貴州省典型礦區(qū)土壤重金屬污染對蚯蚓的毒性效應(yīng)評估

鄭麗萍，王國慶,*，林玉鎖，馮艷紅，吳春宇，張亞

1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 國家環(huán)境保護(hù)土壤環(huán)境管理與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042

貴州省典型礦區(qū)土壤重金屬污染對蚯蚓的毒性效應(yīng)評估

鄭麗萍1,2，王國慶1,2,*，林玉鎖1,2，馮艷紅1,2，吳春宇1,2，張亞1,2

1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 國家環(huán)境保護(hù)土壤環(huán)境管理與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210042

選取我國貴州省某礦區(qū)典型的重金屬復(fù)合污染土壤開展28 d慢性毒性暴露試驗(yàn)，以蚯蚓體內(nèi)2種抗氧化酶活性——過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)、8-羥基脫氧鳥苷(8-ODHG)和金屬硫蛋白(MT)含量為生物指標(biāo)，評估了以上生物指標(biāo)與土壤重金屬含量的相關(guān)性，探討該研究方法用于礦區(qū)土壤重金屬生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估的可行性。結(jié)果表明，CAT和SOD在暴露周期內(nèi)均出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的動(dòng)態(tài)響應(yīng)過程，表明蚯蚓通過提高CAT和SOD的活性來清除機(jī)體因污染脅迫而產(chǎn)生的自由基，以適應(yīng)環(huán)境變化，在毒性緩解后，蚯蚓體內(nèi)代謝產(chǎn)物的積累抑制了抗氧化氫酶活性，CAT和SOD活性下降并趨于穩(wěn)定。暴露于重金屬污染亞致死濃度時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的8-OHDG含量隨著暴露時(shí)間的延長顯著降低，隨著暴露濃度的增加，損傷存在由低到高的轉(zhuǎn)變。在28 d暴露周期內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)MT在重金屬脅迫下發(fā)揮了解毒作用，MT含量在蚯蚓暴露后第7天增加，隨后逐漸降低。本文基于生物毒性試驗(yàn)綜合評估了礦區(qū)典型重金屬污染土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，研究結(jié)果對指導(dǎo)重金屬復(fù)合污染土壤的修復(fù)與再利用具有重要意義。

重金屬；蚯蚓；抗氧化酶；8-羥基脫氧鳥苷；金屬硫蛋白；生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

礦產(chǎn)資源是人類生產(chǎn)和生活的基本源泉之一，但礦產(chǎn)資源的開發(fā)在對國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展起重要推動(dòng)作用的同時(shí)，也帶來了比較嚴(yán)峻的環(huán)境問題。礦山開采，特別是鉛鋅礦床、含硫多金屬礦床的開采過程中，由于采礦廢水和選礦廢液的直接排放，廢石和尾礦等固體廢棄物的堆放和淋濾，使礦區(qū)土壤中富集大量的重金屬。

礦區(qū)土壤重金屬的污染可以使土壤質(zhì)量下降，生態(tài)系統(tǒng)退化，農(nóng)作物減產(chǎn)，還可能威脅到人體的健康，而我國以往的礦業(yè)開發(fā)工作大多只注重經(jīng)濟(jì)利益，對礦區(qū)土壤重金屬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究也相應(yīng)落后。土壤中重金屬的活動(dòng)性、生物可利用性、毒性與重金屬的形態(tài)有密切的關(guān)系[1-2]，僅僅采用重金屬總量法來評估礦區(qū)土壤污染是不確切的。因此，研究礦區(qū)土壤重金屬的綜合生物毒性，嘗試使用模式生物的多種特征指標(biāo)聯(lián)合評價(jià)礦區(qū)土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，正確評估礦區(qū)土壤的污染等級和程度，進(jìn)行礦區(qū)生態(tài)重建的研究，正逐步成為礦區(qū)重金屬風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的研究熱點(diǎn)，有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

在土壤毒性評價(jià)的諸多模式生物中，蚯蚓在土壤有機(jī)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化上具有重要作用，同時(shí)其活動(dòng)可以改善土壤的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的透氣和排水保水功能。因此在土壤中保持健康的蚯蚓生態(tài)種群對于土壤環(huán)境的保護(hù)具有重要價(jià)值。而從生態(tài)學(xué)上來看，蚯蚓處于陸地生態(tài)食物鏈的底部，對大部分殺蟲劑和重金屬都具有富集作用。這些被富集的化學(xué)物質(zhì)可能并不對蚯蚓造成嚴(yán)重的傷害，但卻可能影響食物鏈中更高級的生物。同時(shí)蚯蚓對某些污染物比許多其他土壤動(dòng)物更為敏感，因此利用蚯蚓作為土壤環(huán)境的指示生物，可以提供一個(gè)保護(hù)整個(gè)土壤動(dòng)物區(qū)系的安全域值。

人類活動(dòng)所產(chǎn)生的化學(xué)品，尤其是工礦業(yè)化學(xué)品，無論是重金屬還是有機(jī)物實(shí)際大多是以復(fù)合污染的形式存在，需要我們探尋針對復(fù)合污染實(shí)際樣品的合適的生物評價(jià)體系與方法，對修復(fù)前后土壤的綜合毒性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。不同于常規(guī)的人工外源添加單一重金屬的方法，礦區(qū)土壤重金屬污染一般是多種重金屬的復(fù)合。因此，針對礦區(qū)土壤中重金屬污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，蚯蚓體內(nèi)的特征生物標(biāo)志物的選擇與優(yōu)化尤為重要。本研究選擇了3種不同的信號通路，這3個(gè)信號通路中，氧化損傷是所有污染物高濃度暴露下的普遍適用的指標(biāo)，MT是重金屬的暴露標(biāo)記，8-ODHG是DNA損傷標(biāo)記，為遺傳毒性水平的生物指標(biāo)，以上3種信號通路可以從不同側(cè)面聯(lián)合反映復(fù)合重金屬脅迫的生物毒性，有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。其中，抗氧化酶(SOD、CAT)是廣泛接受的反映氧化脅迫的生物標(biāo)志物。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，可有效清除蚯蚓體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子、終止自由基連鎖反應(yīng)；過氧化氫酶(CAT)是廣泛存在于需氧微生物、動(dòng)植物紅細(xì)胞及某些組織細(xì)胞內(nèi)的一種氧化還原酶，其主要功能是減少自由基和過氧化氫脂質(zhì)的形成[3-5]；8-羥基脫氧鳥苷是DNA氧化損傷的修飾產(chǎn)物，在體內(nèi)只通過DNA氧化損傷途徑形成，且在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不受飲食等因素影響[6-7]，從遺傳毒性的角度評價(jià)重金屬脅迫的影響；金屬硫蛋白(MT)具有維持細(xì)胞金屬含量動(dòng)態(tài)平衡和重金屬解毒作用雙重機(jī)制。MT可作為重金屬污染的生物標(biāo)志物，在受到重金屬脅迫時(shí)，細(xì)胞合成大量的金屬硫蛋白將游離的重金屬離子螯合，使細(xì)胞免受毒害[8-10]。

貴州省位于我國西南，礦產(chǎn)資源豐富，采冶歷史悠久，地表與地下水系發(fā)達(dá)，污染易遷移交織，冶煉區(qū)分布的廣泛性造成了污染土壤的廣泛性，歷史遺留土壤重金屬污染問題突出。本文研究土壤取自貴州省某廢棄冶煉廠周邊的農(nóng)田土壤作為暴露土壤，選擇有針對性的模式生物蚯蚓對土壤污染狀況進(jìn)行生物評價(jià)，探討所選生物指標(biāo)對土壤重金屬評價(jià)的可行性以及與土壤重金屬含量的相關(guān)性，綜合評價(jià)重金屬復(fù)合污染對土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，并用于指導(dǎo)重金屬復(fù)合污染土壤的修復(fù)與再利用工作。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

土壤：(1)我國貴州省媽姑鎮(zhèn)鉛鋅礦資源豐富，長期采冶導(dǎo)致土壤環(huán)境嚴(yán)重污染。致使重金屬元素鉛、鋅、鎘等進(jìn)入大氣、土壤、水體，附近的農(nóng)田土壤、河流水體等受到不同程度的污染。本文研究土壤于2014年6月采自貴州省媽姑鎮(zhèn)某廢棄冶煉廠周邊的農(nóng)田表層土壤樣品(0～20 cm)，采樣經(jīng)緯度為北緯26°97'35"，東經(jīng)104°56′39"(圖1)，試驗(yàn)開始前對土壤進(jìn)行風(fēng)干，過20目篩。經(jīng)測定該土壤樣品pH 7.02，有機(jī)質(zhì)含量37.16 g·kg-1。該點(diǎn)位土樣主要含有銅、鋅、鉛和鎘4種重金屬，具體濃度為：Zn 1 621.75 mg·kg-1，Cu 408.75 mg·kg-1，Pb 81 161.25 mg·kg-1，Cd 8.49 mg·kg-1)。

(2)采用OECD推薦的人工土壤(10%泥炭、20%高嶺土、0.3%～1.0%碳酸鈣、70%石英砂)。泥炭需磨細(xì)無肉眼可見的植物殘柱，高齡土中高齡石含量在30%以上，碳酸鈣采用分析純粉末狀試劑。風(fēng)干的石英砂中50～200 μm粒徑的細(xì)砂含量在50%以上。采用小型電工攪拌機(jī)，混勻上述組分，加入去離子水使其含水量達(dá)到干重的35%左右，混合均勻，為逐步稀釋法進(jìn)行蚯蚓暴露試驗(yàn)備用。

蚯蚓：試驗(yàn)中所用蚯蚓為赤子愛勝蚓。應(yīng)選擇具有環(huán)帶的2個(gè)月至1年大小的成蚓。同一個(gè)試驗(yàn)中所用的蚯蚓要來自同一生長環(huán)境，并且大小、蚓齡保持一致，蚓齡差別在4周以內(nèi)。選擇好的蚯蚓在用于試驗(yàn)前要先在所用的人工土壤環(huán)境中適應(yīng)至少

1天的時(shí)間，在此期間應(yīng)使用和在試驗(yàn)中一樣的食物。10條蚯蚓為1組。然后在試驗(yàn)開始前隨機(jī)分配到各個(gè)培養(yǎng)容器中。稱重前蚯蚓要先用去離子水清洗干凈，然后放到濾紙上吸去多余水分。清洗好后的每一條蚯蚓的重量應(yīng)在250～600 mg之間。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于礦區(qū)重金屬復(fù)合污染土壤中蚯蚓急性毒性試驗(yàn)的死亡率為100%，且礦區(qū)實(shí)際土壤研究區(qū)域不能采集到有嚴(yán)格濃度梯度的土壤樣品，為科學(xué)評價(jià)該點(diǎn)位礦區(qū)土壤的生態(tài)毒性，采用污染土壤與人工土壤按一定比例混合的逐步稀釋方法進(jìn)行蚯蚓暴露實(shí)驗(yàn)。采用28 d慢性毒性試驗(yàn)法綜合評價(jià)該區(qū)域點(diǎn)位土壤的生物毒性。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了供試土壤的暴露濃度，試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對照和6個(gè)暴露水平。處理組編號分別為CK、S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6。試驗(yàn)用的土壤量為500 g，其中污染土壤與清潔土壤混合比例以及最終試驗(yàn)土壤樣品中的重金屬濃度見表1，由于實(shí)地污染土壤為復(fù)合污染土壤，其中也含有一定量的銅和鋅。本暴露試驗(yàn)為亞急性毒性試驗(yàn)，暴露過程中各土樣蚯蚓均未出現(xiàn)死亡。

圖1 采樣點(diǎn)示意圖Fig. 1 Field sampling point

表1 供試土壤重金屬含量設(shè)置Table 1 Concentrations of heavy metal in test soils

蚯蚓的染毒及培養(yǎng)：試驗(yàn)時(shí)，調(diào)節(jié)土壤含水量為最大持水量的60%，然后將污染場地土壤與清潔土壤混勻后放入塑料容器中。然后隨機(jī)選擇健康、環(huán)帶明顯、質(zhì)量相近(250～600 mg)的清腸24 h的成體蚯蚓10條放入塑料容器中。用塑料薄膜封口，并用工具扎孔。將上述準(zhǔn)備好的塑料容器一并放入人工氣候箱中培養(yǎng)，箱中為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件：溫度為20 ℃±0.2 ℃，濕度為(75士7)%，光照1 333 lx(間歇光照，即12 h光照、12 h黑暗)，并定期添加少量的水以保持基質(zhì)的濕度。每周每個(gè)處理加入20 g干牛糞，分別于暴露3、7、14、28 d后將蚯蚓取出，記錄存活狀況后清腸1 d稱重、測定酶活性，8—羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)和金屬硫蛋白(MT)，每一處理和對照各設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 分析測試

1.3.1 組織液的制備

采樣時(shí)間分別為蚯蚓暴露后的第3、7、14、28 天。每一處理的3個(gè)平行樣各采集1～2條活蚯蚓，稱重，加入蚯蚓體重9倍的生理鹽水，快速將蚯蚓剪成數(shù)段，移入勻漿器，勻漿，制成10%的組織勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入5 mL離心管，2 500 r·min-1，離心10 min，提取上清液。樣品提取液可立即用于測定蛋白質(zhì)含量、酶的活性、8—羥基脫氧鳥苷和金屬硫蛋白(MT)。

1.3.2 生物指標(biāo)的測定

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理均采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0進(jìn)行。以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)法，并以P>0.05，P<0.05，P<0.01分別表示沒有影響(不顯著)、差異顯著和差異極顯著水平。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 重金屬對蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的影響

圖2為重金屬作用下蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶活性的變化情況。如圖2所示，在重金屬脅迫下第3天蚯蚓SOD活性與對照組相比高濃度處理組SOD活性有一定程度的抑制，第7天表現(xiàn)出對SOD顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)(P<0.05)，在S-2組，SOD誘導(dǎo)程度達(dá)到最大，高濃度組SOD活性有所降低，但仍然高于對照組SOD活性值；在第14天，各處理組蚯蚓SOD活性表現(xiàn)為低濃度抑制，高濃度誘導(dǎo)的效應(yīng)，在第28天，隨著處理濃度的增加(除了S-1外)其他各組表現(xiàn)為抑制的效應(yīng)。

圖2 重金屬污染土壤對蚯蚓體內(nèi)SOD活性的影響Fig. 2 Effects of heavy metal in soil on SOD activity in earthworm

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，重金屬暴露7 d后蚯蚓體內(nèi)SOD活性顯著升高，說明重金屬的脅迫或代謝過程產(chǎn)生了超氧陰離子[14]，從而誘發(fā)了SOD活性增加。在暴露的第7天時(shí)SOD的誘導(dǎo)效應(yīng)最大。然而隨著重金屬的毒害作用蚯蚓細(xì)胞受到損傷，SOD活性下降并趨于穩(wěn)定。與此相似，馮濤等[15]發(fā)現(xiàn)B[a]P(30 μg·L-1)脅迫下大彈涂魚肝臟SOD活性在第3天顯著升高，隨后降至對照水平。另外，在本試驗(yàn)中處理組蚯蚓SOD活性與對照組相比產(chǎn)生了“抑制—誘導(dǎo)—抑制—抑制”的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。這可能因?yàn)楸┞冻跗谥亟饘偕镉行暂^大其急性脅迫使SOD受到誘導(dǎo)，在暴露短時(shí)間內(nèi)SOD活性顯著升高，在毒性緩解后，重金屬代謝產(chǎn)物的積累抑制了SOD酶活性，SOD活性下降并趨于穩(wěn)定。王重剛等[16]發(fā)現(xiàn)B[a]和芘暴露(50 μg·L-1)使梭魚肝臟SOD活性主要表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)效應(yīng)，而5 μg·L-1的處理組在暴露7 d后SOD未表現(xiàn)出誘導(dǎo)，而是抑制效應(yīng)。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

2.2 污染土壤對蚯蚓體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)的影響

圖3為污染土壤對蚯蚓體內(nèi)過氧化氫酶活性的變化情況。從圖3可以看出，隨著暴露時(shí)間的延長，對照的CAT變化范圍為4.71～7.34 U·mg-1蛋白，平均為5.05 U·mg-1蛋白；而各處理蚯蚓CAT活性隨著暴露時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增高后降低，最后有一定恢復(fù)的趨勢。在暴露的第3天，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較有一定程度的降低，高濃度處理組S-4、S-5、S-6中蚯蚓CAT活性降低顯著(P<0.05)，第7天各處理組CAT活性受到顯著誘導(dǎo)(P<0.05)，隨著處理組重金屬濃度的增加，土壤中蚯蚓的CAT活力呈現(xiàn)增加的趨勢，S-6中蚯蚓的CAT活性最高；暴露的第14天，各處理組CAT活性與對照組相比均有一定程度的降低，尤其是高處理組的蚯蚓CAT活性受抑制明顯(P<0.05)，暴露的第28天時(shí)，各處理組蚯蚓CAT活性與第14天相比呈現(xiàn)增高的趨勢，但仍然低于對照組，在暴露28 d周期內(nèi)各處理組蚯蚓CAT活性呈抑制-誘導(dǎo)-抑制-抑制的變化趨勢。

圖3 重金屬污染土壤對蚯蚓體內(nèi)CAT活性的影響Fig. 3 Effects of heavy metal in soil on CAT activity in earthworms

CAT可有效清除生物體內(nèi)過量的過氧化氫，維持細(xì)胞內(nèi)過氧化氫平衡，生物體內(nèi)一種重要的抗氧化防御性功能酶，其活性成分或含量可受污染的脅迫而發(fā)生改變。本研究表明，在重金屬低濃度處理時(shí)，蚯蚓體組織的CAT活性顯著增加，表明蚯蚓通過提高CAT的活性來清除機(jī)體因污染脅迫而產(chǎn)生的自由基，以適應(yīng)環(huán)境變化,保持體內(nèi)平衡[17]。隨著處理濃度的增加，CAT活性出現(xiàn)了不同程度的升高，在第7天時(shí)，S-6組CAT活性誘導(dǎo)程度達(dá)到最大，高濃度處理組表現(xiàn)為強(qiáng)誘導(dǎo)響應(yīng)，這可能與污染因素隨著暴露時(shí)間的延長強(qiáng)烈誘導(dǎo)CAT活性，直至某一臨界濃度使其CAT活性達(dá)到最大值有關(guān)[18-19]。

2.3 重金屬對蚯蚓體內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)的影響

圖4為重金屬作用下蚯蚓體內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷含量的變化情況。如圖4所示，在重金屬脅迫下第3天各處理組蚯蚓8-OHDG含量與對照組相比有一定程度降低，第7天各處理組蚯蚓8-OHDG含量與對照組相比差異不明顯；在暴露第14天各處理組蚯蚓的8-OHDG有顯著的(P<0.05)降低，說明蚯蚓的DNA出現(xiàn)了一定程度的損傷；暴露第28天，各處理組蚯蚓8-OHDG含量仍低于對照組。說明隨著暴露時(shí)間的延長，蚯蚓體內(nèi)DNA損傷明顯，在重金屬脅迫下8-OHDG含量出現(xiàn)明顯降低并較穩(wěn)定的維持在一定水平。8-OHDG能夠衡量蚯蚓組織細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，反映在重金屬脅迫狀態(tài)下細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，且經(jīng)代謝后在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)定存在，蚯蚓組織液的8-OHDG水平可以為評價(jià)重金屬對蚯蚓的生物脅迫提供更加直觀、有效的信息。

Reinecke等[20]研究表明暴露于氯化鎳的蚯蚓，重金屬鎳可以引起其DNA損傷，隨著暴露濃度的增加，損傷有一個(gè)明顯的由低到高的轉(zhuǎn)變。該研究結(jié)果表明，暴露于鎳化合物的土壤引起了無脊椎動(dòng)物細(xì)胞DNA單鏈斷裂，說明這種重金屬具有潛在遺傳毒性。細(xì)胞DNA的完整性是其功能正常發(fā)揮的重要前提，重金屬脅迫會(huì)對DNA的完整性造成影響。完整性是對DNA鏈斷裂程度的一種鑒定，細(xì)胞DNA完整性的損傷程度愈高，就意味著細(xì)胞核基因和線粒體基因的缺失、突變愈嚴(yán)重[21]。

圖4 重金屬污染土壤對蚯蚓體內(nèi)8-OHDG含量的影響Fig. 4 Effects of heavy metal in soil on 8-OHDG content in earthworm

2.4 重金屬對蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)的影響

圖5為重金屬作用下蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)含量的變化情況。如圖5所示，在重金屬脅迫下第3天各處理組蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)含量與對照組相比變化不明顯，第7天高濃度處理組中蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白(MT)呈現(xiàn)一定程度的增高趨勢，說明在重金屬脅迫下蚯蚓體內(nèi)出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)。隨著暴露時(shí)間的延長，第14天與對照組相比，各處理組蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白均出現(xiàn)一定程度的增高(P<0.05)，蚯蚓體內(nèi)細(xì)胞合成大量的金屬硫蛋白將游離的重金屬離子螯合，使細(xì)胞免受毒害。暴露第28天低濃度處理組S-1、S-2中蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白仍然高于對照組，其他各組蚯蚓體內(nèi)MT與對照組相比呈降低趨勢。說明隨著暴露時(shí)間的延長，蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白發(fā)揮解毒作用后MT呈現(xiàn)降低趨勢，恢復(fù)到正常水平。

圖5 重金屬污染土壤對蚯蚓體內(nèi)MT含量的影響Fig. 5 Effects of heavy metal in soil on MT content in earthworm

Brulle等[22]采用人工土壤法，將成熟赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)暴露于80、800 mg·kg-1重金屬鎘中，通過克隆金屬硫蛋白(MT)、過氧化氫酶(CAT)、鈣調(diào)蛋白(Calm)、熱休克蛋白(Hsp60、Hsp70)、丙酮酸羧究證實(shí)蚯蚓體內(nèi)MT可作為環(huán)境重金屬污染評估的主要生物標(biāo)志物之一。Homa等[23]也通過研究發(fā)現(xiàn)，暴露于復(fù)合重金屬污染外界環(huán)境下蚯蚓體內(nèi)MT-2基因表達(dá)水平和蚯蚓個(gè)體繁殖數(shù)目存在很好地線性關(guān)系，強(qiáng)調(diào)指出蚯蚓體內(nèi)MT-2轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平作為生物標(biāo)志物可很好的監(jiān)控重金屬污染(尤其是Cd)的狀況。Homa等[24]采用濾紙接觸試驗(yàn)，將赤子愛勝蚓分別暴露于一定濃度Zn、Cu、Pb、Cd等重金屬處理?xiàng)l件下，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測蚯蚓體腔組織中wMT-2的表達(dá)水平，研究表明除了暴露于Pb處理外，其他處理中wMT-2表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。另外國內(nèi)也有報(bào)道用陸地生態(tài)中昆蟲類等體內(nèi)MT作為環(huán)境重金屬污染評估生物標(biāo)志物的研究[25]。

綜上，可以得出以下結(jié)論：(1)在重金屬復(fù)合污染的亞致死濃度暴露下，蚯蚓體內(nèi)2種抗氧化酶(SOD和CAT)活性含量均對其產(chǎn)生了不同程度的響應(yīng)，CAT和SOD在暴露周期內(nèi)均出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的動(dòng)態(tài)響應(yīng)過程。

(2)在重金屬復(fù)合污染的亞致死濃度暴露下，蚯蚓體內(nèi)的8-羥基脫氧鳥苷和金屬硫蛋白都出現(xiàn)了相應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制，說明復(fù)合重金屬脅迫可引起蚯蚓DNA損傷，蚯蚓體內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷和金屬硫蛋白(MT)可作為環(huán)境重金屬污染評估的生物標(biāo)志物，本文經(jīng)過毒性評估研究發(fā)現(xiàn)該點(diǎn)位所處的區(qū)域土壤存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

(3)礦區(qū)重金屬復(fù)合污染土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)不能夠單純依靠一類指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，要根據(jù)重金屬的特點(diǎn)結(jié)合多種生物指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。本文選擇蚯蚓抗氧化酶系指標(biāo)，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)和金屬硫蛋白(MT)作為重金屬復(fù)合污染土壤的綜合生物評價(jià)指標(biāo)體系，從細(xì)胞水平和DNA水平多方面有效的評價(jià)了某礦區(qū)實(shí)際重金屬污染土壤對蚯蚓體內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)的影響，可用以指導(dǎo)礦區(qū)重金屬生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)以及礦區(qū)污染土壤的修復(fù)與再利用工作。

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◆

Evaluation of Toxicity Effects of Heavy Metal Contaminated Soils on Earthworm (Eiseniafoetida) in a Mining Area of Guizhou Province

Zheng Liping1,2, Wang Guoqing1,2,*, Lin Yusuo1,2, Feng Yanhong1,2, Wu Chunyu1,2, Zhang Ya1,2

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection of China, Nanjing 210042, China 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Soil Environmental Management and Pollution Control, Nanjing 210042, China

17 December 2014 accepted 27 January 2015

Typical soils contaminated by multiple heavy metals were collected from a mining area in Guizhou Province for 28 d chronic toxicity assay. Activity of antioxidant enzymes, i.e. catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD), 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHDG) and metallothionein (MT) in the earthworm (Eisenia foetida) were determined to evaluate correlations between these indicators and soil heavy metal contents. Feasibility of using these indicators to assess ecological risk of heavy metal contaminated mining soils was investigated. Results showed that the activity of CAT and SOD in earthworms increased firstly, and were inhibited thereafter during the exposure duration. This might suggest that activity of CAT and SOD in earthworm was raised to remove free radicals caused by stress of heavy metal contamination so as to adapt to changes of the environment. The accumulation of metabolites in earthworms after alleviating of metal toxicity inhibited activity of antioxidant enzymes, which led to decrease in CAT and SOD activity. When exposed to sub-lethal heavy metal concentrations, content of 8-OHDG in earthworms showed significant decrease with exposure time. With increase in exposure concentrations, more serious damages on 8-OHDG were observed. Within the exposure duration of 28 days, MT in earthworm played a detoxification role under the stress of heavy metal contamination. MT contents increased after 7 days of exposure and decrease thereafter. This study performs a comprehensive evaluation on ecological risk of typical heavy metal contaminated soils of a mining area based on toxicity assay. Results of this study will be helpful to guide remediation of heavy metal contaminated soils as well as its reuse after treatment.

heavy metal; earthworm; antioxidant enzymes; 8-OHDG; MT; ecological risk assessment

貴州省重大科技計(jì)劃課題(黔科合重大專項(xiàng)字[2012]6014號)；2014年環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201409041和201409042)

鄭麗萍(1985-)，女，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)閳龅匚廴究焖偕飳W(xué)診斷試驗(yàn)方法，E-mail: zlp@nies.org

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wgq@nies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20141217001

2014-12-17 錄用日期：2015-01-27

1673-5897(2015)2-258-08

X171.5

A

王國慶(1978-)，男，江蘇姜堰人，博士，副研究員，主要從事土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估與修復(fù)管理研究。

鄭麗萍, 王國慶, 林玉鎖, 等. 貴州省典型礦區(qū)土壤重金屬污染對蚯蚓的毒性效應(yīng)評估[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 258-265

Zheng L P, Wang G Q, Lin Y S, et al. Evaluation of toxicity effects of heavy metal contaminated soils on earthworm (Eisenia foetida) in a mining area of Guizhou Province [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 258-265 (in Chinese)