抗生素對微生物的聯(lián)合與低劑量毒性研究進展

方淑霞，王大力，朱麗華，石恬恬，秦孟楠，林志芬,*

1. 同濟大學環(huán)境科學與工程學院污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200092 2. 華中科技大學化學與化工學院，武漢430074

抗生素對微生物的聯(lián)合與低劑量毒性研究進展

方淑霞1，王大力1，朱麗華2，石恬恬1，秦孟楠1，林志芬1,*

1. 同濟大學環(huán)境科學與工程學院污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200092 2. 華中科技大學化學與化工學院，武漢430074

目前抗生素已成為一類不可忽視的環(huán)境污染物，它在環(huán)境中呈“混合-持久-低劑量”的暴露特征。因此，研究抗生素毒性效應，特別是它的聯(lián)合毒性以及低劑量下毒性興奮效應，對抗生素污染物生態(tài)風險的評價極其重要。以抗生素聯(lián)合毒性的研究進展為主線，重點概述了抗生素二元混合物的急性和慢性聯(lián)合毒性研究，指出了抗生素混合物間存在相互作用，它們的聯(lián)合毒性并非表現(xiàn)為簡單的加和或獨立效應，且抗生素急性-慢性聯(lián)合表現(xiàn)出的毒性效應也存在差異；發(fā)現(xiàn)了不僅單一抗生素具有Hormesis效應，低劑量抗生素二元混合物也具有Hormesis作用。但目前低劑量抗生素二元混合物對微生物的毒性興奮效應研究較少，其毒性興奮效應的預測和評價還有待進一步完善，以期為環(huán)境中抗生素的聯(lián)合生態(tài)研究和風險評價提供理論依據(jù)。

抗生素；微生物；聯(lián)合毒性；興奮效應

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來，被大量用于人類醫(yī)療保健、動物養(yǎng)殖和農業(yè)生產(chǎn)中，具有種類多、應用范圍廣的特點。目前，全世界每年抗生素的消費量達20多萬t[1]。而我國是抗生素的最大生產(chǎn)國和消費國，抗生素年使用量已達世界抗生素年使用量的25%[2]。因此，抗生素在我國已成為一類不可忽視的環(huán)境污染物，研究抗生素毒性效應及其生態(tài)風險評價極為重要。

抗生素是一種擬持久性污染物[4,6-7]。雖然抗生素進入環(huán)境后會經(jīng)過一系列轉化過程，包括吸附-解吸[8]、遷移[3]、降解[7]等環(huán)境方式，但是由于抗生素隨糞便和尿液的大量排入，抗生素及其代謝產(chǎn)物仍然大量殘留[9]。若僅開展急性毒性試驗會低估實際環(huán)境中抗生素長期作用所帶來的生態(tài)毒性效應和環(huán)境風險[10]。Thomulka等[11]測定了4種抗生素對哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的發(fā)光抑制毒性，結果發(fā)現(xiàn)，抗生素作用30 min沒有表現(xiàn)出發(fā)光抑制效應，但隨著作用時間的延長，4種抗生素在低劑量下都表現(xiàn)出了毒性效應?；前粪邕驅Υ笮蜏?Daphnia magna)的毒性結果也表明，其48 h所表現(xiàn)出的毒性是24 h的4倍[12]。顯然，抗生素急性-慢性聯(lián)合毒性存在差異。因此開展更接近環(huán)境實際體系的慢性毒性研究，可以更客觀、全面地評價污染物對環(huán)境和生態(tài)的潛在威脅，更有效地保護人類健康和生態(tài)安全。

抗生素在環(huán)境中低劑量殘留。Kolpin[13]監(jiān)測了美國30個州內139條河流中農藥、醫(yī)藥、獸藥、激素等95種有機污染物，其中抗生素濃度大多在μg·L-1級，Zhang等[14]測定了多家醫(yī)院廢水中抗生素污染物，發(fā)現(xiàn)21種抗生素濃度均介于5.9～11.8 μg·L-1，Jiang等[15]測定了黃浦江沿岸抗生素暴露濃度均介于36.71～313.44 ng·L-1。可見，抗生素在環(huán)境中多呈低劑量暴露。美國毒理學家Calabrese認為很多化合物在低劑量下將呈現(xiàn)出刺激作用，又稱之為興奮效應(Hormesis)。這種作用與高劑量下的抑制作用不同。有研究發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥物(如蘇拉明)在高劑量下抑制細胞增殖而具有臨床療效，但在低劑量條件下卻可以促進細胞增殖而成為一種局部激動劑[16]。因此，與所有其他化合物一樣，回答低劑量抗生素對環(huán)境微生物是否存在、為什么會存在Hormesis效應，也是目前環(huán)境科學領域關注問題之一[15]。

總之，抗生素在環(huán)境中往往呈現(xiàn)出混合、持久、低劑量的三大暴露特征，需要我們開展聯(lián)合急性、聯(lián)合慢性以及Hormesis效應等相關研究，但是之前的有關研究往往集中在抗生素對單一生物的急性(高劑量)毒性方面[16]。因此，為了促進抗生素生物的聯(lián)合與低劑量毒性研究進展，以課題組的前期研究成果為基礎，本文從抗生素的混合、持久、低劑量三大暴露特征出發(fā)，分別綜述了近年來抗生素對微生物的急性聯(lián)合毒性和慢性聯(lián)合毒性，以及低劑量抗生素的聯(lián)合Hormesis效應的研究，并展望了今后的研究思路，以期為環(huán)境中抗生素的聯(lián)合生態(tài)風險評價和修復提供一些指導。

1 抗生素二元混合物對急性聯(lián)合毒性研究(Acute toxicity of binary mixtures for antibioticsexposure on microorganisms)

現(xiàn)實環(huán)境中抗生素往往都以混合形式存在[6]。目前，研究人員已在大量地表水、污水處理廠、醫(yī)院廢水等地方同時檢測到多類抗生素污染物。Zou等[17]在匯入渤海灣的6條主要河流中同時檢測到磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類等抗生素。Xu等[18]在污水處理廠的進出水中發(fā)現(xiàn)氧氟沙星、羅紅霉素、和磺胺甲惡唑等多種抗生素共存。另有研究發(fā)現(xiàn)，瑞典醫(yī)院廢水中也同時監(jiān)測到氟喹諾酮、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶等多種抗生素[19]。

現(xiàn)實環(huán)境中抗生素與混合物間也總表現(xiàn)出與單一化合物不同的毒性作用。Soto-Rodríguez等[20]研究了喹諾酮類抗生素對費氏弧菌(Vibrio fischeri)的單一毒性和聯(lián)合毒性，結果顯示將10種抗生素按各自的無效應濃度進行混合后會表現(xiàn)出99%發(fā)光抑制率的毒性效應?？股鼗旌衔镩g往往存在一定的聯(lián)合作用[17]。Ren等[21]研究二元組合抗生素對發(fā)光細菌的急性聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)吉他霉素與鹽酸金霉素、吉他霉素與鹽霉素、吉他霉素與黃霉素組合表現(xiàn)出較強的協(xié)同作用，其TU*值分別為0.56、0.46、0.47；而鹽霉素與鹽酸金霉素、鹽霉素與黃霉素組合表現(xiàn)為輕微的拮抗作用，其TU值分別為1.25和1.23。另有研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素和氯霉素類抗生素對明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的聯(lián)合急性(15 min)毒性均表現(xiàn)出拮抗作用，其TU15m介于1.21～4.45之間[22]。此外，抗生素與其他類型化合物共存也有同樣的特性。An等[23]研究了磺胺類抗生素分別與呋喃酮類、吡咯酮類、吡咯類等群體感應抑制劑對費氏弧菌(Vibrio fischeri)的急性(15 min)聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素(SAs)與呋喃酮類的聯(lián)合效應為協(xié)同作用、與吡咯酮類為相加作用、與吡咯類為拮抗作用。

2 抗生素二元混合物對慢性聯(lián)合毒性研究(Chronic toxicity of binary mixtures for antibioticsexposure on microorganisms)

隨著混合污染物聯(lián)合毒性研究的不斷深入，加之環(huán)境現(xiàn)實體系中的抗生素污染物具有混合且持久性暴露特征，部分學者對抗生素混合污染物的毒性研究已從急性聯(lián)合毒性逐步轉向更為接近環(huán)境現(xiàn)實體系的慢性聯(lián)合毒性[24]。研究表明，與急性聯(lián)合毒性相似，當抗生素混合污染物持久作用于環(huán)境微生物時，它們的聯(lián)合毒性并非僅僅表現(xiàn)為簡單的加和或獨立效應。Yang等[25]研究了12種抗生素對淡水綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)的慢性聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)不同抗生素之間的聯(lián)合作用是不同的。比如磺胺類抗生素之間表現(xiàn)出相加作用，而四環(huán)素類與四環(huán)素類、大環(huán)內酯類與大環(huán)內酯類、氟喹諾酮與氟喹諾酮的聯(lián)合均呈協(xié)同作用。也有研究發(fā)現(xiàn)結構相似的四環(huán)素和金霉素對羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)的慢性聯(lián)合毒性表現(xiàn)為相加作用，而四環(huán)素和7-氨基頭孢霉烷酸結構差異較大且可能存在不同的毒性位點和作用方式，因而它們的慢性聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用[26]。

抗生素和其他類型化合物長期混合暴露也會產(chǎn)生不同的聯(lián)合作用。Sun等[27]把金霉素與重金屬銅(Ⅱ)聯(lián)合作用于產(chǎn)甲烷菌，發(fā)現(xiàn)15 d積累的甲烷產(chǎn)量明顯低于各組分產(chǎn)量之和，即其聯(lián)合毒性表現(xiàn)出拮抗作用。此外，Li等[28]把阿莫西林與納米銀混合作用于大腸桿菌(Escherichia coli)，24 h后發(fā)現(xiàn)納米銀與阿莫西林的混合作用使大腸桿菌的抗菌作用大幅度提高，其聯(lián)合毒性表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。另有研究認為，SAs與磺胺增效劑(TMP)聯(lián)合使用會使羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)的葉酸代謝受到雙重阻斷，嚴重抑制細胞生長，所以SAs-TMP對羊角月牙藻慢性聯(lián)合毒性表現(xiàn)出協(xié)同作用[29]。

雖然抗生素的慢性聯(lián)合與急性聯(lián)合毒性都存在著相互作用，但是它們表現(xiàn)出的聯(lián)合毒性效應卻往往不相同。Zou等[4]測定了SAs與TMP對明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的聯(lián)合毒性作用，發(fā)現(xiàn)急性聯(lián)合毒性測試體系中SAs-TMP呈拮抗效應，而慢性聯(lián)合毒性測試體系中SAs-TMP呈協(xié)同效應。同時，他們根據(jù)所測的不同急-慢性聯(lián)合毒性效應，進一步構建磺胺類抗生素及其增效劑混合物體系對明亮發(fā)光桿菌的急性聯(lián)合效應模型(方程1)和慢性聯(lián)合效應模型(方程2)：

(1)

n= 7, R2=0.954, SE=0.028, F=20.659, P=0.017

(2)

n= 7, R2=0.965, SE=0.107, F=27.552, P=0.011.

根據(jù)方程1和2的比較結果，他們發(fā)現(xiàn)：(1)在急性聯(lián)合毒性中磺胺類化合物對于發(fā)光菌受體蛋白是熒光素酶(Luc)，而在慢性聯(lián)合毒性中其受體蛋白則是二氫葉酸合成酶(Dhps)。(2)由各受體結合能前的擬合系數(shù)并不一致，可知急性聯(lián)合毒性中SA-Luc結合能力與慢性聯(lián)合毒性中SA-Dhps的結合能力有所差異?？梢?，受體蛋白的差異和受體蛋白結合能力的差異是導致SAs-TMP急性-慢性聯(lián)合差異的重要因素。

3 低劑量抗生素混合興奮效應研究(Hormeisis oflow dose antibiotics to microorganisms)

由于抗生素及其混合污染物在水、土環(huán)境中暴露濃度較低[30-31]，所以研究者對抗生素的研究也開始逐漸由傳統(tǒng)的高劑量研究轉向機制相關的低劑量研究[32]。研究表明，現(xiàn)階段使用的大多抗生素及大量的其他藥物都表現(xiàn)出Hormesis效應的雙相劑量反應[33]，如Migliore等[34]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素對大腸桿菌(Escherichia coli)具有低濃度(0.015～0.03 μg·mL-1)促進和高濃度(4 μg·mL-1)抑制現(xiàn)象。Gao等[26]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的7-氨基頭孢霉烷酸促進羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)的生長，且在濃度為120 g·mL-1時促進率最高，達22.6%。Deng等[33]研究發(fā)現(xiàn)6種SAs對明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)的單一慢性毒性(24 h)均表現(xiàn)出明顯的Hormesis現(xiàn)象，最大刺激在180%到210%之間。

近年來，低劑量混合污染物Hormesis已有報道，包括重金屬、多氯聯(lián)苯、持久性污染物等[35-37]?？股匾蚱涞湫偷囊谆旌?、劑量低特征，其低劑量下二元混合物毒性效應也已經(jīng)引起了人們的關注。如Zou等[38]研究低劑量SAs及TMP對費氏弧菌(Vibrio fischeri)聯(lián)合作用，發(fā)現(xiàn)5個二元混合體系均呈現(xiàn)出毒性興奮效應，其最大刺激程度均大于40%?？梢?，不僅單一抗生素具有Hormesis效應，混合抗生素也具有Hormesis作用。但目前低劑量抗生素混合物對微生物的毒性興奮效應研究較少，特別是聯(lián)合Hormesis效應預測方法進展較為緩慢。雖然近年來濃度加和模型(concentration addition, CA)和獨立作用(independent action, IA)模型已逐步應用到混合污染物聯(lián)合毒性Hormesis的研究中，如Ge等[39]的研究表明離子液體混合物對發(fā)光菌的毒性興奮效應可通過CA模型來預測；但是，我們前期研究發(fā)現(xiàn)[38]，對于混合抗生素的聯(lián)合Hormesis效應，尚無法通過CA或IA模型來預測，這是因為低劑量抗生素的聯(lián)合毒性不僅存在著相加，還存在著協(xié)同和拮抗等作用。因此，近期我們提出了“六點法”這一新的混合Hormesis預測方法：1)選擇了Hormesis曲線上具有代表性的六個點(如圖1)：A (EC50, 50)，B (EC90, 90)，C(M,Ymax)，D(ZEP,0)，E(NEC, 0)和F((1/2)×ZEP, Yh-ZEP))。

圖1 典型劑量-毒性興奮效應曲線及其“六點”注：NEC表示無效應濃度，ZEP表示零效應濃度，M表示最大促 進效應程度對應的污染物劑量，Ymax表示最大促進效應程度。Fig. 1 Six points in the hormetic dose response curveNote: NEC is no effect concentration, ZEP is the concentration of zero equivalence point, M is the concentration of maximal stimulatory effect, Ymax is the maximal stimulatory effect

根據(jù)曲線特征和定量結構-活性相關(QSAR)模型，我們提出了這6個點的預測方程并進一步通過預測出的6個點獲取Hormesis曲線，結果發(fā)現(xiàn)，所獲得的曲線與實際實驗的Hormesis曲線有很好的一致性。

現(xiàn)階段，雖然很多化合物的興奮效應現(xiàn)象已被各種實驗證實存在，但并沒有一個單一的機制能解釋普遍發(fā)生的Hormesis效應，較為人們所認同的理論主要有受體機制假說和過度補償理論。受體機制假說[40]認為激動劑與不同親和力和容力的2種受體亞型的結合差異導致了刺激和抑制2種相反的效應。過度補償理論[41]認為生物體受到刺激，在最初的抑制反應之后會出現(xiàn)一個補償過程，這個補償行為會逐漸超過控制行為，從而導致一個凈刺激效應。然而以上2種解釋也并不是所有學者都接受，不少學者甚至是Hormesis的支持者亦對上述Hormesis機制表示懷疑[42]。目前，有關低劑量抗生素興奮效應形成機制尚未開展系統(tǒng)研究。前期的初步研究發(fā)現(xiàn)[33]，SAs對明亮發(fā)光菌(Photobacterium phosphoreum) Hormesis效應的機制可能與細菌的群體感應系統(tǒng)有關，其可能的具體機理是低濃度SAs會促進發(fā)光菌生成更多的自誘導物-受體復合物(LuxR～AI)，而LuxR～AI復合體作為群體感應的信號分子，可以促進發(fā)光基因的表達從而引發(fā)Hormesis效應。另有報道認為[43]，阿莫西林抗生素對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的毒性興奮效應機制與銅綠微囊藻內多種基因的表達和調控有關?？傊蛣┝靠股豀ormesis機制解釋尚無定論，還亟待更為深入且透徹的研究。

4 總結與展望

抗生素現(xiàn)已成為一類不可忽視的環(huán)境污染物，它在環(huán)境中多呈典型“混合-持久-低劑量”的暴露特征。有關抗生素的聯(lián)合和低劑量的毒性研究表明，抗生素混合物間存在著相互作用，它們的聯(lián)合毒性并非表現(xiàn)為簡單的加和或獨立效應；低劑量抗生素混合物對微生物的毒性效應也呈現(xiàn)Hormesis特征，并可以采用六點法加以預測。

但是，目前有關抗生素的毒性效應研究還有待進一步完善，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

(1)需要多種模式生物來測定。環(huán)境風險評價中，合理的受體生物測試對象應包括不同能級的生物，很多生物面臨著抗生素復合暴露時，其聯(lián)合毒性效應及其作用機制是什么？

(2)環(huán)境中存在著許多可以影響抗生素生物有效性的物質，在這些共存物的作用下，抗生素間的聯(lián)合毒性會發(fā)生怎樣的變化？

(3)基于六點法的混合Hormesis的預測模型還比較繁瑣，而且它僅僅基于磺胺類混合物的聯(lián)合Hormesis的效應提出的，是否可用于其他抗生素，模型能否有效簡化，其生物學意義能否更好得以體現(xiàn)？

(4)抗生素的種類繁多，目前測定的僅是前期用量較多或頻率較高的種類，比如磺胺類，四環(huán)素類，大環(huán)內酯類等。那么其他類型的抗生素的聯(lián)合毒性如何，它們在低劑量下是否呈現(xiàn)出Hormesis效應呢？

總之，加強抗生素毒性效應，特別是圍繞上述這一系列問題，進一步開展聯(lián)合毒性以及低劑量下毒性興奮效應是未來相關研究的重要方向，這些問題的回答和相關研究將更具有理論意義和應用價值，可為環(huán)境中抗生素的聯(lián)合生態(tài)研究和風險評價提供理論依據(jù)。

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◆

Progress in Researches on Toxicity of Antibiotics in Low Dose and Mixture Exposure to Microorganisms

Fang Shuxia1, Wang Dali1, Zhu Lihua2, Shi Tiantian1, Qin Mengnan1, Lin Zhifen1,*

1. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China

2 November 2014 accepted 4 January 2015

Antibiotics have become serious environmental pollutants. Owing to their distinguishing feature of mixing, persistance and low-doses in the environment, a study on the toxicity of antibiotics, especially mixture toxicity and the hormetic effect in the low-dose, is significantly important to the ecological risk assessment. This review mainly focuses on the mixture toxicity of antibiotics and briefly summarizes the acute and chronic toxicity of binary chronic toxicity. Their joint effects are neither a simple addition of their individual effect nor independence of each other. The interactions in the binary mixture of antibiotics exist both in acute and chronic toxicity. Meanwhile, it is found that hormetic effect exists not only in the single toxicity but also in the binary toxicity when exposed to the low-dose. However, there are few studies on hormetic phenomenon in the binary mixtures of antibiotics. Therefore, a further study on the prediction and evaluation of the Hormesis in mixtures is needed, which can provide a theoretical basis for ecological risk assessment.

antibiotics; microorganisms; mixture toxicity; Hormesis

國家科技部“863”計劃重大項目(No.2012AA06A304)；同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室自主研究(重點)項目(PCRRY11003)；國家自然科學面上基金(201177092，21377096)，同濟大學英才(攀登)計劃(0400219287);中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(0400219287)

方淑霞(1989-)，女，碩士，研究方向為微生物毒理學，E-mail: fsxydx@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lzhifen@#edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141102001

2014-11-02 錄用日期：2015-01-04

1673-5897(2015)2-69-07

X171.5

A

林志芬(1972-)，女，教授，主要研究方向為混合污染物生物效應和人體健康評價。

方淑霞, 王大力, 朱麗華, 等. 抗生素對微生物的聯(lián)合與低劑量毒性研究進展[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 69-75

Fang S X, Wang D L, Zhu L H, et al. Progress in researches on toxicity of antibiotics in low dose and mixture exposure to microorganisms [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 69-75 (in Chinese)