陳 玉綜述，徐方平，劉艷輝審校

0 引 言

隨著后基因組時代的到來，人類的研究重點從基因組圖譜深入到功能基因組的領域?；虮磉_產(chǎn)物-蛋白質(zhì)參與了生物體內(nèi)幾乎全部的生命活動，而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在整個機體生理和病理過程中起到至關重要的作用。近年來，腫瘤基因組學、靶向治療等方面的研究顯著擴大了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在腫瘤治療中的應用。大量的基礎及臨床研究用于確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡關系，以明確誘導及維持腫瘤細胞轉(zhuǎn)化的關鍵樞紐及節(jié)點，而這些關鍵的樞紐及節(jié)點有望成為腫瘤診斷、預后預測及靶向藥物治療的分子標志物［1］。傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方法有酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀、Western blot 等，但這些方法都破壞了細胞的自然狀態(tài)，無法反映活細胞生理條件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的時空動態(tài)信息，也無法進行蛋白質(zhì)亞細胞定位。近年來熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)技術的研發(fā)解決了以上問題。FRET 通過非輻射能量轉(zhuǎn)移原理，可以定時、定量、定位、動態(tài)地觀察活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用［2］。FRET 技術在生物、化學、醫(yī)學等眾多領域中得到快速發(fā)展，應用日益廣泛。2013 年Science 報道了結合FRET 與超寬帶超速紫外線二維光譜儀，捕捉到肌紅蛋白中色氨酸與亞鐵血紅素之間的瞬時超速電子轉(zhuǎn)移，有助于研究蛋白質(zhì)中色氨酸介導的電子轉(zhuǎn)移，從而擴大了FRET在蛋白質(zhì)結構及動力學如蛋白質(zhì)折疊等研究中的應用［3］。文中就FRET 技術的原理及應用，尤其是在腫瘤研究中的應用作一綜述。

1 FRET 的技術原理

FRET 指的是2 個熒光團之間的能量轉(zhuǎn)移。當2 個熒光發(fā)射基團足夠靠近時，作為能量供體的分子吸收了一定頻率的激發(fā)光后激發(fā)到更高的電子能態(tài)，通過振蕩偶極子作用將能量轉(zhuǎn)移給處于基態(tài)的作為能量受體的分子，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移［4］。FRET發(fā)生需有以下3 個必要條件:首先，2 個熒光團之間距離必須足夠近，一般為1 ～10 nm;其次，供體與受體之間存在適當?shù)亩ㄎ环较?第三，供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜(又稱吸收光譜)之間必須有相當程度的重疊［5］。FRET 的效率(E)是指供體經(jīng)FRET 轉(zhuǎn)移給受體的能量占供體釋放總能量的比例，E 的計算公式為:

(Ro 為F?rster 距離常數(shù)，R 為供體與受體的實際距離)

其中相當于受體接受50%FRET 能量時與供體的距離，與供體及受體本身特性、媒介的折射指數(shù)、供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜重疊程度、供體與受體相對定位角度等相關，通常為2 ～8 nm［6］。由此可見，F(xiàn)RET 的效率主要依賴于供體與受體的距離及相對定位。

盡管FRET 理論早在20 世紀已提出，但這項技術在活細胞中的應用是在1992 年首次從一種學名為Aequorea victoria 的水母中克隆出完整的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因后才大力發(fā)展起來的［7］。因GFP 具備發(fā)光無需輔助因子及作用底物，易于在活細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，且與之構建的融合蛋白在活細胞內(nèi)仍正常行使功能等特性，故成為一個極佳的在活細胞內(nèi)觀察蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的報告分子。近年來發(fā)展出多種GFP 的突變體，可發(fā)出不同顏色的熒光，其中應用最廣的是青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)和黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。CFP 的發(fā)射光譜與YFP 的吸收光譜有相當程度重疊，可參與融合蛋白的構建。當2 個分別融合了CFP、YFP的蛋白相互作用時，所融合的CFP、YFP 隨之相互靠近，激發(fā)CFP 吸收波長433 nm 的激發(fā)光后發(fā)生FRET，檢測到波長為527 nm 的YFP 熒光。

2 FRET 的應用

FRET 可實時檢測2 個生物大分子間的相互作用，也可研究分子內(nèi)部變化，因此在生物醫(yī)學中應用廣泛，其在活細胞水平研究蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)構象、鈣離子濃度測定及蛋白質(zhì)之間的相互作用都有應用。而在腫瘤的研究中，分子機制、信號傳導通路已成為研究熱點，人們認為腫瘤基因信號轉(zhuǎn)導通路中的信號分子很可能成為抗癌藥物的作用靶點，基于FRET 原理設計的生物傳感器可將活細胞內(nèi)信號分子的作用活性可視化，更助于活細胞內(nèi)信號通路的研究［8］。因此，在腫瘤診斷、預后及靶向藥物治療等領域的FRET 應用也越來越多。2.1 FRET 在腫瘤基礎研究中的應用 蛋白激酶是大多數(shù)生物信號通路的核心，在許多腫瘤的病理機制中起至關重要的作用。最近，熒光報告分子與基于FRET 原理設計的生物傳感器的發(fā)展為在生理條件下觀察蛋白激酶活性及動態(tài)行為提供了大量成像方法，可達到實時、高時空分辨率及不破壞其自然生理結構及功能條件下檢測蛋白激酶活性。熒光生物傳感器可用于研究生理及病理狀態(tài)下蛋白激酶的活性、結構及功能。應用FRET 原理，Zhang 等［7］設計出幾種基因編碼的探針用于研究蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、Src、Abl、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等4 種已知酪氨酸激酶的活性。這種探針包含一個相關蛋白激酶特異的底物結構域，一個與底物相結合的磷酸化識別結構域，以及兩端分別相連CFP、YFP 或其變異體。當?shù)孜锪姿峄螅肿觾?nèi)底物結構域與磷酸化識別結構域相結合，兩端的CFP、YFP 靠近產(chǎn)生FRET。在生長因子刺激誘導下，以上幾種酪氨酸激酶被激活，利用FRET 探針可檢測到25%～35%的活性變化。

然而，敏感的FRET 生物傳感器由于設計困難，阻礙了FRET 在腫瘤研究中的廣泛應用。FRET 效率不僅與受體、供體間的距離相關，還與兩者相對位置有關，在依賴距離的模型中，傳感器與配體結合導致FRET 增加;在依賴相對位置的模型中，傳感器與配體結合之前FRET 已經(jīng)增高，來源于GFP 的熒光蛋白易于相互形成二聚化物，而這種二聚化作用會加強FRET 效應［9］。由于缺乏FRET 生物傳感器的三維結構，很難預測何種模型會占主導地位。Komatsu 等［10］設計了一個較長的連接傳感器與配體結構域的連接器(EV 連接器)克服了以上困難。EV連接器由116 個氨基酸組成，可消除熒光基團的二聚化作用，使FRET 效率主要依賴距離。該研究促進了FRET 技術在激酶及三磷酸鳥苷酶中的應用，幫助破譯活細胞內(nèi)信號分子的作用。Kazuhir等［11］在此基礎上改進了多種FRET 生物傳感器的設計，使其監(jiān)測癌基因產(chǎn)物的活性效果更佳。如為檢測Ras 活性的FRET 生物傳感器Raichu-Ras，其顯示在表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)誘導下板狀偽足上的Ras 活性增高，且受體YFP/供體CFP 的比值反映了FRET 效率。生物傳感器Prin-c-Raf 可監(jiān)測與Ras 結合誘導的c-Raf 構象改變，且FRET 效率與c-Raf 活性呈負相關，由此可觀察到c-Raf 在細胞質(zhì)膜上的分布及構象變化。Picchu-CrkII 同樣用于監(jiān)測CrkII 致癌基因產(chǎn)物的構象改變。CrkII 是EGFR 的底物，在EGF 刺激的作用下可觀察細胞質(zhì)膜上CrkII 磷酸化作用廣泛地增加，因此，通過觀察CrkII 磷酸化水平可反映EGFR活性。該研究團隊還設計了幾種新的FRET 生物傳感器以檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，如RSK、S6K、AKt、PKC 等，其中S6K 可有助于mTORC1 信號通路活性的可視化［10］。

同理，Kumagai 等［12］設計了檢測細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活性的FRET 生物探針，并建立表達該探針的小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)-Neu 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，后者常用于人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)/Neu 陽性的乳腺癌研究，而HER2/Neu 的轉(zhuǎn)錄生長信號主要通過Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路調(diào)控。該研究發(fā)現(xiàn)ERKhigh的細胞在體內(nèi)、體外均較ERKlow細胞成瘤速度慢，推測高ERK 活性可能抑制乳腺癌干細胞的自我更新。

FRET 不僅可以用于蛋白質(zhì)間相互作用的研究，還可用于研究DNA、RNA 間的相互作用。Huang等［13］首次利用雙鏈RNA 作為FRET 探針，定量檢測健康人及腫瘤患者血清中的位點特異性核糖核酸酶A(RNase A)活性，發(fā)現(xiàn)胃癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌及肺癌患者血清中RNase 活性顯著降低，而乳腺癌、結腸癌患者則輕微降低，從而推測RNase A 將來有可能作為檢測某些特定腫瘤的生物標記，幫助腫瘤的早期診斷。

細胞內(nèi)復雜的生命活動是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡來調(diào)節(jié)的，該網(wǎng)絡常常是2 個以上的多種蛋白質(zhì)之間相互作用。最近發(fā)展起來的三色FRET技術(three-chromophore FRET)可研究3 種不同蛋白質(zhì)之間的相互作用。三色FRET 技術是通過將3 種熒光蛋白分別標記3 個不同的生物分子，觀察到3 種熒光蛋白之間連貫發(fā)生2 次FRET 過程，從而推測3 個生物分子之間的相互作用關系。這一技術方法有助于研究更為復雜的蛋白質(zhì)相互作用關系。Lopez-Gimenez 等［14］利用連續(xù)三色FRET 技術研究證實腎上腺素受體α1b(G 蛋白偶聯(lián)受體)是以高階寡聚物的形式而不是二聚化形式存在，其寡聚化效應與受體蛋白成熟、質(zhì)膜表面?zhèn)鬟f以及信號傳導功能相關。跨膜區(qū)Ⅰ及跨膜區(qū)Ⅳ共同突變?yōu)轱@著負效應突變體，而僅有跨膜區(qū)Ⅰ突變不足以產(chǎn)生負效應，跨膜區(qū)Ⅳ單獨突變則可阻礙質(zhì)膜表面信號傳遞。

2.2 FRET 在腫瘤診斷及藥物研發(fā)中的應用 除了在以上這些基礎研究中的應用，基于FRET 原理的熒光生物傳感器還為腫瘤早期診斷、疾病進展、監(jiān)測治療反應、高通量篩查候選藥物及評估藥物成分等研究提供了強有力的工具。Mizutani 等［15］首次將基于FRET 原理設計的可檢測BCR-ABL 激酶活性的基因編碼生物傳感器應用于臨床。CrkL 是BCRABL 酪氨酸激酶的底物，其磷酸化在癌基因信號轉(zhuǎn)導中起到重要的作用，具有致癌潛能［16］。甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylat，IM)為一種經(jīng)過認證的酪氨酸激酶抑制劑，可阻礙BCR-ABL 的ATP 結合位點，用于費城染色體陽性慢性髓細胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的治療［17］，但CML加速期或急變期患者易出現(xiàn)耐藥，目前對耐藥機制的研究認為是ABL 激酶結構域的點突變阻礙了其與分子靶向藥物的結合［18］。因此，對于IM 治療無效的患者應及時應用第二代治療藥物如尼羅替尼(nilotinib，NL)、達沙替尼(dasatinib，DS)等［19］。Mizutani 等［15］構建了一個包含CrkL 的蛋白，其中CrkL 兩端分別連接Venus(YFP 的變異體)及增強型CFP。當BCR-ABL 存在時，CrkL 的SH2 結構域在分子內(nèi)與磷酸化的酪氨酸(Y207)結合，其兩端的Venus 及CFP 距離靠近，F(xiàn)RET 效應增強。該融合蛋白可用于檢測IM 抑制BCR-ABL 激酶活性的效能，IM 導致FRET 效能的減少是劑量依賴性的，當IM的濃度≥0.1 μmol/L 時，即可觀察到FRET 效應顯著減少。而用免疫印跡或流式細胞儀方法檢測內(nèi)源性CrkL 磷酸化狀態(tài)時，要求IM 的濃度至少達到0.5 μmol/L 才能觀察到顯著性差異。應用延時雙重發(fā)射熒光顯微鏡可顯示IM 治療期間FRET 效應減少的時間動態(tài)改變，24 h 后大部分細胞內(nèi)FRET 效應已被IM 完全抑制。因此，應用FRET 方法及生物探針評估CML 分子靶向治療藥物的效果是高度敏感且實用的。將缺乏BCR-ABL 表達的細胞(293F)的FRET 平均發(fā)射比值(D-FRET)作為閾值，低于該值的細胞稱為FRETlo，高于該值的細胞稱為FREThi。通過觀察表達BCR-ABL 的CML 細胞群中FREThi細胞的比例可幫助及時發(fā)現(xiàn)耐藥細胞及篩選第二代治療藥物。FRET 方法可評估單個細胞中藥物的直接效應，而免疫印跡、流式細胞儀等方法需要固定、溶解或透化細胞，可能導致BCR-ABL 蛋白快速降解從而低估了BCR-ABL 蛋白水平，F(xiàn)RET 可檢測生理狀態(tài)下的活細胞內(nèi)BCR-ABL 蛋白狀態(tài)。該研究還發(fā)現(xiàn)帶有G250E 點突變的BCR-ABL 蛋白對NL 的敏感性是依賴其劑量濃度的，從而可以解釋O'Hare等［20］研究發(fā)現(xiàn)G250E 點突變對NL 敏感而Redaelli等［21］的研究結論卻與之相反的爭議［16］。因此，應用FRET 原理及FRET 生物探針方法可用于CML 的診斷、監(jiān)視抗癌藥物的治療反應及耐藥細胞的檢測，并進一步用于直接評估激酶抑制劑效應，幫助預測采用第二代抑制劑或新的針對耐藥突變治療藥物的種類與時間。近年來，F(xiàn)RET 技術也陸續(xù)用于其他腫瘤的藥物研發(fā)如胰腺癌［22］、乳腺癌［12］等。

2.3 FRET 聯(lián)合其他技術在腫瘤研究中的應用FRET 還可與其他技術結合，如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、流式細胞儀技術、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移、近紅外技術等，擴大其應用領域。以下簡單介紹幾種FRET 與其他技術結合在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的應用。

DNA 甲基化是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳修飾，啟動子區(qū)域的異常甲基化經(jīng)常發(fā)生于富于CG(又稱CpG 島)的片段，可干擾基因轉(zhuǎn)錄并直接導致基因沉默。這種甲基化常發(fā)生于抑癌基因的啟動子區(qū)域，不僅與腫瘤發(fā)生相關，還與腫瘤分級、分期、復發(fā)、轉(zhuǎn)移等預后有關。而這一表觀遺傳學改變發(fā)生于腫瘤形成之前，可視為一種潛在的生物標記物，并可應用于腫瘤的預防和治療［23］。隨著表觀遺傳學修飾方法在骨髓增生異常綜合征治療中的應用已通過FDA 認證，檢測抑癌基因啟動子區(qū)域異常高甲基化狀態(tài)已成為癌癥早期診斷、監(jiān)測腫瘤進展及靶向治療的工具。Bailey 及其研究團隊將高特異性的甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)與高靈敏度的量子點熒光共振能量轉(zhuǎn)移(quantum dot FRET，QD-FRET)結合，形成甲基化特異性的量子點熒光共振能量轉(zhuǎn)移(methylation specific quantum dot FRET，MS-qFRET)方法，可定性和定量地檢測甲基化DNA［24］。在MS-qFRET 中，經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏げ话l(fā)生轉(zhuǎn)變，通過PCR 擴增，其中正向引物經(jīng)過生物素化，逆向引物標記了有機熒光團Cy5，與鏈親和素結合的量子點可捕捉標記的擴增產(chǎn)物，量子點作為供體，將能量轉(zhuǎn)移給經(jīng)擴增后與產(chǎn)物融合的受體Cy5，因此，根據(jù)FRET 水平可確定DNA 甲基化狀態(tài)。在此研究中，P15INK4B啟動子甲基化狀態(tài)可作為急性髓細胞性白血病的預測及預后指標，且與FRET 效能呈直線相關，應用MS-qFRET 方法可檢測DNA 豐富的樣本如腫瘤組織或細胞株中的P15INK4B甲基化狀態(tài)，也可用于DNA 稀少的樣本如血清、唾液中P15INK4B甲基化狀態(tài)的檢測。因此，MS-qFRET 在臨床診斷、預后方面的應用具有巨大的潛力。

近紅外技術是指利用生物組織對700 ～900 nm近紅外區(qū)光子量吸收最弱，近紅外光可穿透組織層，從而對深部腫瘤成像。由于其在生物組織內(nèi)較少吸收和輻射，將近紅外染料與FRET 技術結合，較其他熒光染料優(yōu)勢明顯。NF-κB 蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其家族蛋白在細胞增殖及抑制凋亡中發(fā)揮重要作用［25］。NF-κB 信號通路的激活主要依賴于p50蛋白的活化［26］。利用近紅外染料Cy5.5 和Cy7 分別作為供著和受者與雙鏈寡聚核苷酸探針連接，后者可與p50 蛋白特異結合，當p50 蛋白加入后，可觀察到FRET。從而可研究p50 蛋白與寡核苷酸的相互作用。

FRET 與實時PCR 結合，可同時對濾泡性淋巴瘤標本中BCL-2 基因重排、MBR/JH 易位進行定性和定量檢測［27］。利用FRET 探針進行PCR 擴增，并結合SYBR GreenⅠ熒光蛋白溶解曲線分析，可快速、簡單、有效地檢測出骨髓或外周血中的腫瘤細胞，有助于評估患者腫瘤進展及治療情況。

3 展 望

綜上所述，F(xiàn)RET 技術已在生物醫(yī)學的基礎研究、疾病診斷(尤其是惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn))、藥物研發(fā)等方面有廣泛的應用，但其本身仍存在一些挑戰(zhàn)，如生物傳感器的設計、高效轉(zhuǎn)染表達穩(wěn)定的細胞、FRET 存在背景噪聲需要校正的問題等，特別是FRET 要求發(fā)生于特定相對位置且距離在1 ～10 nm的熒光基團間，這一嚴格要求有可能產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象，如2 個生物分子相對位置不合適或作用距離﹥10 nm 等。目前已有許多研究針對以上問題提出各種解決方法，使FRET 的應用得到重大的進展。相信隨著對腫瘤信號通路、信號分子活性的研究進展，F(xiàn)RET 在活細胞水平揭示腫瘤信號通路尤其是下游蛋白水平相互作用關系等方面的地位越來越突出，從而幫助闡明腫瘤發(fā)病機制、耐藥機制，因此在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)及藥物研發(fā)中擁有巨大的潛力。通過EGFR-Ras-ERK、mTOR［10］、Cdk 家族［28］等信號通路的研究，F(xiàn)RET 將用于更多的惡性腫瘤如肺癌、淋巴瘤的藥物研發(fā)。在藥效監(jiān)測方面，F(xiàn)RET 可用非侵入性樣本如血清檢測相關生物標記物活性以便早期發(fā)現(xiàn)耐藥及篩選藥物，因此擁有廣大的臨床應用前景。

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