蔡振政　劉小娟　王娟等

摘要：褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）可攜帶多種病毒，其中褐飛虱呼腸孤病毒（Nilaparvata lugens reovirus， NLRV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）均為dsRNA基因組的呼腸孤病毒。通過(guò)接種、dsRNA小量提取及RT-PCR等方法分析NLRV對(duì)RRSV傳播和增殖的影響，初步探討這兩種呼腸孤病毒之間的關(guān)系。結(jié)果表明，褐飛虱攜帶NLRV比率高低影響褐飛虱接種RRSV效率；攜帶NLRV的褐飛虱種群接種RRSV后兩種病毒的含量差異較大，NLRV的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于RRSV的含量，推測(cè)褐飛虱體內(nèi)的NLRV某種程度上干擾了RRSV的傳播和增殖。

關(guān)鍵詞：dsRNA病毒；褐飛虱呼腸孤病毒；水稻鋸齒葉矮縮病毒

中圖分類號(hào)：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1090-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.015

Abstact：Many viruses have been found in brown planthopper， in which Nilaparvata lugens reovirus（NLRV） and Rice ragged stunt virus（RRSV） are two reoviruses with dsRNA genomes. The relationship between NLRV and RRSV was primarily studied. By biological inoculation tests， small dsRNA rapid extraction method and RT-PCR， the effects of NLRV and RRSV on transmission and proliferation were studied. The presence of NLRV in brown planthopper affected the inoculation efficiency of RRSV. The viruliferous brown planthoppers with NLRV were inoculated with RRSV and then the circulative period passed， the concentrations of two reoviruses in vectors were different. NLRV was more higher than RRSV. It is indicated that NLRV could interfere the transmission and proliferation of RRSV in brown planthopper to some extent.

Key words： dsRNA virus； Nilaparvata lugens reovirus； Rice ragged stunt virus

病毒學(xué)研究往往多集中在單一病毒的諸多特性方面，對(duì)寄主或介體體內(nèi)病毒與病毒之間，病毒與其它生物之間的復(fù)合感染以及復(fù)合感染所引起的生物學(xué)現(xiàn)象關(guān)注較少[1，2]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示病毒的復(fù)合感染是一種極其普遍的現(xiàn)象[3]。病毒的復(fù)合感染可以減輕或加重某種病害的發(fā)生，這主要取決于病毒之間的協(xié)同或拮抗或競(jìng)爭(zhēng)等關(guān)系[4-7]，根據(jù)這種關(guān)系可以解釋病害加重或減輕發(fā)生的原因，從而采取相應(yīng)措施控制病害的發(fā)生[8]。褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）也可以攜帶多種病毒，其中褐飛虱呼腸孤病毒（Nilaparvata lugens reovirus，NLRV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）均為dsRNA基因組的呼腸孤病毒[9]。NLRV是斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）成員，可以經(jīng)卵傳播給后代，同時(shí)還可以通過(guò)水稻傳染給不帶毒的褐飛虱，但病毒在水稻內(nèi)不復(fù)制[10-12]；RRSV是水稻病毒屬（Oryzavirus）的成員，由褐飛虱持久性攜卵而引發(fā)水稻鋸齒葉矮縮病，并隨著褐飛虱的長(zhǎng)距離遷飛而傳播擴(kuò)散[13-18]，兩種病毒之間的關(guān)系未知。與褐飛虱一樣，白背飛虱也是南方稻區(qū)最重要的稻飛虱之一，危害水稻和傳播水稻病毒（南方水稻黑條矮縮病毒，Southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）。但白背飛虱攜帶和傳播SRBSDV的效率極高[19，20]，這可能是SRBSDV易造成爆發(fā)和大面積流行的原因之一；而褐飛虱攜帶和傳播RRSV的效率都較低，因此推測(cè)可能是水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區(qū)流行的原因之一。導(dǎo)致褐飛虱攜帶和傳播RRSV效率都較低的原因及與NLRV等病毒的關(guān)系一直是研究者比較感興趣的問(wèn)題?；诖?，通過(guò)接種、dsRNA小量提取和RT-PCR等方法，初步研究NLRV對(duì)RRSV傳播和增殖的影響，為深入研究這兩種病毒間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：水稻鋸齒葉矮縮病病株于2010年采集于福建省龍巖市發(fā)病田間，鑒定后隔離種植；接種水稻品種為水稻鋸齒葉矮縮病感病品種Ⅱ優(yōu)航2號(hào)。

昆蟲(chóng)介體：褐飛虱群體2010年采集于福建福州市郊區(qū)無(wú)水稻鋸齒葉矮縮病發(fā)生的田塊，并經(jīng)過(guò)鑒定后于實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)箱中飼養(yǎng)。

1.2 生物學(xué)接種

1.2.1 褐飛虱飼毒 采用兩種飼毒RRSV的方法。第一種方法是抓取網(wǎng)箱中飼養(yǎng)的二齡若蟲(chóng)于病株上飼毒，第二種方法是模擬自然條件下，抓取網(wǎng)箱中飼養(yǎng)的雌性褐飛虱成蟲(chóng)在病株上產(chǎn)卵，卵孵化成若蟲(chóng)后直接在病株上飼毒。飼毒后的介體度過(guò)循回期（29 ℃下循回期平均為7.6 d[21，22]）備用。

1.2.2 單管單苗接種 選擇飼毒后度過(guò)循回期的褐飛虱成蟲(chóng)（每種方法40頭，重復(fù)3次）進(jìn)行單蟲(chóng)單管單苗生物學(xué)接種，接種水稻苗處于2葉1心期（下同），傳毒8 d，然后將傳毒成蟲(chóng)低溫保存，接種苗每24 h換一次，接種苗按編號(hào)種植于防蟲(chóng)溫室內(nèi)。

1.3 快速小量提取dsRNA

介體昆蟲(chóng)體內(nèi)的dsRNA參照食用菌病毒dsRNA的提取[23]。方法如下：選用褐飛虱100～200頭，用液氮研磨成粉末；加入0.7 mL 2×STE和0.7 mL酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提處理，離心后取上清液，將上清液配制成含17%乙醇的溶液；注入含17%乙醇的1×STE溶液平衡過(guò)的纖維素（CF-11）中，充分混勻，離心后去上清，再用含17%乙醇的1×STE溶液反復(fù)洗滌3～4次；最后用不含乙醇的1×STE洗脫，洗脫液經(jīng)過(guò)異丙醇沉淀和75%乙醇漂洗，沉淀即為dsRNA，干燥后溶于RNase-free的水中。dsRNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)褐飛虱介體帶毒率

取傳毒后低溫保存的成蟲(chóng)各24頭，用RT-PCR法檢測(cè)褐飛虱攜帶兩種病毒的情況，RRSV和NLRV兩種病毒的dsRNA作為陽(yáng)性對(duì)照。RRSV的檢測(cè)引物為P9F/P9R（P9F：5′-ATGAAGACTGCCTTTGCCA

GA-3′，P9R：5′-CTACCCCGAGG CCTTCTGAGA-3′），根據(jù)泰國(guó)分離物S9片段（NC_003757）設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段大小為1 017 bp；NLRV的檢測(cè)引物為N8F/R（N8F：5′-AATCACTCATTGAACAAGGA TGGACG-3′，N8R：5′-CTACCAACCCAGTCGGTCCTTCAAATA-3′），根據(jù)已發(fā)表的NLRV S8的序列，擴(kuò)增片段大小為560 bp[24]。單頭褐飛虱總RNA采用Trizol試劑盒（北京天根）提取，參照說(shuō)明進(jìn)行，最后用20 μL的無(wú)核酸酶滅菌水溶解。反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）說(shuō)明進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)體系按照TaKaRa的rTaq酶使用說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性4 min，35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s），最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)接種結(jié)果

兩種飼毒方法獲得的褐飛虱成蟲(chóng)單管單苗生物學(xué)接種結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中得出，能夠傳毒的褐飛虱成蟲(chóng)分別占試驗(yàn)成蟲(chóng)總數(shù)的22.50%、50.00%；生物學(xué)接種320株水稻分別有24株、44株發(fā)病，發(fā)病率為7.50%、13.75%。

2.2 褐飛虱體內(nèi)dsRNA的提取和檢測(cè)結(jié)果

收集接種RRSV和未接種RRSV的褐飛虱種群，提取并檢測(cè)褐飛虱種群體內(nèi)的dsRNA情況，以協(xié)助了解介體體內(nèi)的帶毒情況以及dsRNA病毒種類。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，從褐飛虱體內(nèi)提取dsRNA以0.2～0.3 g為宜（100～200頭）。圖1是褐飛虱（100-200頭）體內(nèi)的dsRNA，從其dsRNA基因圖譜中可清晰地看到褐飛虱體內(nèi)存在NLRV，飼毒RRSV后體內(nèi)的病毒除了NLRV外，還有RRSV，但兩種病毒的含量差別較大，NLRV含量遠(yuǎn)大于RRSV。

2.3 褐飛虱介體帶毒率

由圖2可知，在方法1和方法2中，24頭成蟲(chóng)中攜帶RRSV分別有13頭和18頭，帶毒率分別為54.17%、75.00%，帶毒率差異較大；而攜帶NLVR分別為23頭、24頭，帶毒率分別為95.83%、100.00%，帶毒率差異較小。

3 小結(jié)與討論

生物學(xué)接種試驗(yàn)和褐飛虱帶毒率檢測(cè)結(jié)果表明，在方法1中，使用二齡若蟲(chóng)飼毒RRSV，度過(guò)循回期后成蟲(chóng)帶毒率為54.17%，帶毒且能夠傳毒的成蟲(chóng)為42.85%，這些數(shù)據(jù)與以往報(bào)道的數(shù)據(jù)相符合[13，21，25，26]；在方法2中，模擬自然條件下在病株上產(chǎn)卵、飼毒和度過(guò)循回期后，帶毒率較高，成蟲(chóng)帶毒率約為75%，帶毒且能夠傳毒的成蟲(chóng)約為50%，這些數(shù)據(jù)皆比以往報(bào)道的數(shù)據(jù)高一些[13，21，25，26]。兩種方法不同點(diǎn)之處在于飼毒RRSV時(shí)褐飛虱攜帶NLRV的差異。NLRV可以經(jīng)卵傳播，經(jīng)卵傳播比率為15%[10，12]，在方法1中，卵孵化成若蟲(chóng)后攜帶NLRV的比率低于15%，多數(shù)介體首先接種的是RRSV；而室內(nèi)飼養(yǎng)的褐飛虱種群帶毒率一般都在90%以上[10，24]。在方法2中，二齡褐飛虱若蟲(chóng)在飼毒RRSV之前多數(shù)都攜帶了NLRV。因此，根據(jù)生物學(xué)接種和褐飛虱帶毒率檢測(cè)結(jié)果初步推測(cè)NLRV能在一定程度上影響褐飛虱生物學(xué)接種RRSV以及褐飛虱的傳毒效率。此外，NLRV和RRSV都是褐飛虱體內(nèi)增殖性病毒[12，15]，但兩者同時(shí)存在時(shí)，NLRV的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于RRSV（如圖2），這也說(shuō)明NLRV可能某種程度上干擾了RRSV在體內(nèi)的增殖。褐飛虱是一種典型的遷飛性害蟲(chóng)，每年春季或夏季由南向北遷移、秋季由北向南回遷，在中國(guó)境內(nèi)分布范圍幾乎覆蓋全境，褐飛虱一旦帶毒，則可以將水稻鋸齒葉矮縮病毒傳進(jìn)遷入地區(qū)[13，14，16-18]。水稻鋸齒葉矮縮病首先發(fā)現(xiàn)于菲律賓和印度尼西亞，并于20世紀(jì)70年代末在日本、印度及東南亞一些國(guó)家局部地區(qū)引起水稻大面積減產(chǎn)[13-15]；在中國(guó)該病自1978年以來(lái)，先后在臺(tái)灣、福建、廣東和江西等省發(fā)生流行，對(duì)水稻生產(chǎn)造成了一定的影響[15，21，25]。但相對(duì)于白背飛虱傳播的水稻南方黑條矮縮病毒病等大面積流行病害來(lái)說(shuō)，水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區(qū)流行，危害程度遠(yuǎn)不及水稻南方黑條矮縮病毒病[20，27]，具體原因鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)NLRV可能某種程度上干擾了RRSV在褐飛虱體內(nèi)的增殖以及傳播，從病毒與病毒之間的拮抗方面初步分析了NLRV的存在可以減輕水稻鋸齒葉矮縮病的發(fā)生和流行，從某種程度上解釋了水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區(qū)流行的現(xiàn)象。

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