祖 雙，梁 潔，劉明穎，肖 雪

(1.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 延邊 133700；2.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250；4.中山大學(xué)南沙研究院， 廣東 廣州 511458)

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參芪王漿養(yǎng)血口服液高效液相指紋圖譜研究

祖 雙1，梁 潔2*，劉明穎3，肖 雪2,4

(1.吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，吉林 延邊 133700；2.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣州白云山明興制藥有限公司，廣東 廣州 510250；4.中山大學(xué)南沙研究院， 廣東 廣州 511458)

目的：采用高效液相色譜法建立參芪王漿養(yǎng)血口服液的指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。方法：采用Agilent Zorbax-SB C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈-水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長為203nm，流速1.0 mL/min。結(jié)果：建立參芪王漿養(yǎng)血口服液的HPLC指紋圖譜，以13個共有峰作為參照峰；采用指紋圖譜評價軟件計(jì)算，相似度均≥0.85。結(jié)論：采用該法可為控制參芪王漿養(yǎng)血口服液的內(nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。

參芪王漿養(yǎng)血口服液；高效液相色譜法；指紋圖譜

參芪王漿養(yǎng)血口服液(Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root)是由人參、黃芪、當(dāng)歸、蜂王漿等原料經(jīng)現(xiàn)代生產(chǎn)工藝制成的制劑，主要功能為補(bǔ)益氣血及養(yǎng)心安神，可用于治療氣血兩虛證，癥見神倦乏力、食欲不振、失眠等[1]。目前，參芪王漿養(yǎng)血口服液執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)較低，難以有效表征產(chǎn)品的質(zhì)量。與傳統(tǒng)檢測手段相比，中藥指紋圖譜是國際上公認(rèn)的中藥質(zhì)量控制最有效的方法之一，可較為全面地反映多種成分的分布[2-4]。本試驗(yàn)對參芪王漿養(yǎng)血口服液進(jìn)行HPLC分析，建立參芪王漿養(yǎng)血口服液的HPLC指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)。

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司，美國，包括G13158 DAD檢測器、G1312A低壓四元泵，在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山超聲設(shè)備有限公司)；Mill-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Excellence XP205型十萬分子一分析天平(Mettler Toledo公司)；SL300N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，甲酸(分析純，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化工有限公司)，超純水自制。

參芪王漿養(yǎng)血口服液由吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Zorbax-SB C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：采用梯度洗脫，A相為水，B相為乙腈；流速：1.0mL/min，DAD檢測器，柱溫35°C，檢測波長為203 nm，進(jìn)樣量為5μL。洗脫程序見表1，得到的HPLC指紋圖譜如圖1所示，其中標(biāo)記13個共有峰。

表1 參芪王漿養(yǎng)血口服液水提液洗脫程序

圖1 參芪王漿養(yǎng)血口服液HPLC色譜

2.2 樣品供試品制備

取參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，搖勻，以0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取批號為1210001參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按“2.2”項(xiàng)方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，以4號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定的RSD分別小于0.1%和3.0%，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為1210001參芪王漿養(yǎng)血口服液成品6支，按“2.2”項(xiàng)方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，各進(jìn)樣測定1次，記錄指紋圖譜，以4號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定的RSD分別小于0.1%和3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為1210001參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按“2.2”項(xiàng)方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，于0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。以4號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積穩(wěn)定的RSD分別小于2.0%和3.0%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜相似度研究[5-7]

分別精密量取多批供試品溶液各5μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，通過指紋圖譜評價軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，2004A版)分析，以13個共有峰為參照峰。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜相似度評價軟件，經(jīng)自動匹配，生成對照圖譜。各樣品與對照色譜圖相比較，采用夾角余弦法計(jì)算相似度，進(jìn)行整體相似度評價。通過相似度分析，發(fā)現(xiàn)批樣品的相似度均在0.85以上，表明樣品相似性良好。詳見圖2。

3 討論

3.1 方法選擇

按照國家藥典委員會關(guān)于“中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)”通知，以HPLC梯度洗脫法對參芪王漿養(yǎng)血口服液進(jìn)行指紋圖譜研究，實(shí)驗(yàn)證明：該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜的研究基礎(chǔ)。

3.2 流動相及波長選擇

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反向柱，對甲醇-水、乙腈-水等體系進(jìn)行考察，結(jié)果顯示乙腈-水體系得到的色譜峰峰型及分離度較好；同時對樣品進(jìn)行DAD全波長掃描，發(fā)現(xiàn)203nm處色譜峰表達(dá)理想，甲醇再次存在末端吸收，梯度洗脫易造成基線漂移，因此本試驗(yàn)選擇乙腈-水作為洗脫體系，同時選取203nm作為檢測波長。

3.3 洗脫流速選擇

本試驗(yàn)考察了不同溫度下指紋圖譜的分離度，研究發(fā)現(xiàn)25℃時指標(biāo)峰分離度變差，30℃和40℃時基線漂移較為嚴(yán)重，而35℃時基線較為平穩(wěn)，分離度也較好。同時本試驗(yàn)還考察了多個流速，其中流速為0.5mL/min和0.8mL/min時，色譜峰不能完全洗脫；流速為1.2mL/min時，各指標(biāo)峰的保留時間變小，分離度降低；當(dāng)流速為1.0mL/min時，分離度較高，峰行較窄。因此，確定以1.0mL/min為參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜的洗脫流速。

圖2 參芪王漿養(yǎng)血口服液HPLC色譜

4 結(jié)論

通過該方法分析參芪王漿養(yǎng)血口服液，經(jīng)指紋圖譜相似度軟件分析，相似度均在0.85以上，所建立方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求，為參芪王漿養(yǎng)血口服液及其制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。根據(jù)該指紋圖譜可對參芪王漿養(yǎng)血口服液進(jìn)行HPLC-IT MS和HPLC-TOF MS分析，定性鑒別出參芪王漿養(yǎng)血口服液的多種成分，如人參皂苷等數(shù)十種成分，進(jìn)一步完善參芪王漿養(yǎng)血口服液的研究，為參芪王漿養(yǎng)血口服液的深入研究提供了良好的基礎(chǔ)。

[1] 金光日，洪海.參芪王漿養(yǎng)血口服液中10-羥基-2-癸烯酸(10-HAD)的含量測定[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，23(5)：32-33

[2] 羅國安，梁瓊麟，王義明.中藥指紋圖譜-質(zhì)量控制與新藥研發(fā)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

[3] 羅國安，王義明.中藥指紋圖譜的分類和發(fā)展[J].中國新藥雜志，2002(11):46-51.

[4] 肖雪，羅國安，王義明，等.中藥板藍(lán)根高效液相色譜法指紋圖譜研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，22(3)：67-69.

[5] 李福龍，羅娟敏，張文惠，等.桔梗藥材指紋圖譜研究[J].江西中醫(yī)藥，2014，45(3)：65-66.

[6] 羅娟敏，肖雪，梁瓊麟，等.丹紅注射液指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33(8)：1277-1290.

[7] 喬善磊.中藥指紋圖譜相似度評價研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2004.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Study on Fingerprints of Nourishing Oral Liquid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root by HPLC

Zu Shuang1, Liang Jie2, Liu Mingying3, Xiao Xue2,4*

(1. Jilin Aodong Medicine Industry Group Co. Ltd., Yanbian 133700,China;2. Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China;3. Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangzhou 510250,China;4. Nansha Research Institute, Sun Yat-sen University, Guangzhou 511458,China)

Objective:To study the HPLC fingerprint and establish a sensitive and specific method for controlling the quality of Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root (NOLRJGA). Methods:HPLC method was set up using Agilent Zorbax-SB C18column(4.6mm×250mm, 5μm) with gradient elution, the mobile phase was comprised of acetonitrile and water, the UV detection wavelength was at 203nm, with a flow rate of 1.0mL/min. Results:The HPLC fingerprint was set up successfully, and the similarity were higher than 0.85 with a total of 13 peaks as reference peaks by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM.Conclusion:The quality of NOLRJGA can be controlled effectively by HPLC fingerprints.

Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly；Ginseng and Astragalus Root;HPLC;Fingerprint

2014-09-11

祖雙(1970-)，男，吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司主管藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail：zushuang2008@126.com

梁潔(1969-)，女，碩士，廣東藥學(xué)院副教授，研究方向?yàn)楣δ苁称放c公共營養(yǎng)。E-mail：liangjie69@126.com

R284

A

1673-2197(2015)02-0019-03

10.11954/ytctyy.201502008