蟾毒靈對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的影響

趙汝楠，于 卉，石曉靜，邱艷艷，錢雅新，殷佩浩

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科，上海 200062

蟾毒靈對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的影響

趙汝楠，于 卉，石曉靜，邱艷艷，錢雅新，殷佩浩

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院普外科，上海 200062

目的 觀察蟾毒靈（Bufalin）對(duì)大腸癌HCT-116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的影響及其可能的機(jī)制。方法使用TGF-β1誘導(dǎo)大腸癌HCT-116細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），制備EMT模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、蟾毒靈組。72 h后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)觀察蟾毒靈對(duì)HCT-116細(xì)胞形態(tài)學(xué)、侵襲與遷移能力的影響，Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin及β-catenin表達(dá)，免疫熒光法觀察β-catenin蛋白分布。結(jié)果 模型組較空白組細(xì)胞明顯伸長(zhǎng)變窄且細(xì)胞間連接相對(duì)疏松。與模型組相比，蟾毒靈組部分細(xì)胞呈不典型鵝卵石樣上皮細(xì)胞改變，部分細(xì)胞拉長(zhǎng)變窄，細(xì)胞間連接較緊密；72 h穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少（110.00±26.46vs.413.33±41.63，P＜0.05），72 h遷移細(xì)胞數(shù)亦較模型組明顯減少（507±38.16 vs.898±49.49，P＜0.05），兩者與空白對(duì)照組均無(wú)差異。Western blot檢測(cè)顯示：模型組較空白對(duì)照組上皮標(biāo)志物E-cadhrin下降，間質(zhì)標(biāo)志物Vmentin上升；蟾毒靈組則較模型組E-cadhrin上調(diào)，Vimentin下調(diào)，β-catenin表達(dá)無(wú)差異。免疫熒光觀察示，模型組β-catenin較空白對(duì)照組從細(xì)胞膜、胞質(zhì)移至胞核內(nèi)，蟾毒靈組β-catenin則較模型組集中于細(xì)胞質(zhì)，胞核表達(dá)較少。結(jié)論 TGF-β1可誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞EMT；蟾毒靈可能通過(guò)抑制β-catenin核移位、阻止HCT-116細(xì)胞EMT發(fā)揮抑制HCT-116細(xì)胞侵襲、遷移的作用。

大腸癌；蟾毒靈；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；侵襲；遷移

大腸癌是一種發(fā)病率居高不下的常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。蟾毒靈（Bufalin）是一種有效的天然、中藥抗腫瘤藥物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抗耐藥等多種功效。研究表明，蟾毒靈在抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移方面具有較好療效[2]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是其抗侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。EMT是指上皮細(xì)胞失去上皮特征，轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)梭形的間質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)象；發(fā)生EMT的細(xì)胞由于其細(xì)胞間連接變得疏松，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，因而具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大腸癌HCT-116細(xì)胞EMT，初步探討蟾毒靈對(duì)HCT-116細(xì)胞EMT的作用及其與侵襲性的關(guān)系和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞中心；接種于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 U/ml青、鏈霉素的RP-1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與抗體

蟾毒靈購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；TGF-β1 購(gòu) 自 Peprotech 公 司 ，產(chǎn) 品 編 號(hào) 100-21。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京?？寺」?；FBS購(gòu)自BI公司；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD Biosciences公司；結(jié)晶紫購(gòu)自Biosharp公司；WB用GAPDH購(gòu)自康為公司；E-cadherin、Vimentin、β-catenin抗體購(gòu)自 abcam 公司；山羊抗小鼠二抗，山羊抗兔二抗，山羊抗兔熒光二抗：康為世紀(jì)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與分組

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞按2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔2 ml；置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。次日，更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（1640培養(yǎng)基2 ml，即HCT-116＋PBS）、模型組（含TGF-β1 10 ng/ml的1640培養(yǎng)基2 ml，即 HCT-116＋TGF-β1 10 ng/ml）、蟾毒靈組（含TGF-β1 10 ng/ml+蟾毒靈1 nmol/L的1640培養(yǎng)基 2 ml，即 HCT-116＋TGF-β1 10 ng/ml+蟾毒靈1 nmol/L）。37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)72 h。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

各組在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下觀察，拍照。

1.5 侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用移液槍，槍頭，Transwell小室（小室孔徑8 μm），將Matrigel膠從4℃冰箱取出后，移入超凈工作臺(tái)的冰盒上備用。在24孔板的小室上鋪膠，每孔50 μl。37℃溫箱過(guò)夜。分別預(yù)處理各組細(xì)胞，37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h后，收集離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次?？瞻捉M、模型組上室的相應(yīng)細(xì)胞僅用單RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，每孔200 μl接種，實(shí)驗(yàn)組上室細(xì)胞用含1 nmol/L的蟾毒靈（1 nmol/L）單RPMI-1640培養(yǎng)基接種?？瞻捉M小室下室加入含10%FBS的 RPMI-1640 500 μl，模型組、實(shí)驗(yàn)組則均加入含10%FBS及TGF-β1 10 ng/ml（作為誘導(dǎo)劑）的RPMI-1640 500 μl作為誘導(dǎo)劑。細(xì)胞在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h后，取出小室，洗滌后甲醇固定20 min，風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，顯微鏡下觀察穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)，拍照，計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)除不在小室鋪膠外，其余步驟同上述侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞分別培養(yǎng)72 h后，使用碧云天蛋白裂解液（強(qiáng)）提總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取40 μg/孔蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入適量抗 體 E-cadherin（1∶10 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-catenin（1∶10 000）、GAPDH（內(nèi)參，1∶10 000），4℃孵育過(guò)夜；土溫與三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBST）洗滌3次，分別加入相應(yīng)二抗，山羊抗兔（1∶2 000）、山羊抗小鼠（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光顯影，圖像分析。

1.7 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

用各組對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，將細(xì)胞鋪至無(wú)菌玻片上，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，取出玻片，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，風(fēng)干，5%BSA封閉1 h，β-catenin 1∶250稀釋4℃孵育過(guò)夜，次日取出，PBS洗滌3次，加山羊抗兔熒光二抗（1∶400）孵育1 h后，PBS洗滌3次，4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染2 min，PBS洗滌3次，甘油封片，倒置顯微鏡拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSDt法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變

空白組HCT-116細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞多數(shù)呈鵝卵石樣貼壁聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞間連接緊密，少量漂浮生長(zhǎng)。模型組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1 72 h誘導(dǎo)，細(xì)胞明顯拉長(zhǎng)變窄，細(xì)胞間連接疏松，提示EMT模型制備成功。蟾毒靈組與模型組相比，細(xì)胞拉伸明顯減弱，細(xì)胞間連接相對(duì)緊密，表明蟾毒靈在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞EMT（圖1）。

2.2 侵襲、遷移能力

如圖2，蟾毒靈組能穿透基質(zhì)膠至小室膜下表面即穿膜細(xì)胞數(shù)明顯較模型組減少（110.00±26.46vs.413.33±41.63，P＜0.05），而空白組（86.67±11.72）與蟾毒靈組無(wú)差異。如圖3，蟾毒靈組穿透小室膜即遷移細(xì)胞數(shù)亦較模型組明顯減少（507±38.16vs.898±49.49，P＜0.05），空白組（475±69.41）與藥物組無(wú)差異。

圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)（×100）Fig.1 Cell morphology in each group（×100）

圖2 各組細(xì)胞侵襲能力（×200）Fig.2 The invasion ability of cells in each group（×200）

圖3 各組細(xì)胞的遷移能力（×200）Fig.3 The migration ability of cells in each group（×200）

2.3 EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖4所示，上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)在模型組降低，蟾毒靈組上調(diào)；間質(zhì)標(biāo)志Vimentin表達(dá)在模型組上調(diào)，蟾毒靈組下調(diào)；β-catenin蛋白無(wú)變化。提示蟾毒靈上調(diào)E-cadherin、下調(diào)Vimentin表達(dá)，對(duì)β-catenin無(wú)影響，表明蟾毒靈的作用可能與EMT有關(guān)。

圖4 各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of EMT-related markers in each group

2.4 免疫熒光檢測(cè)

空白組β-catenin主要集中于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；TGF-β1（模型）組β-catenin除胞膜與胞質(zhì)有較強(qiáng)表達(dá)外，胞核內(nèi)也有部分表達(dá)；蟾毒靈組較模型組β-catenin核內(nèi)表達(dá)減少，胞質(zhì)、胞膜表達(dá)較強(qiáng)（圖5）。提示，與空白組相比，模型組β-catenin發(fā)生了核易位；而蟾毒靈在一定程度上抑制了模型組的核易位。

3 討論

蟾毒靈是傳統(tǒng)中藥蟾酥的有效成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)證明具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[3]、誘導(dǎo)凋亡[4]、抑制血管新生[5]和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[6]、抗多藥耐藥[7]等功效。EMT是指細(xì)胞失去上皮特性向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。發(fā)生EMT的細(xì)胞逐漸失去其上皮細(xì)胞的形態(tài)與功能，細(xì)胞伸長(zhǎng)變窄，細(xì)胞間連接變疏松，上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志Vimentin表達(dá)升高；使得上皮細(xì)胞間粘附性與極性顯著降低，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，最終使腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤組織并向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移[8-9]。已有研究表明，蟾毒靈能抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，但在EMT中的作用知之甚少。

圖5 各組細(xì)胞β-catenin表達(dá)（×500）Fig.5 The expression of β-catenin in each group（×500）

TGF-β1是TGF-β家族的重要因子之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中被證實(shí)為EMT的主要誘導(dǎo)劑[10-13]，另外還是實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的重要因子之一[14]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TGF-β1作為EMT誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞EMT以制備EMT模型。由于蟾毒靈具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，故選取其無(wú)細(xì)胞毒性濃度[15]以排除細(xì)胞死亡造成的實(shí)驗(yàn)誤差，即在EMT模型組基礎(chǔ)上添加1 nmol/L的蟾毒靈單體進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。作用72 h后經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，蟾毒靈組細(xì)胞具有不典型的上皮細(xì)胞特征，提示蟾毒靈在一定程度上抑制HCT-116細(xì)胞EMT；且侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)和Western blot檢測(cè)提示，蟾毒靈組較模型組細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯下降，蟾毒靈能逆轉(zhuǎn)EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明，蟾毒靈通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞EMT抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

為進(jìn)一步證明上述現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了β-catenin蛋白表達(dá)及其分布情況。Western blot雖提示β-catenin總蛋白基本一致，免疫熒光檢測(cè)則表明，模型組細(xì)胞中β-catenin核移位現(xiàn)象顯著；而蟾毒靈在一定程度上抑制β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)移位，從而抑制其對(duì)相應(yīng)靶基因的激活、最終抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。β-catenin屬連環(huán)蛋白的一種，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的重要因子之一；不但是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路的關(guān)鍵分子[16]；還能與細(xì)胞膜上E-cadherin結(jié)合成復(fù)合體，參與細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞上皮極性[17]的調(diào)節(jié)。研究表明，E-cadherin對(duì)β-catenin的調(diào)節(jié)非常重要，該復(fù)合體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)β-catenin含量，一旦其含量變化可能會(huì)導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路激活，最終影響腫瘤發(fā)展及預(yù)后[18]。另外，Wnt/β-catenin通路主要通過(guò)Wnt配體與相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)蛋白Dishevelled、抑制絲/蘇氨酸激酶GSK3β活性，使其不能磷酸化β-catenin，去磷酸化的β-catenin在胞漿內(nèi)累積、進(jìn)入胞核與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LEF/TCF共同作用，從而激活靶基因轉(zhuǎn)錄。諸多研究已證實(shí)Wnt/β-catenin通路在結(jié)腸癌中的作用。Qi等[19]報(bào)道，Wnt/β-catenin通路的激活能促進(jìn)腫瘤血管生成擬態(tài)形成。Gao等[20]則認(rèn)為，β-catenin表達(dá)水平及分布與結(jié)腸癌的預(yù)后、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，并指出β-catenin核移位是結(jié)腸癌的臨床病理分期及預(yù)后的重要評(píng)估指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，蟾毒靈通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大腸癌HCT-116細(xì)胞EMT最終抑制其侵襲、轉(zhuǎn)移，可能與抑制β-catenin核移位有關(guān)。但蟾毒靈對(duì)EMT的詳細(xì)作用機(jī)制和信號(hào)通路相關(guān)性，還需作進(jìn)一步的探討。

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The influence of Bufalin on TGF-β1-induced epithelial mesenchymal transition in HCT-116 cells

ZHAO Runan，YU Hui，SHI Xiaojing，QIU Yanyan，QIAN Yaxin，YIN Peihao
Department of General Surgery，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China

ObjectiveTo explore the influence of Bufalin on epithelial mesenchymal transition（EMT）in colorectal cancer HCT-116 cells and its possible mechanism.MethodsEMT models of colorectal cancer HCT-116 cells were prepared by TGF-β1.Blank control group，model group and bufalin group were divided，and interventions were conducted.After 72 h of intervention，the morphological changes，invasion and migration capabilities，expression of EMT-related proteins including E-cadherin，Vimentin and β-catenin，and β-catenin protein distribution of HCT-116 cells in each group were determined by using light microscope，Transwell-invasion and migration tests，Western blotting and immunofluorescence method，respectively.ResultsCells in model group became elongated and spindle，with relatively lax connections between cells when compared with blank control group，and some cells in Bufalin group were elongated and narrow，with close cell connections when compared with model group.The number of cell permeation in Bufalin group（110.00±26.46）was significantly smaller than that in model group（413.33±41.63）（P＜0.05），and the number of cell migration in Bufalin group was significantly decreased when compared with model group（507±38.16vs.898±49.49，P＜0.05），whereas there was no significant difference in the numbers of cell permeation and migration between blank control group and Bufalin group.Compared with model group，the expression of E-cadherin was increased，and the expression of Vimentin was decreased in Bufalin group.Compared with blank control group，the expression of E-cadherin was decreased，and the expression of Vimentin was increased in model group.However，there was no significant difference in β-catenin expression among groups.The β-catenin expression moved from cell membrane and cytoplasm to nucleus in model group when compared with blank control group，and there was more β-catenin expression in cytoplasm than nucleus in Bufalin group when compared with model group.Conclusions TGF-β1 induces EMT of colorectal cancer HCT-116 cells.Bufalin inhibits invasion and migration of HCT-116 cells by inhibiting EMT and β-catenin nuclear translocation.

Colorectal cancer；Bufalin；Epithelial mesenchymal transition；Transforming growth factor-β1；Invasion；Migration

R656.9

A

2095-378X（2015）04-0217-06

10.3969/j.issn.2095-378X.2015.04.001

上海中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者”（B-X-72）和中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科創(chuàng)新基金項(xiàng)目（B-X-73）；上海市普陀區(qū)衛(wèi)計(jì)委“315”工程人才培養(yǎng)計(jì)劃學(xué)科帶頭人后備人才（14Q-RC-08）

趙汝楠（1989—），女，碩士，研究腫瘤分子病理

殷佩浩，yinpeihao1975@hotmail.com