袁朋等

摘要： 在現(xiàn)行PCR檢測(cè)鴨坦布蘇病毒（DTMUV）方法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)制備DTMUV競(jìng)爭(zhēng)模板并以其為定量?jī)?nèi)標(biāo)物建立競(jìng)爭(zhēng)定量PCR（QC-PCR）體系。該體系特異性強(qiáng)、靈敏性高，競(jìng)爭(zhēng)模板和目標(biāo)模板可在400個(gè)分子/μL的水平上共擴(kuò)增。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，建立的體系能夠滿足簡(jiǎn)單快速確定病毒含量的要求。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；競(jìng)爭(zhēng)定量PCR；定量檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）03-0113-05

Establishment and Application of Quantitatively

Competitive PCR System for DTMUV Detection

Yuan Peng1，2*， Wang Bin3*， Xu Chuantian1， Yang Shaohua1， Huang Qinghua1， Zhang Xiumei1， Zhang Lin1**

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory of

Animal Diseases Control and Animal Breeding， Jinan 250100， China；2. College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural

University， Taian 271018， China； 3. Department of Bio-Engineering， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， China）

AbstractBased on the traditional PCR method for DTMUV detection， the competitive template targeting to DTMUV NS5 gene was designed and used as competitor in the quantitatively competitive PCR （QC-PCR） system with high specificity and sensitivity. The target and competitive templates could be co-amplified at the level of 400 molecules per microliter. The clinical application results indicated that the developed QC-PCR could simply， rapidly and quantitatively diagnose the content of DTMUV.

Key wordsDTMUV；QC-PCR；Quantitative detection

目前我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)迅速發(fā)展，肉鴨、蛋鴨存欄量和鴨肉出口量均居世界首位，但近年來(lái)隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，鴨病的發(fā)生也呈上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的危害日益嚴(yán)重。2010年，一種新型的鴨源黃病毒——鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus， DTMUV）在我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)爆發(fā)并迅速蔓延至全國(guó)，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，該病僅在2010年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)50億元。

DTMUV屬黃病毒科、黃病毒屬，為有囊膜不分節(jié)段單股正鏈RNA病毒[3]。鴨感染DTMUV后主要出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、采食量減少、產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降甚至絕產(chǎn)，并引起大量死亡。同時(shí)感染DTMUV的鴨還容易繼發(fā)傳染性漿膜炎、大腸桿菌病等其他疾病，且疾病發(fā)生后由于大量應(yīng)用藥物，導(dǎo)致藥物殘留嚴(yán)重，影響到鴨肉品質(zhì)和人類健康。此外，近年來(lái)動(dòng)物流感（H1N1、H7N9、H10N8）相繼爆發(fā)，病毒多次感染人類，造成死亡，嚴(yán)重危害人類健康，而水禽是流感病毒的重要自然儲(chǔ)存宿主。因此，控制鴨病毒性疾病的流行，不僅能夠減少養(yǎng)鴨業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，而且能夠促進(jìn)鴨產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展，保障人類健康。

目前尚沒(méi)有針對(duì)性的治療鴨坦布蘇病毒感染的藥物，亦缺乏有效的疫苗，因此對(duì)病毒進(jìn)行深入研究、開(kāi)發(fā)預(yù)防性和治療性藥物勢(shì)在必行。但DTMUV活力較差，體外培養(yǎng)穩(wěn)定性不足[4]，這種特性使得其滴度變化快，相關(guān)深入研究困難極大，所以找到一種能夠快速確定病毒含量且操作便捷的檢測(cè)方法是后續(xù)研究的保證。本研究基于PCR法快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)行定性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上[5，6]，設(shè)計(jì)制備DTMUV競(jìng)爭(zhēng)模板并以其為定量?jī)?nèi)標(biāo)物建立競(jìng)爭(zhēng)定量PCR（Quantitatively Competitive Polymerase Chain Reaction， QC-PCR）檢測(cè)體系，用于DTMUV的含量測(cè)定，為病毒的深入研究及預(yù)防控制提供強(qiáng)有力的手段和技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1毒株

DTMUV分離株、新城疫病毒La Sota株（Newcastle Disease Virus， NDV）、H9N2亞型禽流感病毒（Avian Influenza Virus， AIV）、禽呼腸孤病毒（Avian Reovirus， ARV）、減蛋綜合癥病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。

1.2試劑和材料

Ex Taq酶、禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、隨機(jī)引物（9 mer）、TRIzol Reagent購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。endprint

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1DTMUV的分離與擴(kuò)增無(wú)菌采集疑似DTMUV感染的病變組織，按常規(guī)處理方法制成勻漿，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清加入雙抗4℃作用4 h，然后經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，收取尿囊液進(jìn)行檢測(cè)和進(jìn)一步傳代培養(yǎng)。

1.3.2病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成按TRIzol Reagents（Invitrogen）試劑盒操作說(shuō)明提取病毒總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，總RNA 2 μL，5×Reverse transcriptase buffer 4 μL，dNTP （2.5 mmol/L）8 μL，RNA抑制劑0.5 μL，random primer（9 mer） 50 pmol，AMV 2 μL，DEPC水補(bǔ)足20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30℃ 10 min，42℃ 1 h，99℃ 5 min，4℃ 10 min，即合成cDNA第一鏈。

1.3.3引物設(shè)計(jì)與合成參照張琳等[6]建立的巢式PCR檢測(cè)DTMUV的方法和Celi等[8]構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)模板的原理，設(shè)計(jì)了3條針對(duì)DTMUV NS5基因的引物（表1），分別用于目標(biāo)模板（Object template， 以下簡(jiǎn)稱O）和競(jìng)爭(zhēng)模板（Competitive template， 以下簡(jiǎn)稱C）的擴(kuò)增，進(jìn)而用于可定量的競(jìng)爭(zhēng)PCR反應(yīng)。其中P1為共用上游引物，P2為擴(kuò)增O的下游引物，P4為擴(kuò)增C的下游引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.4目標(biāo)模板、競(jìng)爭(zhēng)模板的制備分別以P1/P2、P1/P4為上下游引物進(jìn)行O和C的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2 μL，上下游引物（100 pmol/μL）各0.5 μL，Ex Taq 酶0.5 μL，DTMUV cDNA第一鏈0.5 μL， ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸40 s， 30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外觀察拍照后，切膠回收，一部分與T載體連接后進(jìn)行測(cè)序；另一部分則于nanodrop上測(cè)定濃度，然后根據(jù)片段分子量，精確計(jì)算其所含分子數(shù)，10倍梯度稀釋制備不同濃度的O和C。

1.3.5QC-PCR檢測(cè)體系的建立以P1、P2為上下游引物進(jìn)行QC-PCR反應(yīng)，體系25 μL，其中包括10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol） 2 μL，P1和P2（100 pmol/μL）各0.5 μL，Ex Taq酶0.5 μL，病毒目標(biāo)模板0.5 μL，競(jìng)爭(zhēng)模板0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸40 s， 30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.6QC-PCR方法的準(zhǔn)確性取10倍系列稀釋的C分別加入不同反應(yīng)管中，隨后每個(gè)反應(yīng)管中加入同一濃度O進(jìn)行混合，最后加入QC-PCR反應(yīng)的其他組分進(jìn)行共擴(kuò)增，以驗(yàn)證建立的體系能否使C和O等量共擴(kuò)增。

1.3.7QC-PCR方法的特異性分別提取DTMUV、NDV、AIV、ARV的RNA和EDSV的DNA，RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。隨后分別加入制備的C，用1.3.5中建立的檢測(cè)體系進(jìn)行定性和定量共擴(kuò)增，以檢測(cè)體系的特異性。

1.3.8QC-PCR方法的靈敏性以1.3.4中制備的10倍系列稀釋的O和C為基礎(chǔ)，取相同濃度的兩種模板等量混合，從而得到一些含相同濃度O+C的反應(yīng)體系。采用建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，以確定兩模板可等量擴(kuò)增的最低濃度。

1.3.9QC-PCR方法的臨床應(yīng)用對(duì)送檢的發(fā)病鴨病料進(jìn)行無(wú)菌采集，加入5倍量PBS（pH 7.2）進(jìn)行研磨制成勻漿，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min，取上清按TRIzol Reagents（Invitrogen）試劑盒操作說(shuō)明提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用已建立的競(jìng)爭(zhēng)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1目標(biāo)模板與競(jìng)爭(zhēng)模板的獲得

在前期預(yù)試驗(yàn)確定的反應(yīng)條件下，分別以P1/P2、P1/P4為上下游引物擴(kuò)增O和C。結(jié)果顯示，獲得了兩條約為400 bp和350 bp的特異性條帶，分別與O和C大小相符，且測(cè)序結(jié)果與參考序列一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化、測(cè)定濃度，并計(jì)算出每微升分子數(shù)分別為4×1013和5.3×1012，將其分別稀釋成4×109個(gè)分子/μL的初始濃度后10倍系列稀釋，制備成4×109～4×102個(gè)分子/μL的系列O和C備用。

2.2QC-PCR反應(yīng)的建立

以P1、P2為上下游引物，備用的O和C為反應(yīng)模板進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)定量PCR反應(yīng)體系的建立。O和C使用相同濃度，經(jīng)電泳檢測(cè)（圖1）顯示，該體系成功擴(kuò)增353 bp和413 bp的條帶，且亮度相當(dāng)，引物二聚體幾乎不存在。表明等量模板在建立的競(jìng)爭(zhēng)體系中可等量高效擴(kuò)增。

2.3QC-PCR方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

在準(zhǔn)確性驗(yàn)證試驗(yàn)中，每個(gè)反應(yīng)由8個(gè)子PCR擴(kuò)增體系組成。在8個(gè)反應(yīng)管中首先分別加入制備的4×109～4×102個(gè)分子/μL的系列C各0.5 μL，然后加入同一濃度病毒目標(biāo)模板，最后加入反應(yīng)體系的其他組分。在本研究中，選擇濃度為4×107個(gè)分子/μL和 4×105個(gè)分子/μL的O進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證。結(jié)果（圖2、圖3）表明，兩個(gè)濃度的模板均能夠在建立的QC-PCR體系中與相同濃度的競(jìng)爭(zhēng)模板等量共擴(kuò)增，而與其他濃度不能等量共擴(kuò)增。

2.4QC-PCR方法的特異性endprint

應(yīng)用建立的QC-PCR反應(yīng)體系對(duì)DTMUV和其他對(duì)照病原（NDV、AIV H9N2、ARV、EDSV）在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增（體系組成同2.3），以檢驗(yàn)體系的特異性。結(jié)果顯示，對(duì)照病原反應(yīng)組結(jié)果相同，僅出現(xiàn)353 bp大小的條帶，而沒(méi)有413 bp擴(kuò)增產(chǎn)物，表明不含有擴(kuò)增的目的條帶；DTMUV反應(yīng)組則出現(xiàn)了353 bp和413 bp的條帶，且兩條帶在濃度為4×105個(gè)分子/μL時(shí)亮度相當(dāng)（圖4），所以DTMUV的病毒樣品濃度大概為4×105個(gè)分子/μL。

2.6QC-PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

提取15份送檢病料的核酸，應(yīng)用建立的QC-PCR體系進(jìn)行檢測(cè)，其中9份為陽(yáng)性，且病毒檢測(cè)量大致在4×103～4×107個(gè)分子/μL之間不等。

3討論

由于DTMUV活力較差，56℃加熱15 min即滅活，即使在37℃的環(huán)境中，24 h后病毒滴度下降也非常明顯，所以病毒含量是時(shí)刻變化的?；贒TMUV的不穩(wěn)定特性，在各項(xiàng)研究前進(jìn)行病毒含量的測(cè)定是十分必要的。雖然目前應(yīng)用于DTMUV的快速診斷方法較多，如RT-PCR[5]、巢式PCR[6]、RT-LAMP、熒光定量PCR、血清學(xué)方法[7]等，且檢測(cè)效果良好，但這些方法在滿足操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可定量檢測(cè)要求時(shí)表現(xiàn)出了極大的局限性：PCR和LAMP反應(yīng)有很高的敏感性和操作性，但不能夠?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量；熒光定量PCR能夠定量，但儀器昂貴、成本高；而血清學(xué)檢測(cè)方法試驗(yàn)要求較高，操作復(fù)雜。本研究建立的QC-PCR，一方面可以代替普通PCR反應(yīng)進(jìn)行定性反應(yīng)，鑒定樣品中是否含有目的核酸；另一方面還可以進(jìn)行定量反應(yīng)，將幾個(gè)普通的PCR反應(yīng)進(jìn)行組合，加入制備的競(jìng)爭(zhēng)模板即可對(duì)樣品進(jìn)行定量，以滿足對(duì)病毒降解狀況的了解。同時(shí)，建立的QC-PCR反應(yīng)體系具有很高的敏感性和特異性。

建立QC-PCR反應(yīng)體系的關(guān)鍵是競(jìng)爭(zhēng)模板（亦稱競(jìng)爭(zhēng)子，Competitor）的制備。DTMUV NS5基因在所有片段中保守性最高，且種間差異較大，最適合進(jìn)行DTMUV的定量檢測(cè)體系引物的設(shè)計(jì)。競(jìng)爭(zhēng)定量模板構(gòu)建的方法較多[8～12]，本研究采用Celi等構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)模板的原理，針對(duì)DTMUV的NS5基因設(shè)計(jì)了3條引物，成功地?cái)U(kuò)增得到比目標(biāo)模板少60 bp的競(jìng)爭(zhēng)模板。經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確性和敏感性試驗(yàn)，證明兩種模板在濃度相同時(shí)擴(kuò)增效率相近，符合QC-PCR的要求。

本研究建立的QC-PCR方法敏感性高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作簡(jiǎn)便，重要的是能夠基于DTMUV的特性進(jìn)行定量檢測(cè)，為研究人員明確DTMUV活力狀態(tài)、增殖特性及進(jìn)行后續(xù)的深入研究提供了強(qiáng)有力的手段。

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