原花青素對鎘引起的雞胚睪丸氧化損傷的緩解作用

侯福銀，宓君鵬，劉興廷，李劍，米玉玲，張才喬

浙江大學動物科學學院，杭州 310058

原花青素對鎘引起的雞胚睪丸氧化損傷的緩解作用

侯福銀，宓君鵬，劉興廷，李劍，米玉玲*，張才喬#

浙江大學動物科學學院，杭州 310058

為探索原花青素對鎘引起的雞胚睪丸氧化損傷的緩解作用，本實驗設置了對照組、鎘、葡萄籽提取物原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)和鎘+GSPE組，在胚胎期第6.5天(E6.5)注射0.05 mg·kg-1鎘或2.5 mg·kg-1GSPE，統(tǒng)計孵化率和睪丸指數(shù)，并在E17.5檢測睪丸形態(tài)、氧化指標、細胞凋亡和內質網(wǎng)應激相關基因的表達情況。結果表明：與對照組相比，鎘處理組孵化率和睪丸指數(shù)均顯著降低；睪丸組織結構出現(xiàn)了細胞核固縮、空泡化和染色質周緣化等變化，過氧化氫和丙二醛水平升高、超氧化物歧化酶活性顯著降低、谷胱甘肽含量明顯減少，凋亡細胞顯著增多；睪丸中抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達水平下降，同時促凋亡基因Caspase3和內質網(wǎng)應激相關基因(XBP-1和HO-1)mRNA表達水平顯著上升。然而，GSPE聯(lián)合處理，明顯緩解了鎘引起的睪丸損傷，使孵化率和睪丸指數(shù)回升，抗氧化水平和內質網(wǎng)應激得到改善，凋亡細胞顯著減少，睪丸形態(tài)趨于正常。結果表明：GSPE可通過其抗氧化作用降低XBP-1相關的內質網(wǎng)應激基因的表達，從而緩解鎘引起的雞胚睪丸生殖毒性。

鎘；雞胚；睪丸；氧化損傷；原花青素

鎘(Cadmium，Cd)是一種人體非必需的二價重金屬離子，隨著工農業(yè)的迅速發(fā)展，其廣泛應用于電鍍、核工業(yè)和蓄電池等生產中，極易造成生態(tài)環(huán)境的污染[1-3]。同時，Cd易通過飲水、吸煙、食物和空氣進入人和動物體內，繼而蓄積在肝臟、腎臟和睪丸等組織器官，造成不同程度損害[4-9]。近些年，有關職業(yè)接觸引發(fā)的鎘疾病、環(huán)境污染導致的鎘超標和鎘大米等事件，引起了人們的廣泛重視。越來越多的研究表明，Cd能夠引起睪丸發(fā)育異常，生精作用紊亂甚至不育[10]。并且，Cd可顯著降低雞胚抗氧化水平和孵化率[11]。有學者認為，內質網(wǎng)應激和線粒體信號通路共同作用，調節(jié)Cd引起的睪丸生殖細胞凋亡[12]。我們通過預實驗發(fā)現(xiàn)Cd能夠引起雞胚睪丸氧化損傷，但其具體的生殖毒性機制和防御措施仍不清楚。

葡萄籽提取物原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)作為一種天然的食物源性抗氧化劑，可以有效清除自由基，具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗凋亡等生物學活性[13]。研究報道，GSPE能夠通過抵抗機體的氧化應激和細胞凋亡，緩解硫酸鎳導致的大鼠睪丸氧化損傷[14]，兔類固醇性骨壞死[15]和糖尿病大鼠肝臟的組織損傷[16]等，說明了GSPE本身具有良好的抗氧化作用。此外，褪黑素[17]、鋅[18]和α-生育酚(維生素E)[19]等也有一定的緩解鎘引起的機體氧化損傷的作用，但日常生活中攝取的含量遠不能達到防治Cd致毒的效果。因此，探索Cd的致毒機制和有效的防御措施十分必要，而食源性GSPE是否對其有較好的緩解作用及其調節(jié)機制尚不清楚，值得進一步研究。

因此，本試驗選用海蘭雞胚作為試驗動物模型，使用一定劑量的Cd和適量GSPE，通過蘇木素-伊紅染色、生化檢測、TUNEL細胞凋亡染色以及熒光定量PCR等方法，檢測Cd對雞胚睪丸損傷的毒性機制，并探索GSPE的緩解效果。這些結果將有助于提高人們對生殖健康和重金屬Cd毒理學的認識，為緩解其毒性的進一步研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 主要儀器及試劑

儀器：輪轉式石蠟切片機(HM340E，MICROM，German)，石蠟組織包埋機(EC-350，MICROM，German)，Real-time PCR 擴增儀(ABI7500，USA)，電子天平(AB104-N，Mettler-toledo 公司)，激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus，Japan)，分光光度計(OD-1000,Thermo,USA)，旋轉孵化箱(Victoria SRL，Italy)，顯微鏡(Eclipse 80i，Nikon，Japan)。

試劑：氯化鎘(CdCl2，99.99%，C116344，Aladdin，中國)，原花青素(GSPE，純度≥ 95%，天津尖峰天然產物研究開發(fā)有限公司,中國)，反轉錄試劑盒(Thermo，Lithuania)，SYBR green RT-PCR kit(Takara，Japan)，DAPI(300 nM，Sigma Aldrich)，生化檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，TUNEL細胞凋亡試劑盒(A112-03，南京諾唯贊生物科技有限公司，中國)。

1.1.2 試驗動物及樣品采集

試驗雞胚：海蘭白雞種蛋(59.8±2.5) g,購自杭州市蛋雞試驗場)，在旋轉孵化箱中38.5 ℃和60%濕度的正常條件下孵化至所需的胚齡,在胚胎期第6.5 d(E6.5，即性腺分化后)注射0.05 mg·kg-1Cd或2.5 mg·kg-1GSPE，注射方法參照前人研究[18]，對照組注射0.9%的滅菌生理鹽水，即分為對照組、Cd組、GSPE組和GSPE+Cd組。出殼時統(tǒng)計孵化率和睪丸指數(shù)，并對發(fā)育至出現(xiàn)典型曲精細管、精原細胞分層排布于管腔的E17.5的睪丸進行形態(tài)學觀察、生化檢測、凋亡染色和熒光定量PCR檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 孵化率和睪丸指數(shù)

對剛出殼小雞進行孵化率的統(tǒng)計，同時，取材測睪丸指數(shù)(睪丸重/體重，mg·g-1)。

1.2.2 蘇木素-伊紅染色

4%中性多聚甲醛固定組織24 h，自來水緩慢沖洗過夜，70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯：酒精(1：1)和二甲苯透明、浸蠟2 h后即可包埋，制作厚度為5 μm的石蠟切片，40 ℃水浴展片，60 ℃烘干2 h，100%～70%逐級酒精脫蠟后，用蘇木素和伊紅染色，二甲苯透明之后即可封片，在光學顯微鏡下，進行對組織的切片拍照和形態(tài)學觀察分析。

1.2.3 生化指標的檢測

取新鮮睪丸組織0.1～0.2 g放置于預冷的玻璃勻漿管內，按重量體積1:9的比例加入預冷的0.9%生理鹽水，使用超聲勻漿器進行研磨，當細胞完全破碎后將勻漿吸出，于4 000 r·min-1離心15 min，取出上清用于各項生化指標的檢測，試劑盒檢測丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.2.4 TUNEL染色

石蠟切片置于二甲苯中15 min，酒精逐級浸水，PBS清洗3次，每張片子滴加100 μL終濃度為20 μg·mL-1的Proteinase K工作液，室溫孵育10 min。配制TUNEL檢測液：按比例，每個樣品分別取10 μL 5×Reaction Buffer,38 μL ddH2O，1 μL FITC-dUTP和1 μL TdT酶,混勻。在樣品上加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min；DAPI染核8 min，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照并統(tǒng)計TUNEL陽性細胞。

1.2.5 RNA提取、cDNA合成及熒光定量PCR

根據(jù)Trizol說明書，提取睪丸組織的總RNA，提取的RNA立即用于反轉錄以免降解。cDNA的合成：加入已純化的2 μg總RNA(具體體積根據(jù)測得的總RNA濃度計算)，1 μL Random引物，加水(nuclease-free)補足至12 μL，稍離心，于65 ℃反應5 min，之后，立即放置冰上冷卻5 min至室溫。然后，每孔加入5×緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mmol·L-1dNTP 混合物2 μL，反轉錄酶(200 U·μL-1)1 μL至20 μL體系，輕柔混勻離心，置于42 ℃，60 min溫育；70 ℃，5 min終止反應。熒光定量PCR的擴增：將cDNA模板稀釋20倍，反應體系為20 μL，即加入SYBR Premix Ex Taq (2X) 10.0 μL，PCR 上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye II(50x) 0.4 μL，DNA模板2.0 μL和ddH2O 6.8 μL。反應條件是95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s和 60 ℃ 34 s 40個循環(huán)，最后95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s終止反應。表1為試驗中所用引物序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SAS(9.0 版本)軟件進行方差分析和Duncan氏多重比較，用平均值±標準誤差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 原花青素和鎘對孵化率和睪丸指數(shù)的影響

與對照組相比，Cd處理組孵化率和睪丸指數(shù)(睪丸/體重)均顯著性降低(P<0.05)，GSPE聯(lián)合后，雞胚孵化率和睪丸指數(shù)有了明顯升高(P<0.05)，見表2。

表1 Real-time PCR 所用引物Table 1 Primers for real-time PCR analyses

注: 睪丸指數(shù)為睪丸重/體重(mg·g-1)，n=100，同列不同的字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Testis index is testis weight/body weight (mg·g-1),n=100,a,bvalues with different letters in the same column were statistically different ( P<0.05).

2.2 原花青素和鎘引起雞胚睪丸形態(tài)的變化

圖1顯示GSPE組和對照組睪丸細胞形態(tài)正常，然而Cd處理組睪丸生精上皮遭到一定的破壞，核發(fā)生固縮，染色質周緣化，間質出現(xiàn)空泡狀變化；但是，Cd +GSPE組從形態(tài)學上明顯緩解了Cd導致的睪丸組織損傷。

2.3 原花青素和鎘對睪丸氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響

與對照組相比，H2O2和MDA含量均在Cd處理組明顯升高 (P<0.05)，Cd處理組SOD活性和GSH含量都顯著降低 (P<0.05)；GSPE組與對照組沒有明顯的區(qū)別；然而，Cd + GSPE組與Cd處理組相比，明顯降低了MDA的含量 (P<0.05)，H2O2的含量也略有下降趨勢，但差異不顯著 (P>0.05)，同時，顯著提高了SOD活性和GSH含量 (P<0.05)，見表3。

2.4 原花青素和鎘對睪丸細胞凋亡的影響

圖2顯示，與對照組相比，鎘處理組TUNEL陽性細胞明顯增多(P<0.05)，GSPE聯(lián)合后，GSPE + Cd組與Cd處理組相比，TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，GSPE單獨處理組與對照組無顯著差別。

2.5 原花青素和鎘對細胞凋亡和內質網(wǎng)應激相關基因表達的影響

圖3為各組雞胚睪丸的凋亡相關基因Bcl-2和Caspase3，內質網(wǎng)應激相關基因HO-1和XBP-1 mRNA的相對表達量。與對照組相比，鎘處理組Bcl-2顯著性降低(P<0.05，圖3A)，Caspase3、HO-1和XBP-1 mRNA明顯升高(P<0.05,圖3B、3C和3D)。然而，與Cd處理組相比，GSPE + Cd組中Bcl-2顯著性升高(P<0.05)，同時，Caspase3、HO-1和XBP-1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

Cd作為現(xiàn)代工業(yè)和農業(yè)生產中危害較大的環(huán)境污染物之一，對人體和動物的健康造成嚴重威脅。有研究表明，Cd暴露能夠導致發(fā)育階段的胚胎生長緩慢或畸形[20]。Cd的劑量超過1微克/雞胚時，隨著劑量的增加孵化率顯著降低[18]。2 mg·kg-1Cd暴露的小鼠睪丸發(fā)育異常，睪丸重量明顯低于對照組[21]。本試驗結果顯示，Cd處理組雞胚孵化率和睪丸重量均顯著性下降，同時，聯(lián)合GSPE促進了睪丸組織的生長發(fā)育。形態(tài)學上，HE染色結果表明鎘引起了睪丸生殖上皮損傷，空泡化增多、細胞排列散亂等。GSPE + Cd組細胞形態(tài)與Cd處理組相比，趨于正常，生殖上皮較完整，細胞排列均勻，明顯緩解了Cd的致毒作用，這一結果與黨衛(wèi)紅[22]研究的水果蔬菜中抗氧化成分對Cd損傷的營養(yǎng)干預作用一致。可能的原因是，GSPE發(fā)揮了強有效的自由基清除功能，但GSPE的修復效果也會受到Cd的暴露劑量、毒性作用時間以及動物年齡等因素的影響。

表3 原花青素和鎘對雞胚睪丸氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響Table 3 Effects of GSPE and Cd on oxidation and antioxidant system in chicken testis

注: n=110，同列不同的字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: n=110,a,bvalues with different letters in the same column were statistically different ( P<0.05).

圖1 GSPE和Cd對睪丸形態(tài)學的影響 A:對照組，B: Cd組，C: GSPE組，D: Cd + GSPE組。

圖2 GSPE和Cd對睪丸細胞凋亡的影響

圖3 GSPE和Cd對睪丸細胞凋亡與內質網(wǎng)應激相關基因表達的影響 A: Bcl-2,B: Caspase3,C: HO-1,D: XBP-1

當內分泌干擾毒物進入機體后，往往引起自由基產生過多，組織內抗氧化體系耗竭，從而導致組織、器官損傷。為維護機體自身功能的正常運轉和健康狀態(tài)，體內有許多抗氧化物質如還原型GSH、維生素E、維生素C和各種抗氧化酶，如GSH-Px、SOD等，以抵抗各種活性氧和自由基產生的氧化損傷[4-7]。同時，MDA含量的測定，在一定程度上可以反映脂質過氧化損傷的程度，在外源性物質的刺激下，機體MDA和H2O2含量將會升高。本試驗結果顯示，Cd暴露導致了MDA和H2O2含量顯著升高，SOD的活性明顯降低，GSH含量也有一定的下降，繼而導致凋亡細胞的增多，這一結果與Malgorzata等[11]發(fā)現(xiàn)的鎘引起新生雛雞血清抗氧化水平的變化和Bu等[23]研究的鎘誘導小鼠睪丸損傷結果一致。然而，在聯(lián)合GSPE后，睪丸的抗氧化水平有了顯著的恢復，同時，鎘誘導的凋亡細胞數(shù)量也有了明顯減少。GSPE良好的緩解效果與另一種天然抗氧化產物槲皮素緩解Cd引起的睪丸損傷作用類似[23]。我們的研究結果表明，在本試驗Cd暴露的劑量下，GSPE有效緩解了Cd引起的雞胚睪丸氧化損傷和細胞凋亡。

內質網(wǎng)應激在機體氧化應激和細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露引起的氧化應激過程中，受到了內質網(wǎng)應激信號通路的調控[24]，同時，Ji等[25]發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸可通過抑制內質網(wǎng)應激，有效緩解了Cd誘導的睪丸生殖細胞凋亡。此外，內質網(wǎng)應激往往激活未折疊蛋白反應，其中XBP -1轉錄因子具有重要的調節(jié)作用。本試驗也發(fā)現(xiàn)在Cd暴露的雞胚睪丸組織中，細胞凋亡和內質網(wǎng)應激相關基因的表達變化密切相關，Cd處理組抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達明顯降低，促凋亡基因Caspase3 mRNA表達水平顯著升高；內質網(wǎng)應激XBP -1和HO -1 mRNA的表達水平同樣明顯升高。以上結果進一步表明，內質網(wǎng)應激在Cd導致的雞胚睪丸細胞凋亡的過程發(fā)揮著重要作用。而且，聯(lián)合GSPE后,GSPE +Cd組明顯緩解了Cd誘導的細胞凋亡和內質網(wǎng)應激。另外，研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸(維生素C)可以一定程度上緩解鎘引起的內質網(wǎng)應激和睪丸損傷[26]，這與本試驗結果類似。因此，GSPE可能通過XBP-1相關的內質網(wǎng)應激信號通路，發(fā)揮抗氧化的功能，緩解了氧化損傷,其具體作用機制還有待于進一步研究。

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◆

Ameliorative Effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Cadmium-induced Testicular Oxidative Damage in Chicken Embryos

Hou Fuyin,Mi Junpeng,Liu Xingting,Li Jian,Mi Yuling*,Zhang Caiqiao#

College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

9 March 2015 accepted 13 May 2015

This study was conducted to explore the ameliorative effect of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on cadmium (Cd)-induced testicular oxidative damage in chicken embryos.Embryos of 6.5 days (E6.5) were injected with or without Cd (0.05 mg·kg-1) in the presence or absence of GSPE (2.5 mg·kg-1),then the hatchability and testis index were made statistically.Additionally,testicular morphology,parameters related to oxidative damage,apoptosis and the expression of endoplasmic reticulum (ER) stress related genes (XBP-1 and HO-1) mRNA were all measured at E17.5.The results showed that Cd exposure significantly reduced the hatchability and testis index,with the lesions of testis characterized by karyopyknosis,vacuolation and chromatin margination,compared with the control group.Cd exposure resulted in increased H2O2and malondialdehyde level,reduced superoxide dismutase activity and glutathione level,enhanced apoptotic cells in the testis as well.Meanwhile,Cd exposure also down-regulated Bcl -2 mRNA level,up-regulated the expression of caspase3,XBP -1 and HO-1 mRNA.However,GSPE supplementation attenuated the Cd-induced oxidative damage,along with the increase of hatchability and testis index,the improvement of antioxidant level and ER stress,the marked decrease of apoptotic cells,and the testicular morphology tended to be normal.In conclusion,GSPE via the antioxidative ability could ameliorate the Cd-induced testicular reproductive toxicity in chicken embryos by decreasing the expression of XBP-1 related ER stress genes mRNA.

cadmium; chicken embryo; testis; oxidative damage; proanthocyanidin

教育部新世紀項目(NCET-13-0519)；國家自然科學基金項目(31001041，31472160)

侯福銀(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理與生殖內分泌學，E-mail: houfuyin2008@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yulingmi@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150309008

2015-03-09 錄用日期：2015-05-13

1673-5897(2015)4-138-08

X171.5

A

米玉玲(1975-)，女，副研究員，博士，博導，主要從事環(huán)境毒理學、動物生殖內分泌學方面的研究，發(fā)表學術論文40余篇。

侯福銀，宓君鵬，劉興廷,等.原花青素對鎘引起的雞胚睪丸氧化損傷的緩解作用[J].生態(tài)毒理學報，2015,10(4): 138-145

Hou F Y,Mi J P,Liu X T,et al.Ameliorative effect of grape seed proanthocyanidin extract on cadmium-induced testicular oxidative damage in chicken embryos [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 138-145 (in Chinese)

張才喬(1965-)，教授，博士，博導，主要從事卵泡發(fā)育和閉鎖調節(jié)、環(huán)境內分泌干擾物生殖毒理相關研究，發(fā)表學術論文100余篇。