過氧化氫通過上調(diào)高遷移率族蛋白損傷心肌的實驗研究

馬瑞松，李元紅，周曉亞，江洪，胡笑容

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論著·基礎(chǔ)

過氧化氫通過上調(diào)高遷移率族蛋白損傷心肌的實驗研究

馬瑞松，李元紅，周曉亞，江洪，胡笑容

目的 探討過氧化氫(H2O2)通過高遷移率族蛋白(HMGB1)介導(dǎo)對心肌損傷的作用機(jī)制。方法 胎鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)后，分為4組：對照組，H2O2不同濃度組(100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L)，H2O2(200 μmol/L)+乙酰半胱氨酸(NAC，200 μmol/L)組，H2O2(200 μmol/L)+HMGB1抗體(20 μg/ml)組。檢測心肌細(xì)胞活性、凋亡率、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)、HMGB1表達(dá)。結(jié)果 (1)細(xì)胞活性:與對照組比較，心肌細(xì)胞活性隨著H2O2濃度的增加而降低(t=-5.81，-9.59，-14.21，P均<0.05)；NAC和HMGB1抗體可以明顯減弱H2O2(200 μmol/L)對細(xì)胞活性的抑制作用(t=-2.98，-3.03,P<均0.05)。(2)LDH和CK的表達(dá)水平：與對照組比較，LDH和CK的表達(dá)量隨著H2O2的濃度增加而增加(tLDH=9.78，15.37，18.13，tCK=11.29，20.35，26.17，P均<0.05)。與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以抑制LDH和CK的表達(dá)(tLDH=-4.91,-4.22,tCK=-4.17,3.29，P均<0.05)。(3)MDA表達(dá)和SOD活性：H2O2(100，200，500 μmol/L)可以抑制心肌細(xì)胞SOD活性，增加MDA表達(dá)(tSOD=-4.16，-6.59，-10.76，tMDA=3.98，5.16，9.47，P均<0.05)；與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以拮抗H2O2對SOD和MDA的影響(tLDH=-4.91,-4.22,tCK=-4.17，3.29，P均<0.05)。(4) HMGB1的表達(dá)：與對照組比較，H2O2(100，200，500 μmol/L)可明顯增加心肌中HMGB1的表達(dá)(t=12.94，21.08，25.81，P均<0.05)，與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC+ H2O2和HMGB1-Ab+ H2O2中HMGB1的表達(dá)明顯降低(t=-10.24，-8.09，P均<0.05)。(5)心肌凋亡：與對照組比較， H2O2組(100、200、500 μmol/L)心肌凋亡率明顯增加(t=7.52，13.06，16.61，P<0.05)；NAC+H2O2組和HMGB1+H2O2組心肌凋亡率較H2O2(200 μmol/L)組明顯增加(t=-4.89，-4.23，P<0.05)。結(jié)論 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以通過上調(diào)HMGB1表達(dá)，損傷心肌。

過氧化氫；高遷移率組蛋白；心肌損傷；胎鼠

心肌缺血再灌注或缺氧再復(fù)氧能夠?qū)е聶C(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞釋放大量活性氧(ROS)和促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IFN-γ等)。心肌中活性氧生成的關(guān)鍵酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶和黃嘌呤氧化酶[1]，乙酰半胱氨酸(NAC)可以降低NADPH氧化酶的活性，減少ROS的生成[2]。心肌細(xì)胞中ROS能夠引起氧化應(yīng)激及氧化損傷，過氧化氫(H2O2)作為一種常見的活性氧也參與了其中。氧化應(yīng)激參與了心血管系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括心肌缺血再灌注損傷，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。

高遷移率族蛋白(High mobility group protein，HMGB1)是一種非組織核蛋白，由激活的免疫細(xì)胞或壞死細(xì)胞釋放，作為促炎因子可加重心肌缺血再灌注損傷[3，4]。2002年Scafidi等[5]在研究中提出HMGB1是壞死和凋亡細(xì)胞是否發(fā)生炎性反應(yīng)的關(guān)鍵信號。Tsung等[6]在肝臟I/R模型中發(fā)現(xiàn)，ROS可能參與了HMGB1的產(chǎn)生和釋放，肝細(xì)胞在過氧化氫作用下HMGB1表達(dá)明顯增加，而加入了抗氧化劑后可以顯著抑制HMGB1的釋放。據(jù)此我們推測在心臟I/R中，HMGB1可能參與了氧化應(yīng)激對心肌的損傷。本文觀察HMGB1在心肌缺血缺氧時的表達(dá)機(jī)制，為預(yù)防各種心肌缺血后氧化應(yīng)激炎性反應(yīng)提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從胎鼠心臟分離心肌細(xì)胞[7]。迅速將離體心臟剪碎、消化和漂洗。心肌細(xì)胞以1.0×106/ml的濃度溶于含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素(100 U/ml)，1%鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM液中。在5%CO2高濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4 d。

1.2 實驗分組 將培養(yǎng)細(xì)胞分為如下4組：(1)對照組，只加入含15%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基；(2)H2O2不同濃度組，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，加入過氧化氫濃度分別為低100 μmol/L、中200 μmol/L、高500 μmol/L；(3)H2O2+NAC組，先以NAC(200 μmol/L)預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，后加入H2O2(200 μmol/L)共同孵育24 h；(4)H2O2+HMGB1抗體組，用HMGB1抗體16(IBL，德國，20 μg/ml)預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min，后加入H2O2(200 μmol/L)共同孵育24 h。

1.3 測定項目 (1)細(xì)胞活性：心肌細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整濃度至1×105/ml培養(yǎng)4 d后，用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK-8，Dojindo，日本)測定細(xì)胞活性。按照試劑盒說明規(guī)范操作。選擇波長490 nm，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。細(xì)胞活性以測試組平均吸光度值/對照組平均吸光度值×100%表示。(2)酶類氧化指標(biāo)測定：乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)，測定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK的含量反映細(xì)胞損傷程度。選用南京建成生物實驗研究所的LDH和CK的ELISA試劑盒，根據(jù)說明規(guī)范操作。測定超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)表達(dá)，反映了氧化應(yīng)激損傷的程度。選用南京建成生物實驗研究所的試劑盒測定，根據(jù)說明規(guī)范操作。(3)免疫印跡法測定HMGB1的表達(dá)量：按文獻(xiàn)[8]方法測定培養(yǎng)細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)量，以HMGB1與GADPH的比值反映HMGB1的表達(dá)量。(4)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡： 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。分離培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS漂洗后懸浮于500 μl結(jié)合緩沖液，然后加入5 μl的Annexin V和5μl的PI，流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V為藍(lán)色熒光，PI為紅色熒光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗，多組間采用單因素方差分析或Welch檢測，組間兩兩比較用Dunnett T3檢測。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞活性 與對照組比較，隨著H2O2濃度的增加心肌細(xì)胞活性降低(t=-5.81、-9.59、-14.21，P均<0.05)；NAC和HMGB1抗體可以明顯減弱H2O2(200 μmol/L)對細(xì)胞活性的抑制作用(t=-2.98，-3.03,P<均0.05)；而NAC+ H2O2(200 μmol/L)和HMGB1抗體+ H2O2(200 μmol/L)組間無統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.09,P>0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

2.2 LDH、CK的表達(dá)水平及SOD、MDA表達(dá) 與對照組比較，隨著H2O2的濃度增加LDH和CK的表達(dá)量增加(tLDH=9.78、15.37、18.13，tCK=11.29、20.35、26.17，P均<0.05)。與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以抑制LDH和CK的表達(dá)(tLDH=-4.91、-4.22,tCK=-4.17、3.29，P均<0.05)。見圖2。

MDA表達(dá)和SOD活性：H2O2(100、200、500 μmol/L)可以抑制心肌細(xì)胞SOD活性，增加MDA表達(dá)(tSOD=-4.16、-6.59、-10.76，tMDA=3.98、5.16、9.47，P均<0.05)；與H2O2(200μmol/L)組比，NAC和HMGB1抗體可以拮抗H2O2對SOD和MDA的影響(tLDH=-4.91、-4.22,tCK=-4.17、3.29、P均<0.05)，見圖3。

2.3 HMGB1的表達(dá) 與對照組比較，H2O2(100、200、500 μmol/L)可明顯增加心肌中HMGB1的表達(dá)(t=12.94、21.08、25.81，P均<0.05)，與H2O2(200 μmol/L)組比，NAC+ H2O2和HMGB1-Ab+ H2O2中HMGB1的表達(dá)明顯降低(t=-10.24、-8.09，P均<0.05)。見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

2.4 心肌凋亡 與對照組比較，H2O2組(100、200、500 μmol/L)心肌凋亡率明顯增加(χ2=7.52、13.06、16.61，P<0.05)；NAC+ H2O2和HMGB1+ H2O2組心肌凋亡率較H2O2(200 μmol/L)組明顯增加(χ2=-4.89、-4.23，P<0.05)。見圖5。

3 討 論

本文發(fā)現(xiàn):(1)H2O2作為一種活性氧，可以抑制心肌細(xì)胞活性，增加LDH和CK的表達(dá)，且呈劑量依賴性。同時，H2O2還可以抑制SOD活性，增加MDA表達(dá)；(2)H2O2可以促進(jìn)HMGB1的表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴型；(3)NAC-NADPH氧化酶抑制劑，可以拮抗H2O2的作用，增加心肌細(xì)胞活性、抑制HMGB1表達(dá)，以及減少心肌凋亡率，這就提示我們抗氧化劑在對抗ROS侵襲的過程中也許能夠通過抑制HMGB1的釋放來減輕心肌細(xì)胞的損傷；(4)HMGB1抗體可以通過抑制HMGB1表達(dá)保護(hù)心肌，可以減弱H2O2的細(xì)胞損傷和促凋亡作用。

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

注：與對照組比較，aP<0.05；與H2O2(200 μmol/L)組比較，bP<0.05

心肌缺血再灌注可以通過線粒體途徑以及激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞引起ROS過度產(chǎn)生，從而加重心肌I/R損傷，外源性活性氧(如H2O2)同內(nèi)源性ROS一樣可以加重心肌I/R損傷。有研究已證實，ROS引起細(xì)胞損傷主要與脂質(zhì)過氧化、促細(xì)胞凋亡和鈣超載有關(guān)[9]，而鈣超載主要是由于脂質(zhì)過氧化引起生物膜破壞和肌漿網(wǎng)鈣泵功能破壞所致，故可理解為脂質(zhì)過氧化的繼發(fā)損害。脂質(zhì)過氧化可以引起細(xì)胞膜以及細(xì)胞器膜流動性改變，破壞膜酶和離子通道的微環(huán)境，損壞呼吸鏈，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。SOD是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中關(guān)鍵酶，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，CK和LDH是心肌損傷標(biāo)記物，H2O2抑制SOD活性，增加MDA、CK和LDH的表達(dá)，印證了脂質(zhì)過氧化損傷的結(jié)論，但同時本研究發(fā)現(xiàn)，NAC和HMGB1抗體可一定程度地增加SOD活性，減少MDA、CK和LDH的表達(dá)，即減弱H2O2的脂質(zhì)過氧化和心肌損傷作用。ROS可通過直接損傷細(xì)胞DNA、影響線粒體信號通路以及激活核因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可明增加心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，且呈劑量依賴型，而NAC和HMGB1抗體可降低心肌凋亡指數(shù)，即減弱H2O2的促細(xì)胞凋亡作用。另外，本結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1表達(dá)量的增高程度與氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞的損傷程度呈正相關(guān)。有研究已證實，HMGB1作為促炎因子，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)加重心肌缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴型[10～12]。而HMGB1是一種非組織核蛋白，當(dāng)細(xì)胞壞死時被釋放出來，可進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。2002年Scaffidi等[5]證實，缺失了HMGB1壞死細(xì)胞將不能誘導(dǎo)促炎因子的釋放。這些結(jié)果均提示，由ROS誘導(dǎo)的損傷和壞死心肌細(xì)胞可以釋放HMGB1，而HMGB1可進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞的炎性反應(yīng)和凋亡。由此可以推斷，HMGB1參與了H2O2引起的心肌損傷作用。

HMGB1引起心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制，目前主流研究認(rèn)為，HMGB1是一種新型的促炎因子，參與了心肌I/R損傷，同時還可以促進(jìn)其他炎性因子的表達(dá)，如TNF-α、IL-6；當(dāng)抑制HMGB1的表達(dá)時，會減少TNF-α、IL-6的表達(dá)且減輕心肌I/R損傷[13]。近期Zhu等[10]的研究證實了HMGB1-TLR4-IL-23-IL-17A軸可以通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、中性粒細(xì)胞聚集加重心肌I/R損傷。Xiong等[14]的研究證明抑制HMGB1的表達(dá)可以減輕心肌I/R損傷的結(jié)論。心肌細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的一個重要的病理生理過程。Hu等[12]的研究進(jìn)一步證明，在心肌I/R中，HMGB1可以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。

研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以激活炎性反應(yīng)通路NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)進(jìn)而調(diào)控下游炎性因子TNF-α、IL-6等誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[6，15～17]。HMGB1既可以調(diào)控炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，也參與了心肌細(xì)胞凋亡過程，這可能是HMGB1參與H2O2心肌損傷作用的機(jī)制，但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

ROS與HMGB1的關(guān)系前期已有相關(guān)研究。Marshall等[18]證實，H2O2可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的胎鼠心肌細(xì)胞釋放HMGB1；米諾環(huán)素和丙酮酸乙酯可以通過抑制HMGB1表達(dá)減弱ROS對心肌I/R的損傷[19，20]。另外，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中ROS可以明顯增加細(xì)胞外HMGB1的活性進(jìn)而激活白細(xì)胞加重炎性反應(yīng)[21]；在肺組織中，ROS可以誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞HMGB1的移位和釋放[22]；而HMGB1抗體可明顯減弱ROS性引起的肺組織炎性反應(yīng)和急性肺損傷[23]。同時，本實驗發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC可以抑制H2O2誘導(dǎo)的HMGB1高表達(dá)，HMGB1抗體可以通過抑制HMGB1，減弱H2O2對心肌細(xì)胞損傷作用，進(jìn)一步印證了上述結(jié)論。

綜上，我們可以推斷：H2O2可以通過上調(diào)HMGB1的表達(dá)增加心肌缺血再灌注損傷。但關(guān)于ROS對HMGB1的調(diào)控作用和促心肌損傷作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本文為臨床上預(yù)防或減弱ROS導(dǎo)致的心肌損傷提供了新的思路。

1 Tsutsui H,Kinugawa S,Matsushima S,et al.Oxidative stress and heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physio，2011,301:H2181-2190.

2 Peng YW,Buller CL, Charpie JR. Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury[J]. Pediatr Res, 2011, 70(1):61-66.

3 王繼春，胡笑容，謝菁，等.選擇性預(yù)激動β1腎上腺素受體對大鼠心肌缺血再灌注損傷中高遷移率族蛋白1表達(dá)的影響及其機(jī)制[J].中華心血管病雜志,2014,42(8):680-685.

4 Hu X, Fu W, Jiang H. HMGB1: A potential therapeutic target for myocardial ischemia and repe rfusion injury[J]. Int J Cardiol, 2012, 155(3): 489-489

5 Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894):191-195.

6 Tsung A, Klune JR, Zhang X, et al. HMGB1 release induced by liver ischemia involves toll-like receptor 4 dependent reactive oxygen species production and calcium-mediated signaling[J]. J Exp Med, 2007, 204(12): 2913-2923.

7 Xu H, Yao Y, Su Z,et al. Endogenous HMGB1 contributes to ischemia/reperfusion induced myocardial apoptosis by potentiating the effect of TNF-α/JNK [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 300(3):H913-H921.

8 Wang J, Yang X, Hu X, et al. Dobutamine-mediated heme oxygenase-1 induction via PI3K and p38 MAPK inhibits high mobility group box 1 protein release and attenuates rat myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo[J]. J Sur Res,2013, 183(2):509-516.

9 郭建，劉義，李延平，et al. 氧自由基與心肌缺血再灌注損傷. 中國心血管病雜志，2008，13(5):384-387.

10 Zhu H, Li J, Wang S, et al. Hmgb1-TLR4-IL-23-IL-17A axis promote ischemia-reperfusion injury in a cardiac transplantation model [J]. Transplantation, 2013, 95(12):1448-1454.

11 Zhang A, Mao X, Li L, et al. Necrostatin-1 inhibits Hmgb1-IL-23/IL-17 pathway and attenuates cardiac ischemia reperfusion injury [J]. Transpl Int, 2014, 27(10):1077-1085.

12 Hu X,Zhou X,He B,et al.Minocycline protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats [J]. Eur J Pharmacol, 2010, 638(1-3):84-89.

13 Andrassy M, Volz HC, Igwe JC, et al. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart [J]. Circulation, 2008, 117(25):3216-3226.

14 Xiong J,Yuan YJ,Xue FS,et al.Postconditioning with α7nAChR agonist attenuates systemic inflammatory response to myocardial ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Inflammation, 2012, 35(4):1357-1364.

15 Pchejetski D, Kunduzova O, Dayon A, et al.Oxidative stress-dependent sphingosine kinase-1 inhibition mediates monoamine oxidase A-associated cardiac cell apoptosis[J].Cir Res, 2007, 100(1):41-49.

16 Son Y,Cheong YK,Kim NH,et al.Mitogen-activated protein kinases and reactive oxygen species: how can Ros activate MAPK pathways? [J]. J Signal Transduct,2011, 2011：792639.

17 Yu D, Li M, Tian Y, et al. Luteolin inhibits ROS-activated MAPK pathway in myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Life Sci, 2015, 122:15-25.

18 Marshall KD, Edwards MA, Krenz M, et al. Proteomic mapping of proteins released during necrosis and apoptosis from cultured neonatal cardiac myocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2014, 306(7):C639-C647.

19 Hu X, Cui B, Zhou X, et al. Ethyl pyruvate reduces myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats [J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(1): 227-231.

20 Hu X, Zhou X, He B, et al. Minocycline protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2010, 638(1-3): 84-89.

21 Maugeri N,Rovere-Querini P,Baldini M,et al.Oxidative Stress Elicits Platelet/Leukocyte In ammatory Interactions via HMGB1: A Candidate for Microvessel Injury in Sytemic Sclerosis [J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(7):1060-1074.

22 侯長春，趙海金，李文軍，等.過氧化氫誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞高遷移率族蛋白1主動釋放[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,32(8):1131-1134.

23 Entezari M, Javdan M, Antoine DJ, et al. Inhibition of extracellular HMGB1 attenuates hyperoxia-induced inflammatory acute lung injury [J]. Redox Biol, 2014, 20(2):314-322.

Hydrogen peroxide worsen myocardial injury via up regulating HMGB1 expression:an experimental study

MARuisong*,LIYuanhong,ZHOUXiaoya,JIANGHong,HUXiaorong.DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:LIYuanhong,E-mail:lyh0101@vip.163.com

Objective To investigate the effect of hydrogen peroxide (H2O2) by high mobility group protein (HMGB1) mediated mechanism of myocardial injury.Methods Fetal rat myocardial cells cultured and divided into 4 groups: control group, H2O2different concentration group (100 μmol / L, 200 μmol / L, 500 μmol / L), H2O2(200 μmol / L) + N-acetylcysteine (NAC, 200 μmol / L) group, H2O2(200 μmol / L) +HMGB1 antibody (20 ug / ml) group. The activity of myocardial cells, apoptosis rate, lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) and HMGB1 expression were detected.Results (1) Cell activity: compared with the control group, myocardial cell activity along with the increase of H2O2concentration were decrease (t=-5.81,t=9.59,t=-14.21, allP<0.05); NAC and HMGB1 antibodies can be significantly reduced H2O2(200 umol / L) on the activity of cell inhibition (t=-2.98,t=-3.03,P<0.05). (2) The expression level of LDH and CK: compared with the control group, the expression of LDH and CK were increased along with the increase of the H2O2concentration (LDH,t=9.78,t=15.37,t=18.13. CK,t=11.29,t=20.35,t=26.17, allP<0.05). Compared with H2O2(200 umol / L) group, NAC and HMGB1 antibodies can inhibit LDH and CK expression (LDH,t=-4.91,t=-4.22, CK,t=-4.17,t=3.29, allP<0.05). (3) The expression of MDA and SOD activity: H2O2(100, 200, 500 umol / L) can inhibit the activity of SOD of myocardial cells, increase the expression of MDA (SOD,t=-4.16,t=-6.59,t=-10.76, MDA,t=3.98,t=5.16,t=9.47,P<0.05); H2O2(200 umol / L) group, NAC and HMGB1 antibodies can antagonize the H2O2on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) (LDH,t=-4.91,t=-4.22, CK,t=-4.17,t=3.29, allP<0.05). (4) The expression of HMGB1: compared with the control group, H2O2(100, 200, 500 umol / L) can be significantly increased myocardial HMGB1 expression (t=12.94,t=21.08,t=25.81,P<0.05), and compared with H2O2(200 umol / L) group, NAC + H2O2and HMGB1-Ab+ H2O2’s expression of HMGB1 were decreased significantly (t=-10.24,t=-8.09, allP<0.05). (5) myocardial apoptosis: compared with the control group, H2O2group’s (100, 200, 500 u mol / L) myocardial apoptosis rate increased significantly (t=7.52,t=13.06,t=16.61,P<0.05); NAC+ H2O2and HMGB1+ H2O2groups’ myocyte apoptosis rate were higher than that of H2O2group (200 umol / L) (t=-4.89,t= -4.23,P<0.05).Conclusion The response to oxidative stress induced by H2O2can up regulate the expression of HMGB1, myocardial injury.

Hydrogen peroxide;Myocardial injury；Fetal rat

國家自然科學(xué)基金資助課題(No.81370308)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科(馬瑞松、周曉亞、江洪、胡笑容)； 445000 恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 心內(nèi)科(李元紅)

李元紅，E-mail:lyh0101@vip.163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.06.001

2015-02-14)