雷韜等

摘要[目的]考察微波預(yù)處理對(duì)油菜秸稈纖維素糖化的影響并優(yōu)化處理工藝。[方法]以油菜秸稈為材料，采用單因素試驗(yàn)研究了微波處理功率、時(shí)間、液固比、pH及纖維素酶酶量、酶解時(shí)間等處理?xiàng)l件對(duì)產(chǎn)糖率的影響，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法就預(yù)處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，利用Design Expert 8.0.5b軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立纖維素轉(zhuǎn)化條件的二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，產(chǎn)糖率的模型均極顯著（P<0000 1），擬合度良好。微波預(yù)處理對(duì)油菜秸稈纖維素糖化的適宜工藝條件：微波功率560 W，微波時(shí)間7.00 min，液固比24.15∶1 ml/g，pH 5.95，酶量6 640 IU/g。在此條件下，產(chǎn)糖率為25.339 4%。[結(jié)論]研究可為油菜秸稈的綜合利用提供技術(shù)支持。

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中圖分類號(hào)S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）29-287-05

油菜是我國(guó)重要的油料作物，種植面積和產(chǎn)量常年居于世界首位。油菜秸稈木質(zhì)部分的纖維組織發(fā)達(dá)，其纖維素含量為43.6%～47.3%。目前，國(guó)內(nèi)油菜秸稈的利用率極低，除了少數(shù)作為肥料、飼料、沼氣、食用菌等的原料外，絕大部分沒有得到有效利用，或是野外任意丟棄，或是田間焚燒，不僅浪費(fèi)了寶貴的有機(jī)質(zhì)資源，而且污染了環(huán)境。因此，對(duì)于利用開發(fā)油菜秸稈生產(chǎn)燃料乙醇的研究顯得尤為重要，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈資源化利用的有效途徑。筆者以產(chǎn)糖率為指標(biāo)，采用微波對(duì)油菜秸稈預(yù)處理工藝進(jìn)行初步研究，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法就預(yù)處理工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為油菜秸稈的綜合利用提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。油菜秸稈，采集于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園教學(xué)基地。纖維素酶，10 000 IU/g，由湖南鴻鷹翔生物工程有限公司提供。

1.1.2主要儀器與藥品。器材：EG720FA4NR微波爐，美的集團(tuán)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；HH60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；TH298臺(tái)式恒溫振蕩器，常州諾基儀器有限公司；DHG9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL303電子天平，上海梅特勒-托利多集團(tuán)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；722型分光光度計(jì)，北京科瑞海科學(xué)儀器公司。

藥品：葡萄糖、硫酸、3，5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉，分析純AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純AR，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2方法

1.2.1油菜秸稈的前處理。將采集的油菜秸稈剪成2～3 cm的小段，于50 ℃烘干后，粉碎成20目左右。備用。

1.2.2油菜秸稈的微波處理?xiàng)l件研究。稱取10 g油菜秸稈粉置于500 ml燒杯中，分別改變微波功率（70、210、350、560、700 W）、微波處理時(shí)間（6、7、8、9、10 min）、液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g）、溶液pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）等條件處理后，調(diào)節(jié)pH 5.0，按油菜秸稈干重加入3 000 IU/g纖維素酶，50 ℃下恒溫處理24 h，測(cè)定糖含量，并計(jì)算產(chǎn)糖率?？疾觳煌A(yù)處理?xiàng)l件對(duì)產(chǎn)糖率的影響，重復(fù)3次。

1.2.3酶解條件的確定。調(diào)節(jié)上述經(jīng)微波處理后的油菜秸稈粉溶液pH至5.0，分別加入不同量的纖維素酶（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g），于50 ℃水浴酶解不同的時(shí)間（8、16、24、32、40 h），抽濾，測(cè)定濾液的含糖量，計(jì)算其產(chǎn)糖率。

1.2.4油菜秸稈糖化條件的響應(yīng)面優(yōu)化。根據(jù)BoxBehnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波處理時(shí)間、液固比、微波處理pH和加酶量，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化油菜秸稈糖化條件。各因素水平的編碼表見表1。

1.2.5分析方法。糖含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行Duncan氏多重比較檢驗(yàn)均值的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1微波功率對(duì)產(chǎn)糖率的影響分別稱取10 g油菜秸稈粉置于500 ml燒杯中，按液固比20∶1 ml/g加入水，調(diào)節(jié)pH到5.5，采用70、210、350、560、700 W的輸出功率進(jìn)行微波處理后，測(cè)定處理液中糖的含量，并計(jì)算產(chǎn)糖率，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著微波處理功率增加，產(chǎn)糖率也隨之增加，當(dāng)微波處理功率為560 W時(shí)，產(chǎn)糖率最高，達(dá)27.13%。但加大微波功率，產(chǎn)糖率下降。

2.2微波處理時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖率的影響改變微波處理時(shí)間，其他條件不變，分別探討不同的微波處理時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖率的影響，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，當(dāng)微波處理時(shí)間為7 min時(shí)，產(chǎn)糖率達(dá)29.26%。但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)糖率下降，原因?yàn)樘幚頃r(shí)間過長(zhǎng)微波加熱會(huì)使溶液溫度過高，導(dǎo)致纖維素分子間發(fā)生部分團(tuán)聚，反而聚合度增加，糖化速度變慢。

2.3液固比對(duì)產(chǎn)糖率的影響分別改變液固比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 ml/g，其他條件不變，考察不同液固比對(duì)產(chǎn)糖率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，隨著液固比的增加，產(chǎn)糖率增加，當(dāng)液固比為25∶1 ml/g時(shí)，產(chǎn)糖率為22.15%。但當(dāng)液固比超過25∶1 ml/g時(shí)，隨液固比的增加產(chǎn)糖率緩慢降低。原因是提高液固比，有利于分散物料，使物料能充分受到微波處理，充分與酶接觸。但液固比過高時(shí)，水量增加，微波效率降低，同時(shí)底物濃度降低，酶解效率也降低，從而導(dǎo)致產(chǎn)糖率降低。

2.4微波處理pH對(duì)產(chǎn)糖率的影響用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)油菜秸稈液pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他條件不變，探討不同的pH條件下對(duì)微波預(yù)處理油菜秸稈產(chǎn)糖率的影響，結(jié)果見圖4。

酸性條件下有利于纖維素晶體結(jié)構(gòu)的破壞，降低纖維素的結(jié)晶度，從而有利于纖維素的水解，但pH過低時(shí)半纖維素結(jié)構(gòu)破壞產(chǎn)生抑制物。由圖4可見，隨著pH的提高，產(chǎn)糖率增加。當(dāng)pH為6.0時(shí)，產(chǎn)糖率為23.23%；但當(dāng)pH超過6.0時(shí)，產(chǎn)糖率下降。

2.5纖維素酶酶量對(duì)產(chǎn)糖率影響在得到適宜預(yù)處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上，按油菜秸稈干重分別加入2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 IU/g的纖維素酶，其他條件不變，探討纖維素酶量對(duì)產(chǎn)糖率的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著酶量的增加，產(chǎn)糖率顯著增加，當(dāng)酶量達(dá)到6 000 IU/g時(shí)，產(chǎn)糖率為30.43%。但當(dāng)酶量超過6 000 IU/g時(shí)，產(chǎn)糖率增長(zhǎng)不明顯。

2.6酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖率的影響將油菜秸稈處理液加酶后，置于50 ℃條件下恒溫處理8 h開始第1次取樣，以后每隔8 h取樣一次，測(cè)定處理液中糖含量，并計(jì)算產(chǎn)糖率，考察酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)糖率的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)糖率上升。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到32 h時(shí)，產(chǎn)糖率為29.61%。但當(dāng)酶解時(shí)間超過32 h，產(chǎn)糖率略有下降。原因?yàn)槊附猱a(chǎn)物積累到一定濃度，會(huì)產(chǎn)生反饋抑制，而且處理時(shí)間長(zhǎng)，微生物大量生長(zhǎng)而消耗部分糖進(jìn)而導(dǎo)致酶解液中糖的下降。

2.7響應(yīng)面處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.7.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。參照文獻(xiàn)進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)分析，共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為分析因子，3個(gè)為零點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，以估計(jì)誤差。以產(chǎn)糖率（R1）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.7.2產(chǎn)糖率的方差分析。根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，采用DesignExpert 8.0.5b軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合獲得以產(chǎn)糖率為響應(yīng)值的回歸方程：R1=24.43+0.41A-0.19B-0.24C+1.82D+0.087AB-0.56AC-0.37AD-0.59BC-0.11BD-0.44CD-1.10A2-0.85B2-1.48C2-0.51D2。

響應(yīng)面結(jié)果方差分析顯示：F模型=64.30，P模型<0000 1**；FA=30.16，PA<0.000 1**；FB=6.26，PB=0.027 8；FC=10.10，PC=0.008 0**；FD=583.20，PD<0.000 1**；FAB=0.45，PAB=0.514 8；FAC=18.79，PAC=0.001 0**；FAD=7.95，PAD=0.015 5；FBC=20.49，PBC=0.000 7**；FBD=0.68，PBD=0.425 6；FCD=1126，PCD=0.005 7**；FA2=94.51，PA2<0.000 1**；FB2=57.03，PB2<0.000 1**；FC2=171.58，PC2<0.000 1**；FD2=20.51，PD2=0.000 7；F失擬=0.83，P失擬=0.661 5。由此可知，A、C、D、AC、BC、CD、A2、B2、C2對(duì)產(chǎn)糖率的影響極顯著（P<0.01），說明微波處理時(shí)間、pH和酶量是纖維素糖化處理過程中的重要因素，表明回歸方程的一次項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)的影響都是高度顯著的。該模型回歸顯著（P<0.000 1），且失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，模型適當(dāng)，回歸方程擬合度良好。

采用DesignExpert 8.0.5b軟件分析模型的可信度，結(jié)果見表3。由表3可見，回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.986 8，表明98.68%的產(chǎn)糖率變化可由此模型解釋，與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好；校正相關(guān)系數(shù)為0.971 5，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)為0.933 2，兩者極為相近，說明其他因素的干擾較少。產(chǎn)糖率變異系數(shù)為1.15%，信噪比為25.508，說明該模型的可信度高。因此，可以用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)纖維素的糖化處理進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.7.3產(chǎn)糖率的響應(yīng)曲面分析。響應(yīng)面分析的圖形是特定的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)自變量構(gòu)成的一個(gè)三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對(duì)響應(yīng)值的影響[12]。采用DesignExpert 8.0.5b軟件對(duì)產(chǎn)糖率的回歸模型進(jìn)行分析，微波處理時(shí)間、液固比、微波處理pH和酶量4個(gè)因素交互影響產(chǎn)糖率的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖7～12。

從圖7～12可知，微波處理時(shí)間和液固比、微波處理時(shí)間和pH、液固比與pH對(duì)產(chǎn)糖率的交互作用顯著，而微波處理時(shí)間和酶量、液固比和酶量、微波處理pH和酶量對(duì)產(chǎn)糖率的交互作用不顯著。

2.7.4顯著因素水平優(yōu)化。由圖7～12給出的回歸方程的三維響應(yīng)面及等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定度，即最大值。并對(duì)產(chǎn)糖率的回歸方程分別求一階偏導(dǎo)等于零，得到模型的最佳因素編碼為：A=-0.121 4，B=0.216 3，C=-0.067 3，D=1.880 7，將其代入產(chǎn)糖率回歸方程，得到預(yù)測(cè)糖產(chǎn)率為26.167 8%。各編碼所對(duì)應(yīng)的A、B、C、D的實(shí)際取值為：微波處理時(shí)間為7.00 min，液固比為24.15∶1 ml/g，pH為5.95，酶量為6 640 IU/g。

2.7.5驗(yàn)證試驗(yàn)。按照優(yōu)化試驗(yàn)所得的各因素優(yōu)化值，即微波處理時(shí)間為7.00 min，液固比為24.15∶1 ml/g，pH為5.95，酶量為6 640 IU/g進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，產(chǎn)糖率依次為25.924 2%、25.336 8%、25.387 2%，平均產(chǎn)糖率為25.339 4%，與理論預(yù)測(cè)值25.428 3%的相對(duì)誤差為0.35%，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)油菜秸稈纖維素糖化的工藝條件。

3結(jié)論與討論

由于農(nóng)作物秸稈中纖維素分子形成結(jié)構(gòu)緊密的晶狀結(jié)構(gòu)，且被難以分解的木質(zhì)素纏繞包圍，使得纖維素酶對(duì)其可及性差，酶解糖化用酶量大且作用時(shí)間長(zhǎng)、效率低、成本高[13-14]。因此，酶水解之前的預(yù)處理是秸稈纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的關(guān)鍵技術(shù)[15-16]。預(yù)處理技術(shù)主要有物理處理、化學(xué)處理和生物處理法。倫曉中等應(yīng)用膨化技術(shù)對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，在溫度48 ℃，pH 4.5，液固比8∶1 ml/g，酶濃度36.0 U/g，酶解時(shí)間25 h的條件下，還原糖的轉(zhuǎn)化率為28.98%[17]。張木明等采用酸處理、堿處理和機(jī)械粉碎法對(duì)稻草秸稈進(jìn)行預(yù)處理后，酶解產(chǎn)糖率分別為9.25%， 33.16%和10.64%[18]。吳國(guó)杰等以稻草秸桿為原料，經(jīng)2%氫氧化鈉預(yù)處理后，獲得糖化率達(dá)40%的結(jié)果[19]。該研究在利用響應(yīng)面法得到油菜秸稈纖維素轉(zhuǎn)化生物乙醇的最優(yōu)條件為：微波處理功率560 W，微波處理7.00 min，液固比24.15∶1 ml/g，pH 5.95，酶量6 640 IU/g，在此條件下的理論產(chǎn)糖率為25.428 3%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均產(chǎn)糖率為25.339 4%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.35%，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)分析油菜秸稈纖維素微波預(yù)處理糖化的實(shí)際情況，可為油菜秸稈的綜合利用提供技術(shù)支持。

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