二甲苯體外誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的表觀遺傳機(jī)制

曹香華 秦衛(wèi)松 徐忠秀 陳朝紅 鄭春霞 曾彩虹 劉志紅

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二甲苯體外誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的表觀遺傳機(jī)制

曹香華 秦衛(wèi)松 徐忠秀 陳朝紅 鄭春霞 曾彩虹 劉志紅

目的：研究二甲苯誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的特點(diǎn)及表觀遺傳機(jī)制。 方法：不同濃度的二甲苯分別作用于體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，通過ELISA法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)表達(dá)變化，流式技術(shù)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性。采用人甲基化450K芯片和焦磷酸測(cè)序?qū)Χ妆秸T導(dǎo)損傷的腎小管上皮細(xì)胞DNA 的CG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化篩選和驗(yàn)證。 結(jié)果：二甲苯誘導(dǎo)刺激后HK-2細(xì)胞NGAL表達(dá)增加，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性； 1.4 mmol/L二甲苯作用48h后培養(yǎng)上清中NGAL的值較對(duì)照組顯著增加[(4.52±0.49) pg/mlvs(2.30±0.11)pg/ml,P<0.01] 。隨加入二甲苯濃度的增加，HK-2細(xì)胞的凋亡比例和Caspase-3活性明顯增加。甲基化芯片分析結(jié)果顯示，二甲苯刺激后，HK-2細(xì)胞有243條探針甲基化出現(xiàn)顯著差異，其中109條探針顯示為甲基化水平增高，134條探針顯示為甲基化水平降低，共涉及到138個(gè)基因。其中，細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(如Bax、FAF1等)出現(xiàn)了明顯的甲基化改變， FAF1甲基化水平降低，Bax甲基化水平升高。焦磷酸測(cè)序的分析結(jié)果顯示，二甲苯刺激后Bax基因(92%)的甲基化水平與對(duì)照組(85%)相比出現(xiàn)7%的甲基化改變; FAF1基因的甲基化水平比對(duì)照組降低6%，其甲基化改變的趨勢(shì)與芯片結(jié)果相一致。 結(jié)論：二甲苯刺激可引起HK-2細(xì)胞的損傷和凋亡增加，Bax、 FAF1等凋亡相關(guān)基因的甲基化水平改變可能參與二甲苯對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

二甲苯 腎小管上皮細(xì)胞 凋亡 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 DNA甲基化

有機(jī)溶劑相關(guān)性腎病臨床表現(xiàn)典型的腎病綜合征，同時(shí)伴嚴(yán)重小管損害，免疫抑制劑治療無效，臨床找不到明確病因，在詢問病史時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些患者在發(fā)病前均有明確有機(jī)溶劑接觸史[1]。有機(jī)溶劑相關(guān)性腎病的病理表現(xiàn)多樣，包括腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、細(xì)胞變性、壞死或脫落，足細(xì)胞足突融合、足細(xì)胞腫脹、空泡變性甚至壞死[2-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)大鼠吸入有機(jī)溶劑后可出現(xiàn)明確的腎臟損傷[6]。

有機(jī)溶劑本質(zhì)上屬于碳?xì)浠衔?，是指脂肪族、脂環(huán)族、芳香族、鹵族及氧化碳?xì)浠衔?、乙烯醇類及用于多種工業(yè)加工和家庭使用的碳?xì)浠衔?。有機(jī)溶劑主要來源于工作環(huán)境和家庭裝修，種類繁多。二甲苯常作為溶劑廣泛用于涂料、樹脂、染料、油墨等行業(yè)；作為合成單體或溶劑用于醫(yī)藥、炸藥、農(nóng)藥等行業(yè)。由于國(guó)家對(duì)油漆等材料中苯的含量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，因此近年來油漆等有機(jī)溶劑的污染主要以二甲苯超標(biāo)為主。目前關(guān)于二甲苯與腎臟疾病的相關(guān)研究還較少，對(duì)于有機(jī)溶劑導(dǎo)致腎臟損傷機(jī)制尚不清楚，近年研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機(jī)制在有機(jī)溶劑導(dǎo)致的疾病中發(fā)揮重要作用。本研究通過建立二甲苯誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型，觀察二甲苯誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷后的細(xì)胞表型改變，并對(duì)其損傷機(jī)制進(jìn)行探討。

材料和方法

材料

二甲苯 購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司，分析純；實(shí)驗(yàn)用二甲苯需新鮮配制，將二甲苯溶于DMSO并避光保存，DMSO終濃度不超過1%。

細(xì)胞 人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)購(gòu)自ATCC(CRL-2190TM)，培養(yǎng)基為DMEM/F12，含10%FBS，培養(yǎng)于37℃，5% CO2。

試劑和抗體 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程技術(shù)研究所，NGAL ELISA試劑盒購(gòu)自Antibody公司， Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自Biouniquer公司，caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)與處理 將腎小管上皮細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶和96孔板，待其長(zhǎng)至80%融合后，分別予以不同濃度二甲苯處理6、12、24、48h，每隔12h更換含有二甲苯的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)正常對(duì)照組：用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)陰性對(duì)照組：以不含二甲苯，含1% DMSO的完全培養(yǎng)基處理；(3)二甲苯處理組：培養(yǎng)基中二甲苯的濃度分別為1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L、2.0 mmol/L。

ELISA 將細(xì)胞接種于96孔板，貼壁后給予1%DMSO和1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L二甲苯處理6h、12h、24h、48h，通過ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)濃度，實(shí)驗(yàn)步驟參照Antibodyshop公司ELISA試劑盒說明書。

流式細(xì)胞儀分析腎小管上皮細(xì)胞凋亡 腎小管上皮細(xì)胞分組處理后經(jīng)0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，參照Annexin V-FITC試劑盒說明書處理細(xì)胞，使用兩種熒光染料，分別為Annexin V-FITC(5 μl，避光，染色15～20 min)和碘化丙啶(PI，5 μl,置于冰上染色15～20 min)。

Caspase-3活性檢測(cè) 腎小管上皮細(xì)胞分組處理后經(jīng)0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，具體步驟參照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書。

細(xì)胞DNA提取 腎小管上皮細(xì)胞，分組處理后經(jīng)0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞DNA提取的具體步驟參照QIAamp DNA Mini Kit說明書。

甲基化450K芯片 使用HumanMetylation450K，V1.0芯片掃描儀配套Illumina的genomestudio軟件分析數(shù)據(jù)。首先通過芯片圖像分析軟件對(duì)芯片灰度掃描圖進(jìn)行分析，可以得到芯片上每個(gè)基因點(diǎn)的原始信號(hào)值，即所有有效重復(fù)點(diǎn)的前景信號(hào)值減去背景信號(hào)值的平均信號(hào)值(Average Beta),Detection P value,Diffscore值等。根據(jù)這些參數(shù)值進(jìn)行后續(xù)的數(shù)值分析。 差異甲基化基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)組樣本Diffscore值<-13或>13；且Delta Beta>0.1或<-0.1，即為差異甲基化基因。Delta Beta值為control 與case組Average Beta相差的結(jié)果，即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在每個(gè)位點(diǎn)的甲基化的差異程度。

焦磷酸測(cè)序 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：(1)DNA模板的制備：從細(xì)胞中抽提基因組DNA，按照碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒(編號(hào)：D0063)說明書操作；(2)亞硫酸氫鹽處理：亞硫酸氫鹽處理樣本DNA采用Qiagen公司的EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，樣本的起始量為1 μg；(3)PCR擴(kuò)增：用ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增；(4)PCR引物序列:FAF1-F:GAAAGGTTTATAGTTAAGAAAGTAGTTAT，F(xiàn)AF1-R:Biotin-TAATTACTAATACCACCTTCTCATTCC；BAX-F:TTGGAGTGTAGTAGTGATTATAGTT，BAX-R:Biotin-CCAAAAAAAAATATCCCTCCCTATTAAA；FAF1測(cè)序引物： TTTTTTGTTTTTAAAAGTATTGTA，BAX測(cè)序引物序列：CCCTATTAAAAACCAACCT。熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件(PCR試劑來自TakaRa)：總反應(yīng)體系為40 μl，包括10×PCR buffer 4μl，dNTP(10mM) 0.8 μl，上下游引物各(10 μmol/L)0.8 μl，QIAGEN hotstart Taq 0.5 μl(2.5U)，用ddH2O補(bǔ)足至40 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；50個(gè)循環(huán)(95℃ 15 sec；52℃ 30 sec；72℃ 30 sec)；72℃ 5 min。亞硫酸氫鹽處理樣本2 μl。(5)Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序：采用焦磷酸測(cè)序儀配套的單鏈DNA分離裝置從40 μl PCR反應(yīng)液中分離單鏈DNA；對(duì)分離出來的單鏈DNA進(jìn)行焦磷酸測(cè)序(測(cè)序儀型號(hào)PyroMark ID，Qiagen，試劑名稱：PyroMark Gold Q96 Reagent，Qiagen)；采用焦磷酸測(cè)序儀配套的分析軟件進(jìn)行甲基化結(jié)果分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，采用 2-ΔΔCT法處理甲基化芯片得到的數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

二甲苯誘導(dǎo)人HK-2細(xì)胞的損傷 在培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中加入不同濃度二甲苯(1.0、1.4、1.8 mmol/L)，以1%DMSO為陰性對(duì)照組，檢測(cè)培養(yǎng)液上清中NGAL的表達(dá)，考察二甲苯對(duì)HK-2細(xì)胞的損傷作用。發(fā)現(xiàn)隨著二甲苯濃度的增加，細(xì)胞分泌NGAL明顯增加，1.8 mmol/L(P<0.01)刺激組在刺激24h后可見到NGAL表達(dá)顯著增加(圖1)。隨著二甲苯處理時(shí)間的延長(zhǎng)，刺激48h后HK-2細(xì)胞的損傷作用明顯，用二甲苯處理24h(P<0.01)和48h(P<0.01)后HK-2細(xì)胞分泌NGAL明顯增加(圖1)。

圖1 二甲苯對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞分泌NGAL的影響NGAL：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；*：與DMSO對(duì)照組比較，P<0.01

二甲苯誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞凋亡增加 在培養(yǎng)的HK2細(xì)胞中加入不同濃度二甲苯培養(yǎng)48h后，檢測(cè)二甲苯誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞的凋亡比例，考察二甲苯對(duì)HK-2細(xì)胞的凋亡作用。發(fā)現(xiàn)隨著二甲苯濃度的增加，HK-2細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加，在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L之間細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯升高，2.0 mmol/L濃度的二甲苯引起近98%的細(xì)胞凋亡(圖2A、B)。用含不同濃度二甲苯(1.0 mmol/L、1.4 mmol/L、1.8 mmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，48h后可觀察到隨著二甲苯濃度的增高，HK-2細(xì)胞的Caspase-3活性也相應(yīng)增加(圖2C)。

人HK-2細(xì)胞經(jīng)二甲苯刺激后DNA甲基化譜的改變 Illumina Human甲基化450K芯片能夠覆蓋約450 000多個(gè)甲基化位點(diǎn)，HK-2細(xì)胞經(jīng)二甲苯刺激后用450K芯片分析發(fā)現(xiàn)，有243條探針甲基化出現(xiàn)差異，其中109條探針顯示為甲基化水平增高，134條探針顯示為甲基化水平降低。與1%DMSO對(duì)照組相比，二甲苯刺激組共有138個(gè)基因發(fā)生明顯的甲基化改變。差異甲基化基因的功能分析結(jié)果提示，二甲苯刺激組DNA甲基化差異主要集中在細(xì)胞組成、凋亡相關(guān)以及細(xì)胞周期蛋白和生物功能等相關(guān)基因。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的有3個(gè)基因(表1)，其中BAX出現(xiàn)甲基化水平升高，F(xiàn)AF1出現(xiàn)甲基化水平降低。

圖2 二甲苯誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的凋亡A：不同濃度二甲苯刺激48h后HK-2細(xì)胞凋亡情況(A1：正常對(duì)照組；A2：DMSO對(duì)照組；A3：1.0 mmol/L二甲苯組；A4：1.4 mmol/L二甲苯組；A5：1.8 mmol/L二甲苯組)；B：1.8 mmol/L二甲苯刺激48h后HK-2細(xì)胞凋亡的數(shù)目；C：不同濃度刺激后Caspase-3活性檢測(cè);#：與DMSO對(duì)照組比較，P<0.001

凋亡基因染色體上的位置家族在HK-2細(xì)胞中的功能DiffscoreDeltaBetaBetavalue甲基化水平FAF1Fas-FasL途徑凋亡相關(guān)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡-19.373-0.1780.386低甲基化Baxchr9:96713326-96718186Bax/Bcl2凋亡相關(guān)蛋白抑制細(xì)胞凋亡19.3470.1120.182高甲基化

Delta Beta：二甲苯實(shí)驗(yàn)組與1%DMSO對(duì)照組在每個(gè)位點(diǎn)的甲基化的差異程度,負(fù)值表示與對(duì)照組相比為低甲基化位點(diǎn)，正值為高甲基化位點(diǎn)；Beta value：甲基化改變的比例，其值在0(完全未甲基化)和1(完全甲基化)之間不斷變化

焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證HK-2細(xì)胞經(jīng)二甲苯刺激后凋亡相關(guān)基因甲基化改變 焦磷酸測(cè)序的分析結(jié)果顯示，二甲苯刺激后Bax基因(92%)(圖3A)的甲基化水平與對(duì)照組(85%)(圖3B)相比出現(xiàn)7%的甲基化改變；FAF1基因的甲基化水平比對(duì)照組降低了6%(圖3C～E)。

討 論

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科每年收治數(shù)十例因接觸有機(jī)溶劑引起的腎臟疾病，這些患者均以水腫、大量蛋白尿起病。腎活檢病理觀察顯示腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞存在嚴(yán)重?fù)p傷，其致病機(jī)制到目前為止并不十分清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)大鼠吸入有機(jī)溶劑后可出現(xiàn)明確的腎臟損傷[6]。

有機(jī)溶劑廣泛存在于工作環(huán)境和新裝修的居住環(huán)境中，種類繁多，本研究中，我們選擇二甲苯開展實(shí)驗(yàn)研究。二甲苯常作為溶劑廣泛用于涂料、樹脂、染料、油墨等行業(yè)；作為合成單體或溶劑用于醫(yī)藥、炸藥、農(nóng)藥等行業(yè)。有機(jī)溶劑的損傷機(jī)制至今仍不十分清楚，有學(xué)者報(bào)道稱，有機(jī)溶劑可通過介導(dǎo)免疫反應(yīng)導(dǎo)致腎組織損傷[7]；也有研究者認(rèn)為，有機(jī)溶劑可對(duì)腎小管產(chǎn)生直接毒性作用[8]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑等環(huán)境因素可通過改變表觀遺傳修飾導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡損傷和疾病的發(fā)生。例如有研究報(bào)道，孕婦接觸多環(huán)芳香類有機(jī)溶劑可以導(dǎo)致臍血細(xì)胞基因組的DNA整體甲基化水平的增加[9]。Chen等[10]研究也證實(shí)，有機(jī)溶劑能通過氧化應(yīng)激作用引起細(xì)胞DNA斷裂。2011年3月，在美國(guó)召開了首屆環(huán)境表觀遺傳學(xué)國(guó)際大會(huì)[11]，探討了環(huán)境因素的表觀遺傳效應(yīng)、對(duì)基因表達(dá)的影響，以及與腫瘤、衰老、免疫疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的關(guān)系[12,13]。

NGAL是一種25 kD的蛋白，與中性粒細(xì)胞明膠酶共價(jià)結(jié)合，它通過改善細(xì)胞內(nèi)輔酶鐵的代謝來調(diào)節(jié)多種參與細(xì)胞生命重要蛋白質(zhì)的合成[14,15]。NGAL主要表達(dá)于腎臟近曲小管上皮細(xì)胞，但也存在于遠(yuǎn)側(cè)腎單位[16]，這提示NGAL與腎臟中腎小管關(guān)系密切，本研究通過檢測(cè)體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中NGAL濃度來判斷有機(jī)溶劑二甲苯能否導(dǎo)致腎小管損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著二甲苯濃度的增加，細(xì)胞分泌NGAL明顯增加，對(duì)HK-2細(xì)胞的損傷也較嚴(yán)重。隨著二甲苯處理時(shí)間的延長(zhǎng)，刺激24h和48h后HK-2細(xì)胞分泌NGAL明顯增加，尤以刺激48h后HK-2細(xì)胞的損傷較為顯著。

環(huán)境暴露導(dǎo)致的腎臟疾病可能與腎小管上皮細(xì)胞的增殖與凋亡之間的失衡有關(guān)，本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了二甲苯刺激后HK-2細(xì)胞的凋亡數(shù)目增加，這種增加與二甲苯濃度成正相關(guān)，隨著二甲苯濃度的增加，HK-2細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加，尤其在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L之間細(xì)胞凋亡數(shù)目升高明顯，2.0 mmol/L濃度的二甲苯引起近98%的細(xì)胞凋亡。Caspase-3的活化是凋亡發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)一旦激活，意味著凋亡的發(fā)生不可避免，本研究通過檢測(cè)二甲苯刺激后HK-2細(xì)胞Caspase-3活性，進(jìn)一步證實(shí)了二甲苯刺激可以導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡。

到目前為止，關(guān)于有機(jī)溶劑是否可通過DNA甲基化的改變導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)生的研究還很少。本研究中我們采用人類甲基化450K BeadChip芯片，該芯片可檢測(cè)人全基因組45萬個(gè)甲基化位點(diǎn)，全面覆蓋了96%的CpG島，還有CpG島以外的CpG位點(diǎn)、人類干細(xì)胞非CpG甲基化位點(diǎn)、正常組織與腫瘤(多種癌癥)組織差異甲基化位點(diǎn)、編碼區(qū)以外的CpG島、miRNA啟動(dòng)子區(qū)域和已通過GWAS的疾病相關(guān)區(qū)域的位點(diǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)采用該芯片，首次從基因組范圍對(duì)二甲苯誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的DNA甲基化水平進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示與1%DMSO對(duì)照組相比，二甲苯刺激組腎小管上皮細(xì)胞共有138個(gè)基因的DNA甲基化水平發(fā)生改變，其涉及細(xì)胞組成、凋亡相關(guān)以及細(xì)胞周期蛋白類和生物功能等多個(gè)功能，我們推測(cè)二甲苯刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡增加的原因可能是關(guān)鍵凋亡基因的DNA發(fā)生甲基化改變介導(dǎo)的。

促凋亡的相關(guān)基因Bcl-2/Bax、caspase-3、Fas/Fasl在腎間質(zhì)疾病中起著重要的作用，F(xiàn)as/Fasl在腎小管上皮細(xì)胞的高度表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)Bcl-2與Bax比值失調(diào)、Caspase-3活性增加均與凋亡發(fā)生有關(guān)。通過分析甲基化450K芯片結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因(如Bax、FAF1等)出現(xiàn)了明顯的甲基化改變，其中FAF1甲基化水平降低，Bax甲基化水平升高。焦磷酸測(cè)序的驗(yàn)證結(jié)果顯示，與1%DMSO對(duì)照組相比，二甲苯刺激組Bax基因甲基化增高，而FAF1基因甲基化的降低。FAF1是Fas-FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的凋亡信號(hào)分子，屬于腫瘤壞死家族受體的一員，當(dāng)Fas配體與抗Fas抗體結(jié)合后，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。FAF1可以直接作用于真核生物或哺乳動(dòng)物正?；蛲蛔兗?xì)胞Fas基因的胞漿區(qū)域，F(xiàn)AF1是調(diào)控凋亡發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，能夠通過Fas促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，二甲苯刺激可導(dǎo)致FAF1基因甲基化水平降低，推測(cè)其甲基化水平改變可能介導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的作用增加。Bax屬于BCL-2凋亡調(diào)控的家族成員，定位于線粒體水平中不可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損害的上游，物理射線、化療藥物和其他形式的毒物吸收會(huì)導(dǎo)致Bax的表達(dá)大量增加，在細(xì)胞的存亡中起著至關(guān)重要的作用。Bax以單體的形式存在于胞質(zhì)或細(xì)胞膜中，受到凋亡的信號(hào)刺激，胞質(zhì)中的Bax單體轉(zhuǎn)錄到線粒體中變成整合的膜蛋白、二聚體或低聚物，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-21]。本研究的結(jié)果顯示二甲苯刺激可導(dǎo)致Bax甲基化水平升高，從而抑制基因的表達(dá)，導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡通路的活化，Caspase-3活性增加，細(xì)胞凋亡增加。

本研究通過檢測(cè)代表腎小管損傷的標(biāo)志物NGAL的表達(dá)情況，證實(shí)了二甲苯刺激可以導(dǎo)致HK-2細(xì)胞的損傷， HK-2細(xì)胞的凋亡明顯增加，芯片結(jié)果也顯示二甲苯刺激組與1%DMSO對(duì)照組相比，出現(xiàn)了凋亡基因Bax和FAF1明顯的甲基化改變，我們推測(cè)二甲苯刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞凋亡增加的原因可能是關(guān)鍵凋亡基因的DNA發(fā)生甲基化改變介導(dǎo)的,其機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

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(本文編輯 逸 沐)

Epigenetic mechanisms of xylene-induced renal tubular epithelial cell injury

CAOXianghua,QINWeisong,XUZhongxiu,CHENZhaohong,ZHENGChunxia,ZENGCaihong,LIUZhihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

LIUZhihong(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective：To investigate the characteristics of proximal tubule epithelial cells injury and the epigenetic mechanism of the injury induced by organic solvents. Methodology：Human proximal tubule epithelial cells were treated with different concentrations of xylene. The NGAL in the culture medium was measured by ELISA, the apoptosis of tubular cells was detected by flow cytometry and the Caspase-3 activity was detected by kit. The Illumina Infinium Human Methylation 450 (450K) Bead Chips were used to detect the methylation changes in HK-2 cells after xylene treatment. The data of Illumina chips were validated by pyro-sequencing method. Results：The secretion of NGAL was increased in dose-and time-dependent manner after xylene treatment. The NGAL was increased significantly [(4.52±0.49) pg/mlvs(2.30±0.11) pg/ml,P<0.01] after 48 h treatment with 1.4 mmol/L xylene. At the same time, with increasing concentrations of xylene, the ratio of HK-2 cells apoptosis and Caspase-3 activity was significantly increased. Xylene treatment induced DNA methylation changes, indicating by 243 probes in HK-2 cells after xylene stimulation, with 109 probes displayed increased levels of methylation and 134 probes showed reduced levels of methylation. The methylation changes of 138 genes were indicated by these probes, including apoptosis related gene, e.g. Bax, FAF1, etc. The DNA methylation of FAF1 was decreased while the DNA methylation of BAX was increased. The pyrosequencing assays showed that Bax gene methylation level changes of xylene stimulation group was 7% compared to control group, and FAF1 gene was 6%, its methylation change trend was consistent with the results of the chip. Conclusion：Xylene stimulation can cause HK-2 cells injury and increased apoptosis. The changes of DNA methylation level of Bax, FAF1 might involve in xylene induced injury.

Xylene tubular epithelial cell apoptosis NGAL DNA methylation

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃[973計(jì)劃(2012CB517600)(2012CB517605)]；國(guó)家自然科學(xué)基金(81270811)

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科 博士研究生(曹香華)，國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

劉志紅(E-mail:liuzhihong@nju.edu.cn)

2014-01-20

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有