賀希文，高彩霞，姜騫，權(quán)金強(qiáng)，蔡原*，曲連東*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

研究報(bào)告

加系SPF大白豬和長(zhǎng)白豬群體遺傳學(xué)分析

賀希文1，2，高彩霞2，姜騫2，權(quán)金強(qiáng)1，蔡原1*，曲連東2*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001)

目的研究中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從加拿大引進(jìn)的SPF大白豬和長(zhǎng)白豬的遺傳學(xué)背景。方法實(shí)驗(yàn)采用19對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)該群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析。結(jié)果19個(gè)位點(diǎn)在大白豬群中檢測(cè)到84個(gè)等位基因，長(zhǎng)白豬群中檢測(cè)到89個(gè)等位基因。大白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5271和0.5877；長(zhǎng)白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5652和0.6066。由于S0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位點(diǎn)內(nèi)等位基因大小和含量差異顯著（P＜0.01)可作為大白豬和長(zhǎng)白豬品種鑒定的候選位點(diǎn)。F-統(tǒng)計(jì)和遷移率分析結(jié)果表明，群體內(nèi)的分化較小，遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)論引進(jìn)加系SPF純種大白豬和長(zhǎng)白豬的遺傳結(jié)構(gòu)與國(guó)內(nèi)部分純種大白豬和長(zhǎng)白豬相比更為穩(wěn)定，可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究。

SPF豬；微衛(wèi)星標(biāo)記；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；遺傳多樣性

當(dāng)今世界大白豬和長(zhǎng)白豬是最重要的商業(yè)品系肉用豬，尤其以生長(zhǎng)速度快、繁殖力高、適應(yīng)性強(qiáng)和瘦肉率高的特點(diǎn)而被人們所熟知，它是世界上最著名，分布最廣的主導(dǎo)瘦肉型豬，全世界范圍內(nèi)均有飼養(yǎng)[1-3］。據(jù)調(diào)查，國(guó)內(nèi)外很多特有小型豬，如廣西巴馬小型豬、西藏小型豬、甘肅蕨麻豬、Yucatan小型豬等，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究、器官移植等諸多方面[4-7］；而長(zhǎng)白豬，杜洛克和大白豬等為重要的肉用型品種多用于經(jīng)濟(jì)性狀的選育和保種[8］，用于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究更是鮮有報(bào)道。而中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從加拿大引進(jìn)100頭無(wú)豬瘟、豬呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎、豬流感等病原體的SPF豬主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中大白豬和長(zhǎng)白豬各50頭包含32窩大白豬和28窩長(zhǎng)白豬。隨豬附贈(zèng)系譜材料顯示該種群可追溯至其10代以內(nèi)的血緣關(guān)系，引進(jìn)之后繼續(xù)對(duì)它們進(jìn)行封閉環(huán)境飼養(yǎng)，已繁育一代。運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)種群的遺傳多樣性明確其遺傳背景為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化提供理論依據(jù)。現(xiàn)擬向哈爾濱市及周邊多個(gè)豬場(chǎng)、科研機(jī)構(gòu)和生物制藥物企業(yè)提供標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物素材為豬病的研究和疫苗的制備提供良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料。

微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs)，由2-6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體和品種間呈高度變異而產(chǎn)生數(shù)量豐富的等位基因（或基因型)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物優(yōu)良性狀的選育和標(biāo)記，如稻米的淀粉品質(zhì)、豬的主要經(jīng)濟(jì)性狀的選育與標(biāo)記[9-11］。在家畜育種和親子鑒定（包括個(gè)體來(lái)源、品種來(lái)源、個(gè)體或品種間的親緣關(guān)系鑒定)[12-14］中有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

98份豬耳組織樣本，引自加拿大，均來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所牧場(chǎng)。其中大白豬和長(zhǎng)白豬各49頭，所采耳組織樣品均置于無(wú)菌的1.5 mL EP管中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2×Taq PCR Starmix聚合酶購(gòu)自GenStar，小劑量基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司。引物根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO)和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG)聯(lián)合推薦的30對(duì)微衛(wèi)星引物中，依據(jù)等位基因數(shù)的豐富程度、分布在不同染色體的原則，選取了其中的19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，實(shí)際實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增過(guò)程中部分位點(diǎn)的退火溫度和擴(kuò)增后分析范圍進(jìn)行微調(diào)（見表1)，由北京金唯智公司合成，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 基因組DNA的提取

按照Axygen小劑量基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取豬耳組織基因組DNA。將DNA溶于去離子水，用NanoDrop-100紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，然后用去離子水稀釋至 20 ng/μL，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增與檢驗(yàn)

根據(jù)擴(kuò)增片段的理論值大小，每組位點(diǎn)中的片段大小相差至少10～25 bp，并且標(biāo)記的熒光顏色不發(fā)生重疊，將19對(duì)微衛(wèi)星引物分為6組。PCR反應(yīng)體系為20μL:上、下游引物各1μL（10 mmol/L)，2 ×Taq PCR Starmix聚合酶10μL，模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃～65℃退火（分組及不同引物的Tm值見表1)30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物按組混合加樣進(jìn)行凝膠毛細(xì)管電泳檢驗(yàn)，并用GeneMapper V4.0軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)提取、分子量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定和PCR產(chǎn)物片段大小的計(jì)算，最后根據(jù)核心堿基數(shù)完成基因型的判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel Microsatellite Toolkit V3.1軟件，計(jì)算大白豬和長(zhǎng)白豬在19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量。利用Genepop V1.2軟件進(jìn)行群體間的遺傳分化和基因型差異的分析[15］。利用FSTAT V2.9.3進(jìn)行F-檢驗(yàn)[16］。利用Structure V2.3軟件分析大白豬和長(zhǎng)白豬的遺傳分化結(jié)構(gòu)圖，所設(shè)參數(shù)“Burnin Period”和“After Burnin”均為50 000次，K值為2-5，然后利用distructure軟件顯示圖形。

表1 19對(duì)微衛(wèi)星引物詳細(xì)信息Tab.1 Detailed information of the 19 microsatellite loci primers

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖1)。大白豬和長(zhǎng)白豬在19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別檢測(cè)到84和89個(gè)等位基因，兩群體共享57個(gè)等位基因，平均含有4.42和4.63個(gè)等位基因（表2)。19個(gè)位點(diǎn)中S0005位點(diǎn)等位基因最多有14個(gè)，Sw2406和S0218位點(diǎn)等位基因最少各3個(gè)（表3)。

2.2 等位基因和雜合度分析

19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均雜合度相對(duì)較高，其中長(zhǎng)白豬略高于大白豬分別為0.6066和0.5877，均在0.5～0.7之間（表2)。大白豬群中S0005位點(diǎn)的雜合度最高為0.8395檢測(cè)到雜合體43個(gè)，S0178位點(diǎn)的雜合度最低為 0.1515僅檢測(cè)到 8個(gè)。Sw2406位點(diǎn)共檢測(cè)到221、233、251 bp 3個(gè)等位基因，而251 bp等位基因僅存在于大白豬群中，在長(zhǎng)白豬群中并沒(méi)有檢測(cè)到該等位基因，表明251 bp等位基因?yàn)榇蟀棕i特有的等位基因；長(zhǎng)白豬S0178位點(diǎn)的雜合度最高為0.7570，S0218位點(diǎn)的雜合度最低為0.0204，在S0218位點(diǎn)僅檢測(cè)到167 bp和169 bp兩個(gè)等位基因而169 bp等位基因在長(zhǎng)白豬群中只檢測(cè)到一個(gè)。此外，Sw857 144 bp、Sw936 117 bp、S0143 168 bp、S0155 152 bp和S0178 109 bp這5個(gè)位點(diǎn)在兩群體間的分布和含量差異極顯著。結(jié)果表明相同位點(diǎn)的等位基因個(gè)數(shù)和雜合度在不同群體差異極顯著。

表2 大白豬和長(zhǎng)白豬兩個(gè)群體在19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的雜合度和多態(tài)信息含量Tab.2 Value of heterozygosities and polymorphism information content（PIC)in the pedigree Yorkshire and Landrace populations at19 microsatellite loci

圖1 S0143位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of the products of S0143 in agarose

2.3 多態(tài)信息含量

兩個(gè)群體中S0005位點(diǎn)的多態(tài)信息含量最高為0.8102，S0178位點(diǎn)多態(tài)信息含量最低0.1387，大白豬和長(zhǎng)白豬的平均多態(tài)信息含量分別為0.5271和0.5652。S0005、S0218、S0068、Sw2410、S0097、Sw122、Sw2406、S0355位點(diǎn)的多態(tài)信息含量在大白豬群普遍高于長(zhǎng)白豬群，而其他11個(gè)位點(diǎn)則反之（表2)。19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中S0005位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量最高為0.8696，Sw2406位點(diǎn)多態(tài)信息含量最低為0.3328，平均多態(tài)信息含量為0.6388（表3)。結(jié)果表明大白豬和長(zhǎng)白豬兩個(gè)群體間的平均多態(tài)信息含量差異無(wú)顯著性（P＞0.05)，沒(méi)有表現(xiàn)直接的線性關(guān)系。

2.4 F-統(tǒng)計(jì)和遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)微衛(wèi)星座位的F-統(tǒng)計(jì)以及Nm來(lái)檢驗(yàn)群體間的遺傳分化程度和遷移率（表3)。群體的固定指數(shù)Fst為0.0273-0.5218，均值為0.2145，而Fis和Fit指數(shù)有正有負(fù)，如 S0178、S0218、IGF1、S0228、S0355、Sw1067位點(diǎn)的Fis值均為正值，而Fit除了SOO68為負(fù)值外其他18個(gè)位點(diǎn)均為正值。Fis和Fit出現(xiàn)正值表明群體基因型分化顯著。Nm為0.2291-8.9075，平均值為1.5320。Nm越小表明群體的遺傳結(jié)構(gòu)越相似。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，兩豬群遺傳分化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖2)，一方面可能因?yàn)樗鼈兪羌兿灯贩N，另一方面則主要是因?yàn)閮韶i群在19個(gè)位點(diǎn)的等位基因較少，共享極為有限的等位基因。

表3 19個(gè)微衛(wèi)星座位的雜合度，多態(tài)信息含量和F-統(tǒng)計(jì)Tab.3 The F-statistics and polymorphism information content（PIC)of the 19 microsatellite loci

圖2 大白豬和長(zhǎng)白豬的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structure of Yorkshire and Landrace pigs

3 討論

3.1 群體的多樣性

微衛(wèi)星標(biāo)記以其分析方法便捷、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在親子鑒定、輔助標(biāo)記和群體遺傳多樣性等方面得到廣泛應(yīng)用。研究表明19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)之間的多樣性差異存在顯著性（P＞0.05)，主要表現(xiàn)在相同位點(diǎn)的等位基因頻率在大白豬和長(zhǎng)白豬群體中的分布差異有顯著性（P＞0.05)，如在S0178位點(diǎn)109 bp的等位基因在大白豬種群出現(xiàn)的頻率最高，而長(zhǎng)白豬種群在109 bp處等位基因僅檢測(cè)到3個(gè)。其中19個(gè)位點(diǎn)特異性等位基因出現(xiàn)在長(zhǎng)白豬群的頻率較高。如S0178位點(diǎn)處121、123、125 bp等位基因，Sw936位點(diǎn)處117 bp等位基因，S0228位點(diǎn)處230和234 bp等位基因和S0155位點(diǎn)處152 bp等位基因僅在長(zhǎng)白豬種群中被檢測(cè)到，而Sw857位點(diǎn)處144 bp和S0143位點(diǎn)處168 bp等位基因僅在大白豬被檢測(cè)到，可能與長(zhǎng)白豬具有較高的雜合度有關(guān)。可將S0155、S0143、S0178、Sw857和Sw936位點(diǎn)作為長(zhǎng)白豬和大白品種鑒定的候選微衛(wèi)星位點(diǎn)。李何君等[17］和Costa等[18］分別應(yīng)用12和14對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)美系、英系、法系大約克夏豬群體和歐洲野豬進(jìn)行品系鑒定及個(gè)體鑒定，鑒定正確率均為100%，本研究選取的5對(duì)候選品種鑒定引物均在兩者的研究之列，說(shuō)明該位點(diǎn)是準(zhǔn)確、有效、可靠的品系鑒定位點(diǎn)。此外，分別對(duì)大白豬和長(zhǎng)白豬群體的觀測(cè)雜合度和期望雜合度進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，表明兩群體差異無(wú)顯著性（P＞0.05)，符合封閉群條件（參照實(shí)驗(yàn)用小型豬遺傳質(zhì)量控制，北京地方標(biāo)準(zhǔn): DB11/T 828.3 2011)?？蓮姆肿铀矫鞔_兩種群的遺傳背景，反映出大白豬和長(zhǎng)白豬兩群體之間的遺傳差異并作為“活的儀器”廣泛應(yīng)用于病毒的感染實(shí)驗(yàn)，疫苗的檢定和評(píng)價(jià)，為遺傳保種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化提供良好的分子基礎(chǔ)。

遺傳多樣性的衡量指標(biāo)通常為群體的平均雜合度和多態(tài)信息含量，大白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5271和0.5877；長(zhǎng)白豬的平均多態(tài)信息含量和平均雜合度分別為0.5652和0.6066。大白豬和長(zhǎng)白豬兩個(gè)品種的平均雜合度與平均多態(tài)信息含量與趙振華等[19］和鞏元芳等[20］對(duì)國(guó)內(nèi)大白豬和長(zhǎng)白豬的研究結(jié)果相比較低，表明該種群與國(guó)內(nèi)純系品種相比人工選育的程度更高，遺傳結(jié)構(gòu)更趨穩(wěn)定。此外，19個(gè)微衛(wèi)星座位的平均雜合度比Li等[21］對(duì)臺(tái)灣歐洲純系品種豬的研究結(jié)果略高，表明它們的選育程度非常接近，遺傳結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，更適合選用于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料。

3.2 群體的遺傳分化與變異

Fis值和Fit值均有正有負(fù)，表明群體的等位基因和基因型分化顯著，主要表現(xiàn)為相同位點(diǎn)的等位基因在不同品種間的分布差異顯著（P＞0.01)。而Fst值表示群體間的分化程度，F(xiàn)st的平均值為0.2145與趙振華等[19］和楊彤彤等[22］相比此次引進(jìn)種群的分化程度顯著（P＞0.01)低于國(guó)內(nèi)部分純種豬群[15］。Nm值越小表示群體間的遺傳結(jié)構(gòu)越相似，Nm的平均值為1.5320也顯著（P＞0.01)低于楊彤彤等[22］對(duì)我國(guó)部分純系豬的研究。與國(guó)內(nèi)部分保存的純系豬相比又一次證明了中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所引進(jìn)的大白豬和長(zhǎng)白豬兩純系種群群體內(nèi)分化較小遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定適合用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料，這可能與該種群的長(zhǎng)期人工選育有關(guān)。

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Analjsis of the pedigreed population genetics of SPF Yorkshire and Landrace pigs im ported from Canada

HE Xi-wen1，2，GAO Cai-xia2，JIANG Qian2，QUAN Jin-qiang1，CAIYuan1*，QU Lian-dong2*
（1.College of Animal Science and Technology of Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070，China. 2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS)，Harbin 150001)

ObjectiveTo understand the genetic background of the specific pathogen-free Yorkshire and Landrace pigs，imported from Canada by Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences.MethodsThe population genetics were investigated by using 19 pairs ofmicrosatellite primers.ResultsIn the Yorkshire pigs and Landrace pigs，84 and 89 alleles，respectively，were detected at19 microsatellites loci.The average polymorphic information content and mean heterozygosity in the Yorkshire pigs were 0.5271 and 0.5877，and in the Landrace population were 0.5652 and 0.6066，respectively.Because of the significant（P＜0.01)differences of alleles in different loci such as S0155，S0143，S0178，Sw857 and Sw936，itmade them possible to be used to identify Yorkshire and Landrace pigs＇breed. F-statistics showed that the differentiation within the population was small and genetic structure was stable.ConclusionsCompare with the domestic pedigree largeWhite and Landrace pigs，the SPF pedigree pigs imported from Canada aremore stable in genetic structure，and can be used as laboratory animalmodels in animal science research.

Specific pathogen-free pigs；Microsatellite；Laboratory Animal；Genetic diversity

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0551-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.001

2015-09-28

國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（2010DFB33620)；哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013RFQYJ043)。

賀希文（1987-)，男，碩士研究生，專業(yè):動(dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail:hexiwenso@163.com

蔡原，副教授，研究方向:動(dòng)物遺傳育種與繁殖.E-mail:caiyuan@gsau.edu.cn

曲連東，研究員，研究方向:分子病毒學(xué)與動(dòng)物疫病診斷學(xué).E-mail:qld@hvri.ac.cn