培養(yǎng)條件對小球藻生長及油脂積累的影響研究

周連寧，王 波，吳 鋒，趙振業(yè)，梅立永

（1.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司，廣東深圳518057；2.深港產(chǎn)學(xué)研基地，廣東深圳 518057）

培養(yǎng)條件對小球藻生長及油脂積累的影響研究

周連寧1,2，王 波1，吳 鋒1，趙振業(yè)1,2，梅立永1

（1.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司，廣東深圳518057；2.深港產(chǎn)學(xué)研基地，廣東深圳 518057）

隨著化石能源枯竭，微藻生物柴油日益成為研究熱點，不同的培養(yǎng)條件對小球藻的生長及油脂積累有很大的影響。因此考察了溫度、光強和水體pH值等因素對小球藻的生長及油脂積累的影響。結(jié)果表明，不同溫度下小球藻的生長情況和油脂含量不同。在25℃時，小球藻細胞密度最大，油脂積累量最高，達到了26.50%±4%；光照強度對小球藻生長及油脂積累也有很大影響，5000 lux時小球藻細胞密度最大，油脂含量最高；同時pH值對小球藻生長及油脂積累也有顯著作用，在pH值為7時小球藻細胞密度和油脂積累量最大，其中油脂積累量為（23.96±4.3）%。

培養(yǎng)條件；小球藻；油脂含量

當(dāng)前，隨著化石燃料日益減少，環(huán)境污染日益嚴重所引發(fā)的能源危機與環(huán)境問題迫使人們不斷去尋找一種新型可再生能源。而由微藻為原料制取的第3代生物柴油，由于其不占用耕地，微藻生長繁殖速度快，油脂含量高還可用于污水治理等優(yōu)點，引起了全球科學(xué)家廣泛的關(guān)注［1］。其中小球藻(Chlorella)是分布廣泛的單細胞綠藻。因其富含藻多糖、脂肪酸、糖蛋白和維生素等營養(yǎng)成分,不僅可以作為保健品食用［2］，而且可以作為生物柴油的原料，關(guān)于微藻生物柴油的研究已經(jīng)有很多［3］。

微藻生長不僅與藻種自身的生理特性相關(guān)，還受到生長環(huán)境的制約，其中影響較大的是溫度、pH值以及光照強度。為了獲得較高的油脂收獲率，我們就需要對小球藻的生長條件進行優(yōu)化，以期獲得最大的生物量以及油脂含量。國內(nèi)外關(guān)于相關(guān)環(huán)境因子對小球藻生長影響的報道很多，Hultberg等人［4］研究發(fā)現(xiàn)不同光照強度對小球藻的生長有很大影響，Ma等人［5］研究了不同溫度下小球藻的油脂含量，發(fā)現(xiàn)小球藻的最佳培養(yǎng)溫度在25℃～30℃之間，王俊彩等人［6］對小球藻的培養(yǎng)條件和油脂積累特征進行了研究，發(fā)現(xiàn)在pH值6.5～8.5之間小球藻生長情況跟油脂積累并無太大差異。而本文主要在前人的研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步對小球藻生長和油脂積累的影響因子分別進行考察，主要涉及溫度、pH以及光照強度，旨在為利用污水高效培養(yǎng)小球藻的條件優(yōu)化提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小球藻（Chlorella vulgaris）（菌株編號：FACHB-8，藻種保藏號：cgmcc Nol448），培養(yǎng)基主要利用豆制品廢水（取自深圳維他（光明）食品飲料有限公司），經(jīng)過一定處理和高溫滅菌后各項指標(biāo)如下：化學(xué)需氧量（CODcr）為（1011±26.87）mg/L、總氮（TN）為（33.55± 1.2）mg/L、總磷（TP）為（3.57±0.18）mg/L、銨態(tài)氮（-N）為（7.24±0.76）mg/L、硝態(tài)氮（-N）為（3.35±0.21）mg/L、五價磷（P-P）為（2.25±0.1）mg/ L、pH值為（8.8±0.28）。

1.2實驗方法

1.2.1藻干重測定

取預(yù)先烘干并稱重的2.5m L離心管，加入約2m L藻液置于離心機內(nèi)。調(diào)整轉(zhuǎn)速為10000 r/min，離心2 min。隨后棄掉上清液，加入約2m L去離子水后置于振蕩器上震蕩15 s至重新懸浮。然后再次離心，棄去上清液，以上過程重復(fù)3次。最后將離心管敞口置于80℃烘箱中烘至恒重，測定干重。每組設(shè)置3個平行實驗，最終結(jié)果取平均值。

1.2.2小球藻細胞密度測定

由于在液體中小球藻密度和其吸光度成一定的比例關(guān)系，因此可利用分光光度計，在680 nm波長下對藻液進行D680nm值測定，每組設(shè)置3個平行實驗，最終結(jié)果得平均值來定性測定藻細胞密度并反映其生長情況。

1.2.3油脂含量的測定

測定方法采用干重法，設(shè)置3個平行實驗，最終結(jié)果取平均值。稱取一定質(zhì)量的藻粉研磨破碎后放入離心管，隨后加入氯仿∶甲醇∶蒸餾水=1∶1∶0.9混合溶劑持續(xù)震蕩1 h后離心去上清液，重復(fù)2次后靜置。靜置分層后取下層氯仿層于60℃條件下至恒重，即得到油脂。油脂含量的計算公式為：

總脂百分含量=（總脂重/干藻重）×100%

1.2.4小球藻培養(yǎng)方法

取50m L小球藻藻液接種至500m L已滅菌的污水培養(yǎng)液，包扎好后置于光暗比為12 L∶12 D的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，定期搖瓶。

1.2.5單因素實驗方案設(shè)定

溫度設(shè)定為15℃、20℃、25℃、30℃和35℃5個梯度；培養(yǎng)光強為（5000±100）lx；培養(yǎng)液為污水原液。

光強設(shè)定為2500、5000、7500和10000 lx 4個梯度。培養(yǎng)溫度為25℃；培養(yǎng)液為污水原液。

pH值設(shè)定為3、5、7、9和11共5個梯度；利用鹽酸和氫氧化鈉來調(diào)節(jié)不同pH值的污水培養(yǎng)液。培養(yǎng)溫度為25℃，光強為（5000±100）lx。

以上實驗均做3個對照試驗組，最終數(shù)據(jù)取3組的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1溫度對小球藻生長及油脂積累的影響

溫度對小球藻生長的影響。由圖1可見：小球藻在15℃～35℃范圍內(nèi)都能生長，但是溫度對小球藻生長速率有顯著影響，在15℃～25℃范圍內(nèi)，隨著溫度的不斷升高，小球藻的生長速率及總量也隨之增大，但我們發(fā)現(xiàn)在25℃～35℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而其生長速率及生物總量反而隨之降低，在實驗的溫度范圍內(nèi)，生長速率及生物總量總體呈現(xiàn)出一種先升高后降低的趨勢。并且在35℃條件下，培養(yǎng)到第11天時，小球藻生長速率出現(xiàn)負值，說明小球藻不適宜在較高溫度下長時間培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天時，溫度為15℃、20℃條件下的實驗組小球藻細胞密度極顯著低于其他實驗組，說明小球藻在較低溫度下適應(yīng)環(huán)境的時間較長，延時期增加。

溫度對小球藻油脂積累的影響。圖2所示為不同溫度條件下小球藻細胞內(nèi)的油脂積累量的變化情況，從圖中我們可以看出，溫度對小球藻細胞內(nèi)油脂積累量有顯著影響，在15℃～25℃范圍內(nèi)，其油脂含量隨溫度的升高而增加；而在25℃～35℃范圍內(nèi)小球藻的油脂含量隨溫度的升高而降低，在實驗的溫度范圍內(nèi)，整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，并且在溫度為25℃時小球藻細胞內(nèi)油脂含量達到最大值為26.50%±4%，其結(jié)果與對小球藻生長的影響相吻合。

圖1 不同溫度下小球藻的細胞密度Fig 1 Chlorella celldensity atdifferent temperatures

圖2 不同溫度下小球藻細胞內(nèi)的油脂積累量Fig 2 Chlorella intracellular accumulation of fatatdifferent temperatures

2.2光照強度對小球藻生長及油脂積累的影響

光照強度對小球藻生長的影響。光照強度是影響小球藻生長和油脂積累的重要因素，因此本實驗考察了不同光照條件下小球藻的生長情況，如圖3所示。

圖3 不同光照條件下小球藻的生長情況Fig 3 Chlorella grow th under different lighting conditions

從圖中我們可以看出光照強度不同，小球藻的生長情況也不同，光照強度對小球藻生長有顯著影響。在光照強度為2500～10000 lx條件下，小球藻都能生長，并且在較低光強下，小球藻的生長速率隨光照強度的增加而增大，當(dāng)光照強度增加到5000 lx時小球藻細胞密度達最大值，繼續(xù)增大光照強度小球藻生長速率不再增加并且開始出現(xiàn)下降趨勢，在設(shè)定的光強范圍內(nèi)，小球藻的生長速率整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在光強為2500和10000 lx條件下，小球藻的生長速率和總量都顯著低于其他實驗組，說明光強過低或過高都不利于小球藻的生長。

光照強度對小球藻油脂積累的影響。光照強度不僅影響小球藻的生長情況，而且對細胞內(nèi)油脂含量也有顯著影響。從圖4可以看出：不同光照強度下，小球藻細胞內(nèi)的油脂含量也不同，在2500～5000 lx范圍內(nèi)，隨光照強度的增大小球藻細胞內(nèi)油脂含量也在增加，在5000～10000 lx范圍內(nèi)，油脂積累量隨光照強度的增大而降低，在實驗范圍內(nèi)整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，并且在5000 lx是油脂含量最高，達25.68%±2%；在10000 lx時油脂積累量最低，為12.63%±1.1%。

圖4 不同光照強度下小球藻細胞內(nèi)油脂積累量Fig 4 Accumulation of fatw ithin the chlorella cells under different light intensities

2.3 pH對小球藻生長及油脂積累的影響

培養(yǎng)液pH值對小球藻油生長的影響。從圖5可以看出：小球藻在強酸(pH值3)或強堿(pH值11)條件下基本不能生長，但是隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，當(dāng)培養(yǎng)液pH變?yōu)檫m宜小球藻生長值時，小球藻開始迅速增長；在pH值為5～9的范圍內(nèi)，小球藻都能進行良好的生長，并且在第11天時，其生長速率隨pH值的增高而增加，在培養(yǎng)期結(jié)束時(25 d)，隨著pH值的升高，小球藻的細胞密度先增大后減小。在實驗范圍內(nèi)，小球藻生長的整體趨勢為：隨著pH值的升高，小球藻細胞密度先增大后減小，并且經(jīng)過多重比較，pH值為7時的細胞密度最大，培養(yǎng)結(jié)束時D680nm值為4.38。

在pH值3和pH值11條件下小球藻不能生長的主要原因可能是由于強酸、強堿的條件下影響了營養(yǎng)物質(zhì)的礦化程度，或者改變了細胞膜表面的電荷分布，甚至?xí)霈F(xiàn)質(zhì)壁分離的情況。楊勛［12］等人考察了不同pH值對小球藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)在pH值6.5～9.5范圍內(nèi)小球藻可以進行生長，最佳pH值8，王翠等［13］利用沼液培養(yǎng)小球藻，考察了不同pH值對其影響，發(fā)現(xiàn)最佳pH值7，最佳pH值的不同可能是由于所選藻株不同造成的。

培養(yǎng)液pH值對小球藻油脂積累的影響。通過研究不同pH值對小球藻生長情況的影響，發(fā)現(xiàn)小球藻在pH值3和pH值9條件下基本不能生長，因此本實驗只考察了在pH值5～9范圍內(nèi)小球藻細胞內(nèi)油脂積累的情況。由圖6可以看出：培養(yǎng)液pH值的改變對小球藻細胞內(nèi)油脂積累有顯著影響，并且隨著pH值的升高，油脂含量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在pH值7時取得最大值23.96%±4.3%，與不同pH值條件下小球藻的生長情況相一致；在pH值5時油脂含量為17.35%± 2.1%，在pH值9時油脂含量為19.72%±2.4%，說明小球藻在堿性環(huán)境中油脂積累量要高于酸性環(huán)境，小球藻耐堿性強于耐酸性。

圖5 不同pH值下小球藻的生長情況Fig 5 grow th of Chlorella atdifferentpH

圖6 不同pH值條件下小球藻油脂積累情況Fig 6 Chlorella greaseaccumulation atdifferentpH conditions

3 討論

本實驗研究了不同溫度、光照強度、pH值條件下小球藻生長和油脂積累情況。

小球藻在25℃～30℃范圍內(nèi)比較適宜生長，最佳生長溫度為25℃。在實驗的溫度范圍內(nèi)，生長速率及生物總量總體呈現(xiàn)出一種先升高后降低的趨勢。在35℃條件下，培養(yǎng)到第11天時，小球藻生長速率出現(xiàn)負值，說明小球藻不適宜在較高溫度下長時間培養(yǎng)。并且溫度為15℃條件下的實驗組小球藻細胞密度極顯著低于其他實驗組，說明小球藻在較低溫度下生長緩慢。研究表明，溫度對小球藻生長的影響主要是通過影響酶的活性和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸實現(xiàn)，溫度較低時,細胞膜的運輸和呼吸代謝功能會受到影響，生長速率較慢；但隨著逐漸溫度上升,酶活性不斷增強,生長速率也逐步加快；而當(dāng)溫度過高時，可能會破壞細胞和酶的活性，導(dǎo)致生長速率降低甚至出現(xiàn)負增長。通過實驗結(jié)果可以看出，小球藻的最佳培養(yǎng)溫度為25℃，這與劉加慧等［7］人的研究結(jié)果相一致。

隨著溫度的升高，小球藻油脂含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，并且在溫度為25℃時小球藻細胞內(nèi)油脂含量達到最大值。油脂含量出現(xiàn)上述變化趨勢的主要原因可能是溫度對參與光合作用的酶產(chǎn)生了相應(yīng)作用，小球藻細胞內(nèi)油脂的積累始于光合作用，當(dāng)溫度過低時細胞體內(nèi)的酶活性較弱，活性中心數(shù)量較少，隨著溫度的升高小球藻體內(nèi)的酶活性也逐步升高，但是當(dāng)溫度過高時會對其產(chǎn)生不可逆的結(jié)構(gòu)破壞，造成酶數(shù)量減少。丁彥聰［8］等人研究了溫度對小球藻細胞內(nèi)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響，結(jié)果表明溫度過高會使活性反應(yīng)中心的數(shù)量下降，進而捕獲和用于電子傳遞的能量減少，造成油脂積累量下降。張桂艷［9］等人研究了溫度對小球藻油脂積累量的影響，其研究也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并且在35℃左右取得最大值，這可能是由于所選的小球藻品種不同造成的差異。

小球藻的光合作用能力是其他高等植物的10倍左右，鑒于這種生命活力，小球藻被人們親切的贊美為“罐裝的太陽”。因此研究光照條件對小球藻生長和油脂積累的影響是必要的。研究發(fā)現(xiàn)，不同光照條件下小球藻的生長趨勢和油脂積累情況呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，小球藻最佳光照強度為5000 lx。這是由于光照強度影響了小球藻的光合作用速率，研究表明［10］當(dāng)光照強度在光飽和點以下時，微藻的光合作用隨著光照強度的增加而加強，從而促進藻細胞的生長；超過光飽和點時，藻類的光合速率不再增加，甚至減弱、停止。劉青［11］等人研究了不同光照強度下小球藻的生長情況，也是呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，并且在5000 lx時取得最大值，與本實驗結(jié)果相同。當(dāng)光強較低時，抑制細胞生長和油脂積累的因素主要是光強，因此隨著光照強度的增加，細胞光合作用速率加快，細胞內(nèi)油脂積累較多，當(dāng)達到一定值時，光強不再成為限制因素，如果繼續(xù)增大光強反而會對細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，造成油脂含量降低。實驗結(jié)果說明在小球藻的培養(yǎng)過程中并不是光照強度越大越好，相反較大的光照強度反而會降低細胞內(nèi)的油脂含量，因此光照強度要控制在合適的范圍內(nèi)。

小球藻在pH值為5～9的范圍內(nèi)，小球藻都能進行良好的生長；在強酸(pH值3)或強堿(pH值11)條件下基本不能生長，但是隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，培養(yǎng)液的pH逐漸變?yōu)檫m宜小球藻生長，小球藻開始迅速增長?？赡苁怯捎趶娝帷妷A的條件下影響了營養(yǎng)物質(zhì)的礦化程度，或者改變了細胞膜表面的電荷分布，甚至?xí)霈F(xiàn)質(zhì)壁分離的情況。楊勛等［12］人發(fā)現(xiàn)在pH值6.5～9.5范圍內(nèi)小球藻可以進行生長，最佳pH值8。王翠等［13］利用沼液培養(yǎng)小球藻，發(fā)現(xiàn)最佳pH值7，可能是由于所選藻株不同造成最佳pH值的不同。

本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液pH值的改變對小球藻細胞內(nèi)油脂積累有顯著影響，在pH值7時取得最大值。pH值對微藻細胞油脂積累的影響主要在于改變細胞膜電荷和營養(yǎng)物的離子化程度，進而改變細胞內(nèi)酶的活性和細胞對營養(yǎng)離子的吸收，例如光合作用中CO2的吸收，呼吸作用中對有機碳源的利用效率，細胞代謝產(chǎn)物的再次利用及其毒性。有研究表明［14］微藻體內(nèi)酶的最適pH值為7.5～8.0左右，在pH值7.5～8.0條件下，有關(guān)酶能很好地發(fā)揮作用,使不飽和度增加，多不飽和脂肪酸含量增加，在其它pH值時，多不飽和脂肪酸含量相對較低。王曉晨等人［15］研究了不同pH值條件下小球藻細胞內(nèi)的油脂積累情況，發(fā)現(xiàn)在pH值8時油脂積累量最大，不同研究的最佳pH值不一致的原因可能有以下兩個：選擇的小球藻品種不同；小球藻的培養(yǎng)環(huán)境或者營養(yǎng)元素的配比不同。

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The im pactof different culture conditionson the chlorella’s grow th and fataccumulation

ZHOU Lian-ning1,2,WANG Bo1,WU Feng1,ZHAO Zhen-ye1,2,MEILi-yong1
(1.Shenzhen-Hongkong Institution of Industry,Education&Research Environmental Technique Co.,Ltd.,Shenzhen 518057;2.PKU-HKUSTShenzhen-Hongkong Institution,Shenzhen 518057,China)

With the depletion of fossil fuels,algae biodiesel increasingly become a hot topic,and a different culture conditions have a great impacton the grow th and fataccumulation of Chlorella.Therefore,this paper exam ined the impactof factors such as temperature,light intensity,and water pH on the Chlorella’sgrow th and fataccumulation.The results showed that Chlorella’s grow th atdifferent temperatures have different fataccumulation.At25℃,Chlorella cells reached the highest density,and the highestaccumulation of grease could reach to(26.50±4)%;light intensity also had a great impact on Chlorella’s grow th and grease accumulation, and Chlorella themaximum cell density,highest fat content appeared at 5000 lux;pH also have a significant role in the grow th of Chlorella and fataccumulation,when pH=7,the Chlorella cells reached to the highestdensity and the highestaccumulation of greasereached to(23.94±4.3)%.

culture conditions;chlorella;fatcontent

S968.49;Q949.2

A

2095－1736（2015）03－0046－05

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.046

2014-10-17；

2014-11-18

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目（CXZZ20120618111150009）；青年科學(xué)基金項目（513080061006239）

周連寧，碩士，主要研究方向為環(huán)境生物技術(shù)，E-mail：z.l.ning@163.com。