徐宏軍，楊鵬程，任 麗，胡來根，何孔旺，劉文倩，代洪波

（1.成都天邦生物制品有限公司，四川成都610100；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種豬的急性腸道傳染病。該病于1971年在英國首次被報道，不久相繼在歐洲各國開始流行。其在亞洲流行情況較歐洲更為嚴(yán)重，并呈現(xiàn)出哺乳仔豬高發(fā)病率、高致死率的特點［1］。我國于1976年首次報道該病，到2000年，該病已經(jīng)在全國范圍內(nèi)流行。特別是從2010年起，該病在我國的免疫豬群中再度流行，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的危害［2－3］。新毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致對目前CV777株疫苗毒免疫效力的質(zhì)疑，然而目前沒有更為合適的新的疫苗毒株出現(xiàn)，如何提高現(xiàn)有滅活疫苗保護(hù)力就成為防控PED 的研究熱點。本試驗旨在通過使用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝制備高效價PED 滅活疫苗（CV777株），與普通轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)的PED 滅活疫苗（CV777株）及組織滅活苗進(jìn)行動物攻毒保護(hù)對比試驗，探索提高疫苗中的抗原含量是否能夠有效提高PEDV 疫苗的保護(hù)力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 T4DNA ligase、10×buffer for T4DNA ligase、pMD19－T simple vecter為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、DNA Marker DL 2 000、瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、病毒RNA提取試劑盒、一步法RT－PCR 試劑盒為天根生物有限公司產(chǎn)品；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞與毒株 DH5α菌種由本實驗室保存。Vero E6細(xì)胞、豬流行性腹瀉疫苗毒（CV777株）由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；豬流行性腹瀉病毒流行株（JS12株）由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈。豬流行性腹瀉組織滅活苗由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈。

1.1.3 試驗用動物 豬流行腹瀉抗原、抗體陰性妊娠母豬，為四川眉山散養(yǎng)農(nóng)戶飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 PEDV 疫苗毒（CV777株）生物信息學(xué)分析

根據(jù)GenBank中公布的PEDV S基因主要中和位點序列（S基因1 495位～1 914位核苷酸），設(shè)計合成PEDV S 基 因 擴(kuò) 增 引 物 如 下：P1：5′－TTCTGAGTCACGAACAGCCA－3′；P2：5′－CATATGCAGCCTGCTCTGAA－3′。目的片段為650bp 左右，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。以天根生物病毒RNA 提取試劑盒，分別提取PEDV 疫苗株CV777株與流行毒株JS12株病毒RNA，以天根生物一步法RT－PCR 試劑盒方法進(jìn)行CV777株與JS12株S基因擴(kuò)增。分別回收RT－PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，鏈接至pMD19－T simple vecter，轉(zhuǎn)化DH5α感

受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送上海英俊公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與GenBank上所提交的PEDV S基因核酸及氨基酸序列進(jìn)行比對，以DNA Star進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。

1.2.2 PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗的制備 以傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝在Vero E6細(xì)胞上對PEDV CV777株進(jìn)行增殖，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時收獲病毒液，進(jìn)行半成品檢驗。檢驗合格后，病毒液用甲醛滅活后與60%氫氧化鋁膠佐劑以2∶1 比例進(jìn)行乳化，制備PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗。按《中國人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2001年版）對疫苗進(jìn)行各項檢測。

1.2.3 PEDV 懸浮培養(yǎng)高價滅活疫苗的制備 使用懸浮培養(yǎng)工藝（專利號：ZL20101013700.5）培養(yǎng)Vero E6 細(xì)胞，待滿球率大于90%時接毒進(jìn)行PEDV CV777 株懸浮培養(yǎng)。接毒劑量為0.01 MOI，接毒后定期取樣觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時收獲病毒液，進(jìn)行半成品檢驗。檢驗合格后，病毒液用甲醛滅活后與60%氫氧化鋁凝膠佐劑以2∶1 比例進(jìn)行乳化，制備PEDV懸浮培養(yǎng)高價滅活疫苗，按《中國人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2001 年版）對疫苗進(jìn)行各項檢測。

1.2.4 動物試驗

1.2.4.1 分組與免疫 在四川眉山某鄉(xiāng)鎮(zhèn)散養(yǎng)農(nóng)戶家中采集妊娠母豬血液送至成都天邦生物制品有限公司診斷中心，以PEDV 抗體檢測試劑盒進(jìn)行PEDV 抗 體 檢 測，以PEDV 抗 原RT－PCR 檢 測 方法［4］與韓國Anigen公司PEDV 抗原膠體金檢測試劑盒同時進(jìn)行PEDV 抗原檢測。共篩選8 頭PEDV 抗原、抗體陰性妊娠母豬，分4 組進(jìn)行不同PEDV 疫苗的免疫，每組2頭。產(chǎn)前30d，各試驗組分別免疫對應(yīng)疫苗（表1），免疫劑量為4mL／頭；對照組每頭注射4mL PBS。

1.2.4.2 攻毒保護(hù)試驗 試驗?zāi)肛i產(chǎn)子后14d左右，每頭母豬選取5頭仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，攻毒之前仔豬均采用母乳飼養(yǎng)3d～5d，然后分組獨立飼養(yǎng)。按表2，每頭仔豬口服、肌肉注射PEDV 流行毒株（JS12 株）病毒液（107.0TCID50／mL）各1 mL。攻毒后連續(xù)觀察6d，每3h觀察一次，記錄試驗仔豬是否出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐等流行性腹瀉癥狀，采集腹瀉仔豬肛門拭子，送成都天邦生物制品有限公司診斷中心進(jìn)行PEDV 抗原RT－PCR 檢測［4］。

表1 試驗?zāi)肛i分組與免疫信息Table 1 The grouping and immune information of experimental sows

表2 仔豬攻毒保護(hù)試驗分組Table 2 The grouping and challenge－protection experiment in piglets

2 結(jié)果

2.1 PEDV 疫苗毒（CV777）生物信息學(xué)分析

將成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用PEDV CV777疫苗毒株S 基因測序結(jié)果命名為GSCV777，PEDV JS12流行毒株S基因測序結(jié)果命名為GS－JS12。以DNA Star軟件將JS12流行毒株、CV777疫苗毒株的S基因與GenBank上所提交的PEDV CV777株S基因序列，以及部分PEDV 流行毒株S基因序列進(jìn)行核苷酸與氨基酸的序列比對，比對結(jié)果見圖1、圖2。成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用PEDV CV777 疫苗株S 基因核酸序列與CV777參考核酸序列相似性為99.7%，氨基酸序列同源性為99.5%，成都天邦生物制品有限公司現(xiàn)用CV777毒株在傳代使用過程中S 基因未發(fā)生明顯突變。PEDV CV777株S 基因與流行毒株的相似性在96.4%～99.7%之間，氨基酸序列相似性在96.7%～99.5%之間。

2.2 PEDV 轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗的制備

轉(zhuǎn)瓶工藝培養(yǎng)PEDV 半成品效價為107.0TCID50／mL。與氫氧化鋁佐劑2∶1乳化后制備成品疫苗，轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗成品抗原滴度計算值為106.82TCID50／mL。轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗無菌檢驗、外源病毒檢驗等各項質(zhì)量檢驗符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 PEDV 懸浮培養(yǎng)高價滅活疫苗的制備

懸浮工藝培養(yǎng)PEDV 半成品效價為108.5TCID50／mL。與氫氧化鋁佐劑2∶1乳化后制備成品疫苗，轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗成品抗原滴度計算值為108.32TCID50／mL。轉(zhuǎn)瓶滅活疫苗無菌檢驗、外源病毒檢驗等各項質(zhì)量檢驗符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 PEDV S基因核苷酸序列比對結(jié)果Fig.1 Homology analysis of PEDV S gene nucleotide sequence

圖2 PEDV S基因氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Homology analysis of PEDV S gene amino acid sequence

2.4 動物試驗結(jié)果

2.4.1 臨床觀察 母豬產(chǎn)前30d分別免疫不同工藝制備的PEDV 滅活疫苗，母豬產(chǎn)仔后14d左右進(jìn)行仔豬PEDV 攻毒保護(hù)試驗。攻毒后連續(xù)觀察6d，A 組（懸浮工藝滅活疫苗）10頭仔豬共有2頭出現(xiàn)腹 瀉 癥 狀，發(fā) 病 率20%（2／10），保 護(hù) 率80%（8／10）；B組（轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗）10頭仔豬共有8頭出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率80%（8／10），保護(hù)率僅為20%（2／10）；C組（組織滅活苗）10頭仔豬有9頭出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率90%（9／10）；D 組（對照）10頭仔豬全部出現(xiàn)腹瀉癥狀，發(fā)病率100%（10／10）。試驗結(jié)果統(tǒng)計見表3。

表3 攻毒保護(hù)試驗結(jié)果Table 3 The test results of animal challenge protection

2.4.2 剖檢大體病變觀察 將發(fā)病仔豬在觀察期結(jié)束后進(jìn)行處死，仔豬均出現(xiàn)小腸鼓氣，腸壁變薄，腸系淋巴結(jié)腫大出血等PED 剖檢病變（圖3）。

圖3 病豬剖檢病理變化Fig.3 The pathological lesions of sick piglets

2.4.3 RT－PCR 檢測所采集腹瀉豬肛拭子PEDV結(jié)果 采集試驗仔豬的肛拭子，通過RT－PCR 進(jìn)行PEDV 抗原檢測，檢測結(jié)果見表3。懸浮工藝滅活疫苗組共檢出2頭PEDV 抗原陽性，轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗組共檢出7頭陽性，組織滅活苗組共檢出7頭陽性，對照組共檢出8頭陽性。結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行保護(hù)率判定，母豬產(chǎn)前30d左右免疫接種1次，懸浮高價滅活疫苗保護(hù)率為80%（8／10）；轉(zhuǎn)瓶工藝滅活疫苗組保護(hù)率為20%（2／10）；組織滅活苗組10%（1／10）保護(hù)；對照組全部發(fā)病，0／10保護(hù)。

3 討論

近年來，PED 已成為危害養(yǎng)豬業(yè)重要的傳染病之一，在秋冬春三季常呈現(xiàn)大面積暴發(fā)的態(tài)勢。PEDV 雖只有一個血清型但毒株變異較大，在亞洲流行形勢復(fù)雜。楊漢春［5］曾報道基于對北京、河北、山東、河南、浙江等地區(qū)12個發(fā)病豬場的臨床癥狀和腸道組織樣本的病原學(xué)檢測結(jié)果表明，引起仔豬腹瀉的主要病原是豬流行性腹瀉病毒（PEDV），對毒株的全基因組序列測定表明，是一種新的毒株，其主要抗原表位基因S基因與我國鄰國韓國的同源性最高，而與傳統(tǒng)疫苗毒株CV777基因差異較大。毒株基因變異應(yīng)該是造成免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)分離毒株的全長基因序列和棘突蛋白（S）基因序列長度有差異，其他基因長度保守性強(qiáng)。S 基因的變異率高于其他基因，特別是短期內(nèi)基因突變主要發(fā)生于S 基因。綜合分析認(rèn)為國內(nèi)變異毒株雖與韓國毒株遺傳關(guān)系較近，但從境內(nèi)毒株衍生和進(jìn)化而來的可能性更大［6］。

PEDV 分離難度大，細(xì)胞適應(yīng)性差是目前疫苗毒株難以更換的主要原因。1988 年Hofmann M等［7］首次報道在細(xì)胞維持液中添加一定劑量的胰酶可以使PEDV 在Vero細(xì)胞上增殖，人們才開始能夠在傳代細(xì)胞上對PEDV 進(jìn)行培養(yǎng)。雖然其后有很多人在進(jìn)行PEDV 在傳代細(xì)胞上培養(yǎng)的研究，相繼 有 在IBRS－2、PK－15 細(xì) 胞 系 上 培 養(yǎng) 成 功 的 報道［8－9］，但這仍是制約獲得新的合適的疫苗毒株的主要因素。組織滅活苗在防治PED 的歷史上發(fā)揮了重要的作用［10］，但制備成本高，效價難以穩(wěn)定，安全性差都是其不可避免的缺點。在本次試驗中，我們可以觀察到組織滅活苗在3個試驗組中雖然毒株針對性最強(qiáng)，但保護(hù)率卻最差（10%）。究其原因可能是使用小腸組織及內(nèi)容物反復(fù)凍融后的上清溶液作為抗原，因為反復(fù)凍融并不能保證病毒的完全釋放，因而很難保證疫苗中的抗原含量，從而導(dǎo)致最終的試驗結(jié)果。所以，組織滅活疫苗已經(jīng)逐漸被淘汰。

面對以上問題，如何能夠在使用傳統(tǒng)疫苗毒株CV777的條件下提高疫苗保護(hù)力成為目前PED 疫苗的主要研究重點。國內(nèi)學(xué)者的主要觀點是在疫苗中提高抗原含量能夠在一定程度上增強(qiáng)疫苗保護(hù)力。2011年福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽水產(chǎn)疾病診療中心［11］對福建省內(nèi)184份頑固性腹瀉病料進(jìn)行檢測，豬流行性腹瀉感染96份，占52.2%。哺乳仔豬為主要感染對象，一旦感染發(fā)病率100%，病死率為80%～100%。同時研究人員還發(fā)現(xiàn)在只進(jìn)行過一次傳染性胃腸炎－流行性腹瀉二聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗免疫的規(guī)?；B(yǎng)殖場較進(jìn)行過兩次免疫的養(yǎng)殖發(fā)病情況更為嚴(yán)重。上述調(diào)查報告從側(cè)面印證了學(xué)者的觀點。為證實此種觀點，我們設(shè)計了本次試驗。在試驗中，我們使用擁有專利技術(shù)的豬流行性腹瀉病毒的生產(chǎn)方法（ZL 20101013700.5）進(jìn)行PEDV（CV777株）滅活苗的抗原制備，使其在滅活前效價達(dá)到108.5TCID50／mL，是傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)工藝所制備的疫苗抗原配苗標(biāo)準(zhǔn) （國家標(biāo)準(zhǔn)107.0TCID50／mL以上為合格）30倍。通過攻毒保護(hù)試驗，可以明顯看出通過提高抗原含量的方法能夠有效提高疫苗保護(hù)力（懸浮培養(yǎng)苗保護(hù)率80%，普通轉(zhuǎn)瓶苗保護(hù)率20%）。近年來，我國不斷暴發(fā)豬流行性腹瀉疾病，目前國內(nèi)豬流行性腹瀉的預(yù)防疫苗以轉(zhuǎn)瓶工藝生產(chǎn)為主 （質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為107.0TCID50／mL），對PEDV 流行毒株的保護(hù)效果欠佳，導(dǎo)致用戶對疫苗毒株免疫效果的質(zhì)疑［12］。試驗通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)提高豬流行性腹瀉病毒疫苗株抗原效價，能夠給流行毒株提供有效保護(hù)，消除對現(xiàn)用疫苗毒株有效性的質(zhì)疑，為今后PED 疫苗的研制與生產(chǎn)提供了新的方向。

［1］ Barbara E S，Sylvie D A，William L M，et al.豬病學(xué)［M］.趙德明，張中秋，沈建忠，等，譯.8版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008.

［2］ 楊麗梅，馬 力，徐倩倩，等.我國豬病毒性腹瀉的診斷與流行病學(xué)調(diào)查研究概況［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（2）：115－119.

［3］ 魏海芳，王鴻忠.青海省部分地區(qū)PEDV、TGEV 和RV 感染情況調(diào)查與分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（9）：133－136.

［4］ Ben Salem A N，Chupin Sergei A，Bjadovskaya Olga P，et al.Multiplex nested RT－PCR for the detection of porcine enteric viruses［J］.J Virol Meth，2010，165（2）：283－293.

［5］ 楊漢春.我國新發(fā)豬病的流行現(xiàn)狀［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012（2）：22－27.

［6］ 董世娟，朱于敏，于瑞嵩，等.我國PEDV 分子流行病學(xué)研究進(jìn)展［C］／／中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2013：96－101.

［7］ Hofmann M，Wyler R.Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture［J］.J Clin Microbiol，1988，26：2235－2239.

［8］ 錢永清，聞人楚，唐永蘭，等.豬流行性腹瀉病毒的分離培養(yǎng)鑒定［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，15（2）：41－44.

［9］ 古洪浪，鄧勝朝，崔 進(jìn)，等.豬流行性腹瀉病毒PEDV－GD12株的分離鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，49（11）：22－24.

［10］ 王 鳳，湯德元，李春燕，等.豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究［J］.豬業(yè)科學(xué)，2010（12）：42－47.

［11］ 張世忠，江 斌.2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（2）：23－25.

［12］ 趙夢姣，陳書民，成 巖，等.山東省部分地區(qū)豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及其M 基因遺傳變異分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（10）：1504－1508.