韓懿 勞美瓊 雷巧如 李艷娜

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）是一類不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA分子。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)LncRNA與X染色體沉默、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活與抑制、RNA剪切等有關(guān)，在胚胎與組織發(fā)育、細(xì)胞分化、神經(jīng)代謝性疾病、腫瘤等中發(fā)揮重要功能［1-3］。越來(lái)越多的證據(jù)顯示LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是腫瘤診斷和治療新的研究前沿［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CRNDE（colon rectal neoplasia differentially expressed）在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)明顯升高，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其生理功能和作用機(jī)制尚不明確［6-7］。關(guān)于LncRNA CRNDE在宮頸癌中的功能研究，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本研究通過(guò)比較LncRNA CRNDE在宮頸癌組織及癌旁組織中表達(dá)，分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系，為L(zhǎng)ncRNA CRNDE用于宮頸癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)，為尋找新的宮頸癌腫瘤標(biāo)志物提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2009年10月至2014年10月87例廣東省開平市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的宮頸癌患者的癌組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌，標(biāo)本獲取前全部病例均未行化療和放療，臨床資料完整。87例宮頸癌患者的年齡為24～60歲，中位年齡為40歲；年齡＜40歲患者為44例，年齡≥40歲為43例；Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期20例；鱗癌68例，腺癌19例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。65例患者接受了手術(shù)，60例患者接受了放化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 隨訪 全部患者出院后均進(jìn)行隨訪，方式為電話和門診隨訪，內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀和影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2015年3月31日，截止隨訪終止患者生存41例、死亡46例，無(wú)失訪病例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 Trizol試劑盒、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、LncRNA CRNDE引物均購(gòu)自中國(guó)上海Invitrigeng公司。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）方法 收集宮頸癌組織及癌旁組織（50～100 mg）標(biāo)本，放入液氮冷凍后，鋁箔包裹，在研缽中充分研磨，用Trizol試劑反復(fù)洗滌研磨后的碎末，經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理后凍存管收集，放入液氮中，提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨（樣品總體積不超過(guò)所用Trizol體積10%），移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。取上述準(zhǔn)備的RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA合成。采用LncRNA CRNDE基因特異性引物CRNDE-FW2及CRNDE-RV2進(jìn)行RT-PCR，以GAPDH作為內(nèi)參照。LncRNA CRNDE上游引物為5'-GCGGAG GTTAAGTGT-3'，下游引物為5'-AACAGGTTTACCTCCT TATCTTCAGAA-3'；內(nèi)參照GAPDH上游引物為5'-GGA AGGACTCATGACCACAGTCC-3'，下游引物為5'-TCGC TGTI'GAAGTCAGAGGAGACC-3'。比較宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE基因表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。LncRNA CRNDE相對(duì)表達(dá)量（RQ）=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對(duì)照=（Ct樣品LncRNA CRNDECt樣品GAPDH）-（Ct對(duì)照LncRNA CRNDE-Ct對(duì)照GAPDH）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)；LncRNA CRNDE表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。LncRNA CRNDE表達(dá)與患者生存期關(guān)系采用Kaplan-Meier法，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型用于宮頸癌預(yù)后的多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA CRNDE在宮頸癌組織中表達(dá)及其與患者的預(yù)后關(guān)系

RT-PCR檢測(cè)LncRNA CRNED在87例宮頸癌組織和癌旁組織中表達(dá)，結(jié)果提示LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達(dá)為3.974±0.981，明顯高于癌旁組織1.237±0.325，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

LncRNA CRNED表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)深度等臨床病理特征的關(guān)系見表1。LncRNA CRNED表達(dá)與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與患者的年齡、腫瘤大小、組織來(lái)源和分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）。2-ΔΔCt≤1定義為低表達(dá)，2-ΔΔCt＞1為高表達(dá)［8］。

圖1 LncRNA CRNDE在宮頸癌及癌旁組織中表達(dá)Figure1 Expression of LncRNA CRNDE in cervical cancer and paraneo?plastic tissue

表1 LncRNA CRNDE表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

表1 LncRNA CRNDE表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 （續(xù)表1）Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

2.2 LncRNA CRNDE表達(dá)對(duì)患者生存期的影響

采用Kaplan-Meier法分析LncRNA CRNDE表達(dá)與患者生存期關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE高表達(dá)患者的生存時(shí)間較低表達(dá)者明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.185，P＜0.001，圖2）。

圖2 LncRNA CRNDE表達(dá)水平與患者生存期關(guān)系Figure 2 Correlation between Kaplan-Meier survival curves and Ln?cRNA CRNDE level

Cox回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)FIGO臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵潤(rùn)深度及LncRNA CRNDE表達(dá)可作為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子（表2）。

表2 Cox多因素分析患者的臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系Table 2 Cox multivariate analysis for correlation between clinicopatho?logical features and prognosis in patients

3 討論

宮頸癌是全世界婦女中發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，也是最常見的生殖道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。近40年來(lái)其發(fā)病率卻及死亡率已有明顯下降，但年輕女性宮頸癌的發(fā)病率卻有明顯上升趨勢(shì)，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。雖然多數(shù)的早期宮頸癌可經(jīng)手術(shù)或放療等手段而治愈，但其中20%～25%病例卻因復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，因此宮頸癌的預(yù)后也是不容忽視的問(wèn)題［9-10］。LncRNA是一類不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子，可在多層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）調(diào)控基因的表達(dá)，其功能目前尚不完全清楚［11］。近年來(lái)的研究表明，LncRNA以RNA形式在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，廣泛參與調(diào)控個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育以及細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生命活動(dòng)，并且還參與了人類癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等病理進(jìn)程，LncRNA的研究已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的重要熱點(diǎn)［5，12-13］。2011年發(fā)現(xiàn)的LncRNA CRNDE是結(jié)直腸腫瘤差別表達(dá)基因，在結(jié)直腸癌以及多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)［14］，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只有較低的編碼蛋白能力，因此將其歸為長(zhǎng)鏈非編碼RNA。LncRNA CRNDE定位于16號(hào)染色體IRX5基因的反義鏈上，與其共用一個(gè)雙向啟動(dòng)子。LncRNA CRNDE基因全長(zhǎng)約10 kb，包含5個(gè)核心外顯子和1個(gè)出現(xiàn)頻率較低的附加外顯子［15］。該基因存在著多種可變剪接，至少存在十幾種轉(zhuǎn)錄本，其中一些轉(zhuǎn)錄本中存在不同的內(nèi)含子序列。目前研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CRNDE在許多癌組織或細(xì)胞（實(shí)體腫瘤及白血?。┲斜磉_(dá)明顯升高，其中在膠質(zhì)瘤中LncRNA CRNDE上調(diào)14～32倍［16］。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，與LncRNA CRNED在結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)的結(jié)果一致［6，14］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，LncRNACRNED表達(dá)與患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤侵潤(rùn)深度相關(guān)，LncRNA CRNDE高表達(dá)患者的生存期較低表達(dá)者明顯縮短，Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE表達(dá)可作為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子。

總之，本研究將為L(zhǎng)ncRNA CRNDE應(yīng)用于宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)，為尋找宮頸癌腫瘤新的標(biāo)志物提供思路。

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