萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解

高 闖，張 全，王繼鋒

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

萘降解菌的篩選及其對多環(huán)芳烴的降解

高 闖1，2，張 全2，王繼鋒2

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

從柴油污染土壤中篩選分離出一株萘降解菌N-3，進(jìn)行了菌種鑒定及萘雙加氧酶基因（nah）驗(yàn)證，并考察了該菌對不同種類多環(huán)芳烴（PAHs）的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有nah基因；當(dāng)分別對液體培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h時，菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關(guān)性。該菌不僅能有效降解萘，且對其他種類PAHs也有一定降解作用。

萘降解菌；多環(huán)芳烴；生物降解；菌種篩選；銅綠假單胞菌

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的芳香族化合物。近年來，隨著人類生產(chǎn)活動的加劇，使環(huán)境中的PAHs大量增加［1］。由于PAHs具有疏水性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量高、穩(wěn)定性好、毒性大、難降解、在環(huán)境中存在時間長［2］、具有潛在致癌性等特點(diǎn)［3］，被很多國家列為優(yōu)先控制污染物［4-5］。土壤中的PAHs主要來源于污水灌溉、大氣沉降和工業(yè)滲漏等。PAHs被土壤粒子吸附后，可經(jīng)農(nóng)作物富集而進(jìn)入食物鏈，威脅人類健康［6］。此外，土壤中的PAHs還可進(jìn)入大氣和水體，造成二次污染。目前，微生物法是降解PAHs最有效的方法之一［7-8］。該法通過微生物的生長代謝等過程將有毒、難降解的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成無毒無害的化合物，安全經(jīng)濟(jì)且對環(huán)境無二次污染。近年來已有多名學(xué)者分離篩選出不同種類的萘、菲、蒽、芘、芴等PAHs的降解菌［9-14］。

本工作從柴油污染土壤中篩選、分離出一株高效萘降解菌N-3，對其進(jìn)行了菌種鑒定及PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，并考察了該菌株對單一萘、菲、蒽、芘、芴的降解能力及降解過程中脫氫酶活性的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

萘、菲、蒽、芘、芴、氯化三苯基四氮唑（TTC）：純度均為99%，Sigma-Aldrich公司；正己烷：分析純；葡萄糖：純度為97%。

Tris-HCl 緩沖溶液：三羥甲基氨基甲烷濃度為0.05 mol/L，pH=7.19。

土樣：取自某市的柴油污染土壤。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

萘選擇性培養(yǎng)基及PAHs降解培養(yǎng)基：分別用正己烷配制萘、菲、蒽、芘、芴質(zhì)量濃度為1 g/L的有機(jī)溶液，過濾除菌，取一定量添加到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，使萘、菲、蒽、芘、芴的質(zhì)量濃度分別為50 mg/L，待正己烷揮發(fā)完畢后備用。

在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，即得相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

6010型紫外-可見分光光度計(jì)：惠普公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津公司。GTR21-1型離心機(jī)：北京時代北利公司。

1.2 萘降解菌的篩選

取10 g柴油污染土壤加入到100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下浸取4 h，將浸取液在3 000 r/min下離心5 min，將10 mL上清液加入到100 mL萘選擇性液體培養(yǎng)基中經(jīng)4代富集培養(yǎng)（萘質(zhì)量濃度從50 mg/L逐步提高到200 mg/ L）后，取適量富集培養(yǎng)液，稀釋涂布在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上，待有明顯菌落出現(xiàn)時從中選取大小、形態(tài)各異的菌落在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步劃線純化分離。

將各純化后的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速6 000 r/min下離心，用生理鹽水重懸浮并調(diào)節(jié)菌懸液在600 nm處的吸光度（OD600）為1，冷藏備用。

將各菌懸液按10%（φ）的接種量分別接種到萘選擇性液體培養(yǎng)基中，觀察其生長情況并測定培養(yǎng)液中的萘含量，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行試樣。

1.3 萘降解菌的鑒定

利用Baldwin等［15］2003年報(bào)道的nah基因的簡并引物nahf/nahr，對篩選出的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，用細(xì)菌DNA提取試劑盒（Tiangen）對菌株進(jìn)行DNA提取。選擇一株生長情況最好、對萘降解能力最強(qiáng)且含有nah基因的菌株作為萘降解菌。

菌株的鑒定工作委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。

1.4 萘、菲、蒽、芘、芴的降解

將萘降解菌的菌懸液按10%（φ）的接種量分別接種于100 mL 含不同PAHs的降解培養(yǎng)基中，于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體生長曲線及降解后培養(yǎng)液中各PAHs含量，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行試樣。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度的測定

以菌體培養(yǎng)液的OD600值表征培養(yǎng)液中的菌體濃度。

1.5.2 萘、菲、蒽、芘、芴質(zhì)量濃度的測定

試樣經(jīng)正己烷萃取后，用氣相色譜儀測定各PAHs的質(zhì)量濃度。色譜條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測器溫度330 ℃，毛細(xì)管柱50 m×0.25 mm×0.25 μm，柱溫130 ℃保持3 min，以15 ℃/min的升溫速率梯度升溫至280 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.5.3 脫氫酶活性的測定

通過測定微生物的脫氫酶活性可以了解微生物對有機(jī)污染物的氧化分解能力，具體方法見文獻(xiàn)［16］：取2 mL降解后培養(yǎng)液于一系列具塞試管中，加入pH=8.5 的0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液、0.1 mol/L 葡萄糖溶液、0.5%（w）TTC 各2 mL，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h。加入2滴濃硫酸中止反應(yīng)，并準(zhǔn)確加入5 mL甲苯，充分振蕩，萃取。待反應(yīng)生成的紅色三苯基甲臜（TF） 被完全萃取到有機(jī)相時，將有機(jī)相在4 000 r/min下離心5 min，過濾后測定濾液于486 nm處的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脫氫酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 萘降解菌的篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)，在萘選擇性固體培養(yǎng)基平板上得到3株能以萘為唯一碳源和能源生長的菌株，分別命名為N-1，N-2，N-3。3株菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線見圖1，降解60 h后3株菌的萘降解率見圖2。由圖1和圖2可見，菌株N-3生長情況最好，且降解60 h后的萘降解率最高，達(dá)到25.31%。

圖1 3株萘降解菌在萘選擇性培養(yǎng)基中的生長曲線

圖2 3株菌的萘降解率

3株菌的nah基因擴(kuò)增電泳照片見圖3。由圖3可見，菌株N-1和N-3中均含有nah基因，而菌株N-2中未發(fā)現(xiàn)。結(jié)合圖1～3的結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)選擇N-3作為萘降解菌。

圖3 3株菌的nah基因擴(kuò)增電泳照片M：分子標(biāo)記；NC：空白對照；N-1，N-2，N-3：萘降解菌

2.2 菌株N-3的鑒定

經(jīng)過對菌株N-3的16S rDNA序列分析，鑒定其為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。對該菌進(jìn)行簡單生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：該菌為革蘭氏陰性菌，菌體的一端有單鞭毛，無芽胞；氧化酶陽性，能氧化分解葡萄糖和木糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，但不分解乳糖和蔗糖，可液化明膠，可分解尿素，可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?，吲哚試?yàn)呈陰性，可利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。

2.3 菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解

菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線見圖4。由圖4可見：菌株N-3在萘、菲、蒽、芘、芴等5種PAHs中都能生長；在蒽和菲中生長情況最好，其次是萘，在芘和芴中生長情況最差。菌株N-3對不同PAHs的降解率見圖5。由圖5可見：經(jīng)過84 h的降解，菌株N-3對萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%；菌株N-3對這5種PAHs降解能力的大小順序?yàn)椋狠欤痉疲据粒拒牛拒?，與該菌在不同PAHs體系中的生長情況呈一定的正相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌不僅可有效降解萘，而且也能有效降解液相中其他種類的PAHs。

圖4 菌株N-3在不同PAHs體系中的生長曲線

圖5 菌株N-3對不同PAHs的降解率

2.4 菌株N-3的脫氫酶活性

菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性見圖6。由圖6可見：菌株N-3在所有PAHs體系中的OD486都是先增大后減??；在菲和蒽體系中，菌株N-3的脫氫酶活性在前72 h上升迅速，而后略有下降；在萘、芘和芴體系中，菌株N-3的脫氫酶活性在前60 h上升迅速，而后呈下降趨勢，總體均低于菲和蒽體系中的脫氫酶活性。這表明該菌株對萘、芘和芴的降解能力沒有對菲和蒽的降解能力強(qiáng)。該結(jié)果與菌株N-3對不同PAHs降解率的結(jié)果呈正相關(guān)性，由此也可證明用脫氫酶活性表征微生物對有機(jī)污染物的降解能力是一種可靠的方法。

圖6 菌株N-3在不同PAHs體系中的脫氫酶活性

3 結(jié)論

a）從柴油污染土壤中分離出一株降解萘的菌株N-3。該菌能以萘為唯一碳源及能源生長，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有萘雙加氧酶基因nah。

b）該菌能有效降解液相中的萘、菲、蒽、芘、芴。在質(zhì)量濃度為50 mg/L的不同種單一PAHs體系中，經(jīng)過84 h的降解，萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分別為28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。

c）菌株N-3的脫氫酶活性與其對不同PAHs的降解率呈一定的正相關(guān)性，且對PAHs的降解具有廣譜性。

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（編輯 葉晶菁）

Screening of Naphthalene-Degrading Strain and Degradation of PAHs

Gao Chuang1，2，Zhang Quan2，Wang Jifeng2
（ 1. College of Petrochemical Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China；2. Sinopec Fushun Petrochemical Research Institute，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China）

A naphthalene-degrading strain N-3 was isolated and identified from the diesel-contaminated soil. The naphthalene dioxygenase（nah）gene in the cell was verified. The degradation abilities to different PAHs and the dehydrogenase activity of the strain were studied. The experimental results show that：N-3 is a Pseudomonas aeruginosa strain，containing nah gene；When naphthalene，phenanthrene，anthracene， pyrene or fluorene with 50 mg/L of mass concentration are degraded in the medium by N-3 for 84 h，their degradation rates are 28.81%，34.83%，36.65%，27.50% and 23.47%，respectively. There is a positive correlation between the dehydrogenase activity of N-3 and the degradation rates of different PAHs. The strain not only can degrade naphthalene effectively，but also can degrade other kinds of PAHs.

naphthalene-degrading bacteriun；polycyclic aromatic hydrocarbons；bio-degradation；strain screening；Pseudomonas aeruginosa

X172

A

1006 - 1878（2015）01 - 0017 - 04

2014 - 07 - 23；

2014 - 11 - 03。

高闖（1987—），男，遼寧省撫順市人，碩士生，電話 18741390633，電郵 573088322@qq.com。聯(lián)系人：王繼鋒，電話 18941366706。