周 煒，劉 瑋，廖 華，陳曼華

(武漢市中心醫(yī)院1.心內(nèi)科;2.中心實(shí)驗(yàn)室;3.老年科，湖北 武漢430014)

生理濃度的睪酮具有抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作用[1]，但其分子機(jī)制尚不清楚。巨噬細(xì)胞遷入內(nèi)膜下吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞是AS 早期的標(biāo)志性事件。本文旨在觀察睪酮對(duì)泡沫細(xì)胞形成的作用，以及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討睪酮抗AS的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料:小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(中科院上海細(xì)胞生物所);氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(尚善生物);細(xì)胞膽固醇檢測(cè)試劑盒(普利萊公司);蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);睪酮、油紅O(Sigma 公司);抗線粒體融合素2(Mfn2)抗體(Abcam 公司)，抗CD36，ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)及β-actin 抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG(CST)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組:細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組如下:對(duì)照組(control)不加干預(yù)因素;泡沫細(xì)胞組(Foam cells)加入50 μg/mL ox-LDL 孵育48 h;不同濃度睪酮組(Testosterone，T):分別加入5×10－9、5×10－8及5×10－7mol/L 睪酮預(yù)處理24 h，PBS 緩沖液洗脫，后續(xù)步驟同泡沫細(xì)胞組。

1.3 油紅O 染色:按參考文獻(xiàn)[2]的方法操作。

1.4 細(xì)胞膽固醇測(cè)定:按試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度，分別與蛋白濃度做出比值后，比較組間相對(duì)膽固醇濃度。包括總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯(總膽固醇－游離膽固醇)。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá):按參考文獻(xiàn)[2]的方法操作，檢測(cè)目的蛋白/β-actin 吸光度比值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量:巨噬細(xì)胞與ox-LDL 孵育后，胞質(zhì)內(nèi)見大量紅色脂滴，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加(P＜0.05)。預(yù)先行睪酮干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量減少，膽固醇含量降低(P＜0.05)(圖1)。

2.2 目的蛋白的表達(dá):與對(duì)照組比較，ox-LDL 刺激下巨噬細(xì)胞內(nèi)Mfn2表達(dá)降低，CD36和ABCA1表達(dá)增高(P＜0.05);與泡沫細(xì)胞組比較，預(yù)先行睪酮干預(yù)后，Mfn2表達(dá)增加，CD36表達(dá)降低，ABCA1表達(dá)增高(P＜0.05)，呈一定濃度依賴性(圖2)。

圖1 睪酮對(duì)細(xì)胞膽固醇含量的影響Fig1 Effects of testosterone on the cholesterol in cells(±s，n=3)

圖2 睪酮對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig2 Effects of testosterone on the protein expression in cells (±s，n=3)

3 討論

本研究中，ox-LDL 刺激下巨噬細(xì)胞泡沫化，清道夫受體CD36和膽固醇外排蛋白ABCA1表達(dá)均增加。其中，ABCA1表達(dá)增加可能反映細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)負(fù)載的自身調(diào)節(jié)，提示在ox-LDL 誘導(dǎo)下巨噬細(xì)胞攝取及逆向轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)均增加，而脂質(zhì)攝取增多大于外排的作用，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。而預(yù)先給予不同濃度睪酮干預(yù)可呈濃度依賴性減少膽固醇在巨噬細(xì)胞內(nèi)的蓄積，抑制其向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)CD36表達(dá)降低，ABCA1表達(dá)增加。據(jù)此認(rèn)為，睪酮可抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，其作用與下調(diào)CD36 減少膽固醇攝取和上調(diào)ABCA1 增加膽固醇外排有關(guān)。

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，對(duì)線粒體融合、線粒體形態(tài)及功能的調(diào)節(jié)有重要作用，Mfn2 也是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中一個(gè)重要的調(diào)控點(diǎn)[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2是原癌基因ras的直接負(fù)調(diào)控因子，可抑制磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，抑制清道夫受體CD36，促進(jìn)ABCA1表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[3]。這表明Mfn2是調(diào)控泡沫細(xì)胞形成及AS 發(fā)生與發(fā)展的重要基因，但對(duì)于Mfn2的上游調(diào)節(jié)方式尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，睪酮呈濃度依賴性上調(diào)Mfn2表達(dá)。這提示睪酮作為內(nèi)源性生物活性物質(zhì)，可能通過(guò)上調(diào)Mfn2表達(dá)，影響下游膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白CD36和ABCA1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取和外排，從而發(fā)揮其抑制泡沫細(xì)胞形成的作用。

[1]Kelly DM，Jones TH.Testosterone:a vascular hormone in health and disease[J].J Endocrinol.2013，217:47-71.

[2]Liu C，Ge B，He C，et al.Mitofusin 2 decreases intracellular lipids in macrophages by regulating peroxisome proliferator-activated receptor-γ[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，450:500-506.

[3]Chen KH，Dasgupta A，Ding J，et al.Role of mitofusin 2(Mfn2)in controlling cellular proliferation[J].FASEB J.2014，28:382-394.