(lián)性研究方法(PK-PD-DI)所發(fā)現(xiàn)的藥物體系，結(jié)合遠(yuǎn)志湯的藥學(xué)-藥效質(zhì)量表征，考量出遠(yuǎn)志湯的最佳藥物制備物形式，為抗抑郁中藥復(fù)方藥物的進(jìn)一步研制奠定基礎(chǔ)?；谥苽湮镔|(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析得出，在藥物制備過(guò)程中，基于藥物體系的基本組成，有針對(duì)性地提高有效指標(biāo)性成分的含量與優(yōu)化其組成比例是提升藥物質(zhì)量的關(guān)鍵。

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