李慶等

摘要石斑魚不僅是重要的海水經濟魚類，而且具有重要的生態(tài)地位。但是，石斑魚的分類、物種多樣性、資源保護及其合理開發(fā)等需要對石斑魚系統(tǒng)發(fā)育的分析與研究。線粒體基因是研究石斑魚系統(tǒng)進化的理想分子標記，因此獲得了青石斑魚E.awoara長度為1 039 bp 的16S rDNA、tRNA-Leu和NA1部分序列，基于其及ND2、cyt b對石斑魚系統(tǒng)發(fā)育進行了分析，結果表明石斑魚遺傳多樣性與地域分布關系不大，不同系統(tǒng)樹分析都表明同一石斑魚物種的系統(tǒng)發(fā)生關系基本一致，石斑魚種間親緣關系較近。此外，也發(fā)現某些異種間親緣關系比同種間親緣關系近的現象。

關鍵詞石斑魚；遺傳多樣性；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號S965.44；Q17文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）29-075-05

石斑魚是石斑魚屬（Epinephelus）魚類的統(tǒng)稱，隸屬鱸形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、石斑魚亞科（Epinephelinae），其種類多，分布廣。我國有石斑魚種類46種，主要分布在南海和東海南部。石斑魚是重要的世界性海洋經濟魚類之一，在海洋生態(tài)中占有重要地位，也是重要的海水增養(yǎng)殖對象。但是，海洋環(huán)境污染、過度捕撈、養(yǎng)殖群體的近親繁殖等已使魚類資源不斷衰退，部分種類已被列為瀕危物種。在我國科技興海戰(zhàn)略中，石斑魚的合理開發(fā)和資源保護已迫在眉睫。

石斑魚為定居性魚類，形態(tài)保守，石斑魚的分類多以體形、條紋、體色、斑點、骨骼等性狀為主要依據。但是不同生境、應激狀態(tài)及不同發(fā)育階段下，很多石斑魚種類的體色和斑紋常會發(fā)生明顯變異，石斑魚種類鑒定困難，有時會造成種類鑒定上的失誤，增加了系統(tǒng)發(fā)生關系研究的難度。此外，石斑魚中還存在同名異種及同種異名的現象，甚至在生態(tài)系統(tǒng)破壞壓力之下，石斑魚親緣關系相近的種類可能也存在雜交現象。因此，這給物種多樣性研究、漁業(yè)資料保護和合理利用及石斑魚育種養(yǎng)殖帶來一定的困難，也給養(yǎng)殖生產中親本和魚種的引進和鑒定帶來了一定的困難。然而，隨著分子生物學的發(fā)展，分子系統(tǒng)學方法的應用為石斑魚傳統(tǒng)分類提供了重要佐證和補充修正。

動物線粒體DNA具有序列簡單和進化速度快等特點，在魚類分子系統(tǒng)學研究中得到廣泛應用。對石斑魚線粒體DNA的分析表明，線粒體基因，尤其是16S rDNA、cyt b和ND2基因是對石斑魚屬內種間系統(tǒng)進化分析進行評估的理想分子標記[5-7]。筆者獲得了青石斑魚（E.awoara）的16S rDNAtRNALeuDA1序列（16S rDNA、tRNALeu和部分DA1序列），分析石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的遺傳多樣性，比較青石斑魚（E.awoara）分子系統(tǒng)發(fā)育關系與傳統(tǒng)分類的異同，并基于目前GenBank數據庫中已知石斑魚cyt b和ND2基因完整序列分析石斑魚的系統(tǒng)發(fā)生關系及空間距離對石斑魚遺傳多樣性的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用石斑魚。青石斑魚（E.awoara）購自湛江某石斑魚養(yǎng)殖場，活體運回實驗室后，取肌肉組織放入-80 ℃超低溫冰箱中備用。試驗所用其他石斑魚相關信息及基因序列來源于GenBank數據庫。

1.1.2菌株與載體。大腸桿菌DH5α菌株由廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保存，pMD18T載體pEGFPN3載體購自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取。取青石斑魚（E.awoara）肌肉組織約50 mg，采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提方法進行基因組DNA提取。

1.2.2青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的克隆。

根據GenBank數據庫上的同源序列設計并擴增青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1基因的引物為16SF （5′GGCTGTGGAGTCAACCAG–3′）和16SR （5′GGCTTHAGRTCTCTGTG3′）。

PCR反應體系（25 μl）為：ddH2O 15.5 μl、DNA（約30 ng）2 μl、引物（10 μmol/L） 1 μl、dNTPs （2.5 mmol/L） 2 μl、10×ExTaq Buffer 2.5 μl、ExTaq酶 （1 U/μl） 0.125 μl。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳產物純化回收后與pMD18T載體連接，轉化至大腸桿菌 DH5α菌株，篩選陽性克隆并送至上海生工生物有限公司測序鑒定。

1.2.3石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2遺傳多樣性及石斑魚系統(tǒng)發(fā)育分析。

應用DNAstar軟件（Lasergene）并結合人工調整，對石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2序列分別進行排列；應用MEGA軟件分析變異位點、信息位點和遺傳距離。

應用ModelTest分別模擬石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2進化模式，并將不同的模擬結果作為參考值構建系統(tǒng)樹?；?6S rDNAtRNALeuDA1、cyt b和ND2分別用MEGA軟件構建最大簡約樹（MP）、最大似然樹（ML）、最小進化樹（ME）、非加權組平均樹（UPGMA）和鄰接樹（NJ）。分別用MrBayes軟件進行Bayesian分析，并采用genera1timereversible+gamma+invariants（GTR+G+I）序列進化模型和Markov Chain Monte Carlo（McMc）取樣方式估計系統(tǒng)發(fā)生關系。MrBayes分析參數為：nst=6，rates=gamma，進行100 000 次重復檢驗后，獲得系統(tǒng)樹的支系結構和各支的置信度。后驗概率和系統(tǒng)樹枝長計算參數為：bumin=500，contype=allcompat。分別用PAUP軟件進行運算，Heuristic搜索采用二分支方式構建系統(tǒng)樹支系（TBR branch swapping），并加入隨機序列重復抽樣；系統(tǒng)樹各支的置信度，通過Bootstrap[12]重復抽樣1 000次后獲得。同時，基于CYTB和ND2蛋白序列構建系統(tǒng)樹。

2結果與分析

2.1青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1的克隆

從圖1可以看出，經PCR擴增、克隆和測序，獲得青石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列，長度為1 039 bp（GenBank編碼：KR703819），經Blast檢索其與青石斑魚E.awoara 相應基因（JX109835）的相似率為97.7%。

2.2石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1遺傳多樣性及基于其石斑魚系統(tǒng)發(fā)育分析

分析27尾魚的16S rDNAtRNALeuDA1序列含有308個變異位點和160簡約信息位點。對石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列分析發(fā)現，采集于同一地域的分離株16S rDNAtRNALeuDA1的同源率為100%，如采集于我國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377、KJ700440、KM458971和NC011113）、寶石石斑魚E.areolatus（KC466080、KC593374和NC020785）、青石斑魚E.awoare（JX109835和NC018773）、橙點石斑魚E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜帶石斑魚E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小紋石斑魚E.epistictus（KC816460和NC021462）、擬青石斑魚E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐點石斑魚E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、寬帶石斑魚E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑魚E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六帶石斑魚E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑魚E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑魚E.trimaculatus（KC847086和NC021612）與黑斑石斑魚E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韓國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和NC013820）與七帶石斑魚E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑魚E.merra（AP005991和NC022509）。將GenBank數據庫中非相同的石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列進行比對，計算兩兩序列間的相似度和遺傳距離（表1），并構建系統(tǒng)樹（圖2）。

基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1序列所構建系統(tǒng)樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，石斑魚兩兩間的遺傳距離普遍較?。粡倪z傳距離和系統(tǒng)樹分析來看，該試驗所用石斑魚確定為青石斑魚（E.awoara），與傳統(tǒng)方法分類相一致；采集于不同地域的同一種石斑魚多聚在一起，如采集于中國和韓國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377/China和KJ700439/Korea）以及采集于中國和馬來西亞的鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/ China和HQ660062/Malaysia）；但采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）沒有聚在一起，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）卻與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China間的遺傳距離為0.013，而褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的遺傳距離僅為0.001。呈現出的矛盾是褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的親緣關系比褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者間的親緣關系更近，因此將基于石斑魚cyt b和ND2基因序列進一步分析石斑魚間的系統(tǒng)發(fā)生關系。

2.3石斑魚ND2基因遺傳多樣性分析及基于ND2基因石斑魚系統(tǒng)發(fā)育分析

分析中ND2基因序列含有641個變異位點和413個簡約信息位點。石斑魚ND2基因序列分析結果與16S rDNAtRNALeuDA1分析結果基本一致，采集于同一地域的分離株ND2的同源率多為100%，如采集于中國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377和NC011113）、寶石石斑魚E.areolatus（KC466080和NC020785）、青石斑魚E.awoare（JX109835和NC018773）、布氏石斑魚E.bleekeri（KF556648和NC022848）、斜帶石斑魚E.coioides（NC011111、EU043376和KM377093）、小紋石斑魚E.epistictus（KC816460和NC021462）、擬青石斑魚E.fasciatomaculosus（KC480085和NC020782）、褐點石斑魚E.fuscoguttatus（JX119192和NC020046）、鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ4723837和NC011715）、寬帶石斑魚E.latifasciatus（KC480177和NC020784）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、KP009977和NC017891）、玳瑁石斑魚E.quoyanus（KC790539和NC021450）、六帶石斑魚E.sexfasciatus（KC959953和NC021765）、南海石斑魚E.stictus（KC527593和NC021133）、三斑石斑魚E.trimaculatus（KC847086和NC021612）與藍身大斑石斑魚E.tukula（KJ414470和NC024039），采集于韓國的褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和NC013820）與七帶石斑魚E.septemfasciatus（FJ594966和NC013829）以及采集于日本的蜂巢石斑魚E.merra（AP005991和NC022509）。

基于石斑魚ND2基因序列和ND2蛋白序列構建系統(tǒng)樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，石斑魚兩兩間的遺傳距離普遍較??；同一種石斑魚多聚在一起，與不同地域的關系并不大，如采集于中國和韓國的赤點石斑魚E.akaara（EU043377/China、KJ700440、KM458971和KJ700439/Korea）及采集于中國和馬來西亞的鞍帶石斑魚E.lanceolatus（FJ472837/China、KM386619/China、KJ451389/China和HQ660062/Malaysia）；但是，采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China沒有聚在一起，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）卻與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）聚在一起。采集于韓國和中國的褐石斑魚E.bruneus FJ594964/Korea和JQ51828/China二者間的遺傳距離為0.052，而褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的遺傳距離僅為0.001。這再次表現出與基于16S rDNAtRNALeuDA1分析相同的矛盾，即褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea）與云紋石斑魚E.moara（JQ518289/China）的親緣關系比褐石斑魚E.bruneus（FJ594964/Korea和JQ51828/China）二者間的親緣關系更近（圖3）。

2.4石斑魚cyt b基因的遺傳多樣性分析及基于cyt b基因石斑魚系統(tǒng)發(fā)育分析

已知石斑魚cyt b基因序列較多，140尾橫帶石斑魚（E.fasciatus）不同個體cyt b基因序列間相似度為95.4%～99.9%，24尾褐點石斑魚（E.fuscoguttatus）不同個體cyt b基因間的相似度為97.5%～99.9%。

基于石斑魚cyt b基因序列和CYTB蛋白序列構建系統(tǒng)樹的拓撲結構基本一致，石斑魚分為兩大分支，此系統(tǒng)樹覆蓋石斑魚種類較多，系統(tǒng)發(fā)育關系比較復雜。

從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）、云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）與布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）聚為一小分支，而布氏石斑魚E.bleekeri（KF556648）與鮭點石斑魚E.fario（DQ372726和DQ486931）又聚為另一小分支，且此2個小分支相距較遠。從遺傳距離和相似率來看，2尾布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558和KF556648）間的遺傳距離和相似

率分別為0.151和86.1%，而其與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）間的遺傳距離分別和相似率分別為0.001、0.002和95.8%、95.9%或0.160、0.161和85.1%、85.2%，與鮭點石斑魚E.fario（DQ372726和DQ486931）間遺傳距離和相似率分別為0.151、0.153和

85.9%、86.1%和相似率分別或0.007、0.009和99.1%、99.3%。褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）的遺傳距離和相似率分別為0.001、0.002和99.8%、99.9%或 0.043、0.044和95.8%、95.9%），而兩尾褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）間的遺傳距離和相似率分別為 0.043和95.9%，三尾云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）間的遺傳距離和相似率分別為0.002、0.003和99.7%、99.8%。這再次呈現出與上述相似的矛盾，即布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）或布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558）與鮭點石斑魚E.fario（DQ486931）的親緣關系比兩尾布氏石斑魚E.bleekeri（AY963558和KF556648）的親緣關系還要近；褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427）的親緣關系比兩尾褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）的親緣關系要近，褐石斑魚E.bruneus（FJ594964和JQ518289）與云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427）的親緣關系類似于三尾云紋石斑魚E.moara（JQ518290、AY786427和KP009977）簡的親緣關系（圖4）。

3討論

筆者對石斑魚進行分子系統(tǒng)學研究，為石斑魚傳統(tǒng)分類提供了重要佐證和補充修正，在一定程度上減少物種鑒定的誤差。該研究所用石斑魚為青石斑魚（E.awoara）與傳統(tǒng)分類學鑒定結果相同。此外，該研究基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、ND2和cyt b對石斑魚系統(tǒng)發(fā)生關系和遺傳距離的分析發(fā)現，石斑魚遺傳多樣性與地域分布關系不大。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，基于石斑魚16S rDNAtRNALeuDA1、ND2基因構建的系統(tǒng)樹兩大分支物種相同，而基于石斑魚cyt b基因構建的系統(tǒng)樹石斑魚兩大支物種則有所不同，可能與此系統(tǒng)樹所含石斑魚物種比上述系統(tǒng)樹所含石斑魚物種較多有關，但此3個系統(tǒng)樹中相同物種石斑魚系統(tǒng)發(fā)生關系基本一致。同時，也再次證實了石斑魚線粒1體16S rDNA、ND2和cyt b基因可用于石斑魚分子系統(tǒng)學研究分析，目前已知石斑魚的cyt b基因最多，相關信息也較多，由此認為cyt b基因是研究石斑魚分子系統(tǒng)學的優(yōu)先選擇標記。

石斑魚分子系統(tǒng)學分析為相關科研和養(yǎng)殖應用帶來了很大幫助，筆者在該研究中不僅發(fā)現石斑魚種間親緣關系非常近，但也發(fā)現一些其他問題，如有的褐石斑魚E.bruneus與云紋石斑魚E.moara的親緣關系比褐石斑魚間的親緣關系還近，與云紋石斑魚E.moara間的親緣關系相似；有的布氏石斑魚E.bleekeri與云紋石斑魚E.moara或與鮭點石斑魚E.fario的親緣關系比布氏石斑魚E.bleekeri間的親緣關系還要近。這些問題的解決有待深入研究。同時，這些問題的呈現也說明了在石斑魚物種多樣性、漁業(yè)資料保護和合理利用及石斑魚育種養(yǎng)殖等方面的困難和不便，同時也體現了生態(tài)系統(tǒng)破壞給石斑魚生存帶來的壓力。研究表明，鹽度對斜帶石斑魚E.coioides生長、生理及抗病能力有顯著影響，鹽度漸變和驟變對褐點石斑魚E.fuscoguttatus存活和攝食也有影響[14]。

為徹底解決目前石斑魚面臨的問題，應保護石斑魚的物種多樣性、保護生態(tài)環(huán)境，深入研究石斑魚分類學和分子系統(tǒng)學，及時更正、修正已出現的失誤等。石斑魚種質資源問題不容忽視，如斜帶石斑魚E.coioides已被國際自然資源保護聯盟列入近危種[15]。

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