朱早兵等

摘 要 簡述油菜素內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成、信號傳導(dǎo)機(jī)制，種子萌發(fā)生理，正常環(huán)境下油菜素內(nèi)酯促進(jìn)種子萌發(fā)的生理作用和逆境條件下油菜素內(nèi)酯對種子萌發(fā)的促進(jìn)效應(yīng)等，提出油菜素內(nèi)酯促進(jìn)種子萌發(fā)機(jī)理的研究方向。

關(guān)鍵詞 油菜素內(nèi)酯 ；種子萌發(fā) ；進(jìn)展

分類號 Q945

Abstract Based on the introduction of brassinolide sources， methods of synthesis and signal transduction pathway， the paper mainly expounded the physiological effects of brassinolide on seeds during germination stage and part of the molecular mechanism that brassinolide promoted seed germination when the seeds were in the normal and stress conditions， further put forward the research direction of the mechanism that brassinolide promoted seed germination.

Keywords brassinolide ； seed germination ； research progress

油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）又名蕓苔素內(nèi)酯或蕓苔素，是植物中的甾醇類生長促進(jìn)激素，它的作用貫穿植物萌發(fā)到開花結(jié)果的整個生活史，它能促進(jìn)細(xì)胞伸長，影響細(xì)胞分裂分化，促進(jìn)植物進(jìn)入生殖生長，影響花誘導(dǎo)及分化，同時在提高植物對逆境條件抵御能力，增強(qiáng)植物凈光合作用、增加作物產(chǎn)量等方面都具有十分重要的意義。由于油菜素內(nèi)酯在提高作物耐旱、耐寒和耐鹽等方面的能力，以及提高作物抗病性的作用已超過現(xiàn)有的5種激素，被國際上譽(yù)為第六激素[1]。自發(fā)現(xiàn)以來，科研人員對油菜素內(nèi)酯各方面的研究不斷取得突破性進(jìn)展，尤其是近幾年在促進(jìn)種子萌發(fā)、提高作物對外界不良環(huán)境的抗性機(jī)理和促進(jìn)作物幼苗細(xì)胞伸長分裂，減少水果和蔬菜中農(nóng)藥殘留等研究取得了很大進(jìn)步，同時在果蔬、農(nóng)林方面的應(yīng)用情況也有報道[2]，這為今后油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于生產(chǎn)實際提供了理論基礎(chǔ)。近年來，油菜素內(nèi)酯在種子萌發(fā)階段的的生理效應(yīng)研究逐步展開，包括種子萌發(fā)階段的信號傳導(dǎo)機(jī)制、下胚軸的伸長作用原理等。筆者簡述近年油菜素內(nèi)酯在種子萌發(fā)階段的生理作用和促進(jìn)萌發(fā)分子機(jī)理的研究成果，闡述了油菜素內(nèi)酯促進(jìn)種子萌發(fā)的生理效應(yīng)，以期為深入研究油菜素內(nèi)酯在種子萌發(fā)生理方面的作用機(jī)理提供參考。

1 油菜素內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)、合成及信號傳導(dǎo)機(jī)制

1.1 油菜素內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)

20世紀(jì)70年代，科學(xué)家對甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）進(jìn)行研究，從花粉中發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)，后對其進(jìn)行大量的采集、分離、純化和結(jié)構(gòu)分析，最終證明它具有與動物固醇類激素（雌性激素，睪酮等）相似的結(jié)構(gòu)，并且多攜帶一定活性基團(tuán)側(cè)鏈的一種化合物（如圖1），命名為油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）[3-4]，迄今發(fā)現(xiàn)約70種BL的類似物，它們合稱油菜素甾醇類物質(zhì)（brassinosteroid， BR），BR與BL結(jié)構(gòu)上的區(qū)別主要在A，B環(huán)的修飾基團(tuán)不同，油菜素甾醇類激素根據(jù)B環(huán)官能團(tuán)的不同分成3類，再根據(jù)甾醇延伸出的基團(tuán)不同又可將其分為7類，BL是BR中活性最強(qiáng)的分子，其它油菜甾醇類物質(zhì)的活性只有BL的1/10[5-6]?？茖W(xué)家推測BR活性強(qiáng)主要原因是與BR母體甾醇中A和B環(huán)的反式結(jié)構(gòu)、B環(huán)的6-O和6-O-7-氧雜環(huán)集團(tuán)及A環(huán)的順式α向的羥基集團(tuán)等結(jié)構(gòu)因素有關(guān)[7]。

BR在植物體中廣泛存在，無論單子植物、雙子葉植物、裸子植物、被子植物或是低等植物、高等植物都含有BR，其中栗甾醇（CS）分布最為廣泛。不同組織、不同器官、甚至不同生長時期BR含量有很大差別，一般幼嫩的組織器官含量高于成熟的組織器官，幼年時期高于成熟期，生長旺盛部位合成也越多[8-9]。

1.2 BR的合成

20世紀(jì)70年代國外已有油菜素內(nèi)酯合成研究。美國、日本等國研究人員分別以麥角甾醇和油菜甾醇作為原料合成油菜素內(nèi)酯，但都由于反應(yīng)步驟長、總收率低等因素?zé)o法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，中國從1988年開始有合成的研究[10]，主要是合成BRll、BR12、BR，合成途徑：

植物甾醇酯磺酸→甾酮→二羥基甾酮 →四羥基甾醇→油菜素甾醇類物質(zhì)（最終產(chǎn)物），該反應(yīng)具有原料易獲得、反應(yīng)路線短、產(chǎn)物容易控制和反應(yīng)收率高等優(yōu)點。

隨著GC-MS和GC-MS-SIM技術(shù)發(fā)展，通過飼喂標(biāo)記的方法，發(fā)現(xiàn)另一合成路徑：

甲基戊酸（類萜途徑起始分子）→鯊烯→油菜甾醇（campesterol， CR，反應(yīng)的起始物質(zhì)）→油菜甾烷醇（CN）→C-6早期氧化途徑或C-6晚期氧化途徑→油菜甾酮→油菜素內(nèi)酯[11]，該過程中油菜甾醇經(jīng)一系列加氧、羥化、脫羥等途徑最終合成油菜素內(nèi)酯（圖2）。該合成途徑主要分為2條：前期C6氧化途徑和后期C6氧化途徑[12]。這2條途徑的劃分與甾醇體側(cè)鏈反應(yīng)時C6酮基與C22、C23、C2及C3進(jìn)行位置修飾的先后有關(guān)[13]。

1.3 BR的信號傳導(dǎo)機(jī)理

目前，對雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻中BR信號傳導(dǎo)研究較為深入[14-15]。研究證明，植物甾醇類激素與動物甾醇有所不同，其信號傳遞主要通過結(jié)合細(xì)胞膜外層上的BR不敏感蛋白（brassinosteroid insensitive 1，BRI1）受體激酶后被感知，然后將信號傳遞到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中BRI1與共受體BAK1（BRI1-associated receptor kinase，BAK）結(jié)合成二聚體，然后通過一系列的蛋白磷酸化和去磷酸化以及蛋白定位的改變，將信號傳遞給核中，通過轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控下游基因的表達(dá)來實現(xiàn)對不同生理效應(yīng)的調(diào)控[16]。在這一途徑中：若BR信號沒有被感知時，BRI1與自身共受體BAK1結(jié)合后將被負(fù)調(diào)控蛋白BRI1抑制[17]，同時類GSK3蛋白激酶BIN2磷酸化轉(zhuǎn)錄因子BZR1/BES1使之失活，無法進(jìn)入細(xì)胞核識別DNA實現(xiàn)相應(yīng)的生理調(diào)控[18]；當(dāng)BR存在時，BR被信號受體BRI1感知后，與BRI1抑制子（BRI1 Kinase inhibitor 1， BKI1）發(fā)生解離[19]，被磷酸化解離的BRI1將很快與細(xì)胞質(zhì)中BAK結(jié)合，BAK1-BRI1被激活后繼續(xù)磷酸化，BR信號激酶（brassinosteroid-signalling kinase， BSKs）和組成型差異生長蛋白1（constitutive differential growth1，CDG1）的下游激酶，繼而對下游的激酶BSU1去磷酸化作用，同時增強(qiáng)了BSU1的去磷酸化能力，對BIN2的活性產(chǎn)生抑制作用[20]，使之不能進(jìn)一步磷酸化下游轉(zhuǎn)錄基因BESI或BZRI，最后轉(zhuǎn)錄因子在PP2A磷酸酶作用下去磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核中實現(xiàn)基因調(diào)控[21]（圖3）。

2 BR在種子萌發(fā)過程中的生理效應(yīng)

2.1 種子萌發(fā)生理

種子的萌發(fā)是植物生命開始，萌發(fā)的好壞直接影響植物后期的生長、發(fā)育及成熟。通常意義上的種子萌發(fā)是胚根和胚軸突破組織，在種子發(fā)芽的過程中主要有3個步驟：干燥的種子吸水后發(fā)生的吸脹作用；種子吸水之后的生理代謝被激活；胚軸、胚根突破組織完成萌發(fā)[22]。吸脹作用主要由植物種子的襯質(zhì)勢引起，干種子的襯質(zhì)勢大，死或活的干種子都存在著吸脹作用[23]，水透過種子細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞膜，干種子中原來以凝膠狀態(tài)的襯質(zhì)物在水合作用下形成液晶狀，同時種子體積發(fā)生膨脹，將原有的膜質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，襯質(zhì)溢出。種子在發(fā)生吸脹之后，細(xì)胞迅速分裂，各種代謝酶被激活，多種內(nèi)源激素也快速合成，赤霉素含量迅速上升，種子吸水后ABA濃度降低，對種子萌發(fā)抑制作用減弱[24]，種子活性增強(qiáng)，胚根突破組織，胚軸不斷伸長完成萌發(fā)。

2.2 在適宜條件下，BR促進(jìn)種子萌發(fā)的生理作用

2.2.1 BR對細(xì)胞伸長和分裂的調(diào)控

BR能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長，BR處理可以促進(jìn)香蕉不定芽的發(fā)生，在玉米根系試驗中發(fā)現(xiàn)，BR能增強(qiáng)ATPase活性，導(dǎo)致H+-ATPase釋放H+酸化非質(zhì)體從而改變細(xì)胞的可塑性，細(xì)胞壁松弛，促進(jìn)生長[25]。BR對水稻細(xì)胞的伸長和分裂的調(diào)控研究方面，張海麗等[26]通過對水稻愈傷組織體積和細(xì)胞分布、懸浮系細(xì)胞形狀大小以及細(xì)胞骨架蛋白的分析研究發(fā)現(xiàn)，BR處理后，水稻細(xì)胞中有絲分裂基因CDC48（cell division cycle protein 48）及縮短細(xì)胞分裂周期基因CYCD2（cyclin D2）的代謝增強(qiáng)，且BR對水稻細(xì)胞伸長的調(diào)控作用中存在劑量效應(yīng)，低濃度的BR能夠促進(jìn)水稻細(xì)胞的伸長，高濃度抑制；利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對F-actin細(xì)胞骨架進(jìn)行水平分析，發(fā)現(xiàn)BR能夠促進(jìn)細(xì)胞微絲骨架F-actin的積累，在F-actin的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，BR對F-actin微絲骨架形成存在誘導(dǎo)作用，這表明BR是通過調(diào)控細(xì)胞分裂相關(guān)基因表達(dá)和誘導(dǎo)細(xì)胞骨架形成來調(diào)控細(xì)胞分裂及伸長。

2.2.2 BR對種子α-淀粉酶活性的影響

種子吸水后，生理代謝增強(qiáng)，同時需要大量的能量，這些能量來源于糖的分解代謝，淀粉作為種子中重要的能量儲存物質(zhì)，在種子萌發(fā)時的分解轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，一些谷物的干種子中不含有α-淀粉酶，α-淀粉酶在種子萌發(fā)時合成，紀(jì)秀娥等[27]研究發(fā)現(xiàn)BR處理能明顯增強(qiáng)α-淀粉酶的活性，隨濃度上升促進(jìn)作用下降。

2.2.3 BR與其他激素協(xié)同作用提高種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率

種子萌發(fā)過程受多種激素調(diào)節(jié)，激素通過作用于相應(yīng)的靶細(xì)胞受體，對細(xì)胞生長發(fā)育起到調(diào)控作用，種子萌發(fā)過程中脫落酸（ABA）主要誘導(dǎo)種子進(jìn)入休眠；赤霉素（GA）主要是解除休眠；GA在萌發(fā)的種子胚內(nèi)合成、釋放及轉(zhuǎn)運等途徑到達(dá)糊粉層，促進(jìn)糊粉層中不溶性糖及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性糖和氨基酸，為胚的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)種子萌發(fā)[28]；BRs與其他植物激素誘導(dǎo)種子萌發(fā)的機(jī)制有所不同。近年研究發(fā)現(xiàn)，BR存在一條蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控途徑，該途徑通過調(diào)節(jié)BR受體感知與BR受體抑制子的激活，轉(zhuǎn)錄因子的激活以及BR受體激酶和蛋白質(zhì)激酶活性的一系列反應(yīng)途徑，通過轉(zhuǎn)錄因子BESI等進(jìn)入細(xì)胞核來實現(xiàn)基因的表達(dá)[29]。擬南芥種子的萌發(fā)實驗發(fā)現(xiàn)MFT家族基因（Mother of FT and TELl，MFT）功能和BR信號傳導(dǎo)途經(jīng)有關(guān)，MFT家族基因存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)ABA機(jī)制[30]，表明BR促進(jìn)種子萌發(fā)可能是作為一種基礎(chǔ)的代謝信號或信號途徑參與家族基因的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而解除ABA在種子萌發(fā)過程中的抑制作用。紀(jì)秀娥等[27]進(jìn)行種子萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，較低濃度BR處理以后，小麥、玉米種子的發(fā)芽效果明顯，發(fā)芽率和發(fā)芽勢等也大大提高。在水稻細(xì)胞的伸長研究中，BR促進(jìn)細(xì)胞伸長具有雙重效應(yīng)，其伸長量隨著濃度的增加減小，呈負(fù)相關(guān)[26]。對2種不同溫度下黃豆的萌發(fā)及下胚軸、軸根伸長的研究發(fā)現(xiàn)，0.05 mg/L的油菜素內(nèi)酯處理后黃豆種子的萌發(fā)率高達(dá)93%[31]。在對羊草種子萌發(fā)的實驗中發(fā)現(xiàn)，在同等條件下表油菜素內(nèi)酯對野生羊草種子發(fā)芽率值提高幅度低于GA3，但更多的表現(xiàn)出明顯的正互作效應(yīng)，在2，4-表油菜素內(nèi)酯0.1 μg/g+GA3 200 μg/g組合比單獨使用單一激素提高20%～35%，同時也顯著的提高了發(fā)芽勢[32]。說明BR促進(jìn)種子萌發(fā)時與GA有協(xié)同作用，二者配合使用能更好的促進(jìn)種子萌發(fā)。

2.2.4 BR對植物萌發(fā)時下胚軸伸長的生理效應(yīng)

種子萌發(fā)以后長出根、莖、葉，形成幼苗。根據(jù)種子的下胚軸伸長和子葉是否留在土中可將幼苗形態(tài)建成分為子葉留土幼苗（如豌豆、蠶豆等）和子葉出土型幼苗（如棉花、油菜等）。從種子萌發(fā)到形成幼苗過程中，BR對種子萌發(fā)后下胚軸及胚根的伸長具有重要調(diào)控作用。黃豆萌芽研究發(fā)現(xiàn)，任何濃度BR對胚根伸長量都有一定的抑制作用，且抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)[33]，李凱榮等[34]用BR處理5種牧草種子，觀察其對種子萌發(fā)時胚根和下胚軸的影響，發(fā)現(xiàn)在適宜濃度時BR能夠有效促進(jìn)下胚軸伸長，同時也證明BR能有效地提高軸根比例及發(fā)芽率，說明BR對植物的胚軸及胚根的伸長存在一定生理效應(yīng)。從微觀角度研究發(fā)現(xiàn)，植物的生長和植物細(xì)胞形態(tài)建成等生理過程與微管骨架機(jī)械調(diào)節(jié)蛋白也存在一定關(guān)系。張謹(jǐn)[35]研究發(fā)現(xiàn)，BR信號調(diào)控植物下胚軸伸長需要微管骨架的參與，并在擬南芥中鑒定得到BRs信號通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子BZR2的一個靶基因MDP40（編碼微管的去穩(wěn)蛋白），通過體內(nèi)外生化分析發(fā)現(xiàn)MDP40可以被BRs受體激酶磷酸化，磷酸化修飾的MDP40對于參與BRs調(diào)控植物下胚軸伸長具有重要意義。水稻BR不敏感突變體d61（Osbril）和BR合成缺失突變體brd1，在細(xì)胞中微管排列紊亂[26]，外源施用BR后能夠促進(jìn)細(xì)胞微管的排列正常。這就證明了BR通過調(diào)控植物細(xì)胞的微管骨架的建成來促進(jìn)植物下胚軸伸長。張海麗等[26]研究證明，油菜素內(nèi)酯通過調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂過程中CDC48基因（cell division cycle protein 48）和縮短細(xì)胞周期的CYCD2（cyclin D2）基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞分裂伸長。以上研究結(jié)果表明，BRs促進(jìn)種子萌發(fā)和胚軸伸長至少存在2種作用途徑：BR通過調(diào)控細(xì)胞分裂基因，調(diào)控細(xì)胞分裂促進(jìn)下胚軸伸長；BRs信號傳遞過程中，轉(zhuǎn)錄因子BRI1通過磷酸化的MDP40調(diào)控微管動態(tài)、組織排列和穩(wěn)定性，進(jìn)而介導(dǎo)下胚軸伸長生長。

2.3 在逆境條件下BR對種子萌發(fā)的促進(jìn)效應(yīng)

主流植物逆境傷害學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)植物處于逆境條件下體內(nèi)的活性氧的代謝失調(diào)，體內(nèi)活性氧的積累會破壞原生質(zhì)膜，攻擊蛋白酶、DNA、RNA以及葉綠素等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡。種子在溫度高和低、水分多和少以及鹽漬等逆境條件下萌發(fā)時體內(nèi)的活性氧、自由基的含量增加，研究發(fā)現(xiàn)BRs能提高種子、幼苗在抗逆特性，其作用原理是BRs能提高種子貯藏和種子萌發(fā)時體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）以及過氧化氫酶（CAT）等酶的活性，并及時清除細(xì)胞內(nèi)活性氧和自由基[36]。

2.3.1 BR在低溫逆境條件下對種子萌發(fā)的作用

植物在逆境條件下體內(nèi)的自由基含量會增加，而作為消除自由基的相關(guān)酶活性在油菜素內(nèi)酯處理后大大提高，辣椒低溫脅迫萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，用一定濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯處理能夠解決15℃低溫下辣椒種子萌發(fā)困難，生長發(fā)育遲緩等問題[37]，這為保證早春和晚秋低溫條件下的育苗質(zhì)量提供了新的解決方法。植物抗寒性與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸多少以及膜質(zhì)流動性等因素有關(guān)，膜上不飽和脂肪酸越多，達(dá)到相變的溫度越低。膜的流動性取決于膜磷脂上脂肪酸的組成，高比例的磷脂合成能提高膜的耐寒性[38]。而低溫條件下，細(xì)胞中自由基、活性氧的含量升高，直接攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到不同程度地破壞，影響膜的整體抗寒能力；且低溫條件下，植物體內(nèi)的丙二醛含量升高，增加了植物細(xì)胞膜的通透性，膜內(nèi)離子外滲提高相變溫度。陳善娜等[39]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下BR-120 處理后的水稻體內(nèi)SOD和POX活性提高。這些酶在自由基的清除中起著重要作用。王炳奎等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用BR處理后對保持SOD活性和降低丙二醛含量方面的效果都有很大的提升，說明油菜素內(nèi)酯可提高種子在低溫條件下的萌發(fā)作用，一定條件下與它能提高植物體內(nèi)各種保護(hù)酶的活性以及降低丙二醛含量有關(guān)。

2.3.2 BR在鹽脅迫及干旱脅迫條件下對種子萌發(fā)的作用

在鹽脅迫下，植物細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞失水，甚至死亡。研究發(fā)現(xiàn)BL處理后能明顯降低高鹽脅迫對細(xì)胞核和葉綠體的傷害[41]，提高植物核酸和可溶性蛋白含量[42]。在茄子鹽漬抗性試驗中，BR處理顯著提高茄子種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等發(fā)芽指標(biāo)[43]，由此可知BR提高種子在鹽脅迫下種子萌發(fā)率與細(xì)胞可溶物的增加以及降低鹽脅迫對植物的傷害有關(guān)。玉米干旱脅迫下也有同樣效果，但對根的數(shù)量提高上基本沒有影響，主要是促進(jìn)平均根長、根干重、平均芽長、芽干重等萌芽期的指標(biāo)[44]，這也與早期BR提高植物抗逆性研究相一致。

3 結(jié)語

植物種子研究中，促進(jìn)種子萌發(fā)、提高種子萌發(fā)率的植物內(nèi)在機(jī)理研究一直都是研究的熱點。BR作為植物內(nèi)源激素的分子機(jī)理及生理效應(yīng)研究只有短短幾十年，但由于科研人員的不懈努力，現(xiàn)已成為作用機(jī)制較為清楚的植物激素之一。目前，對BR的來源、生理效應(yīng)、提高植物對外界抗逆性以及在果蔬、農(nóng)林方面的應(yīng)用等都有了相關(guān)研究，但對油菜素內(nèi)酯在植物種子萌發(fā)、幼苗細(xì)胞伸長與分裂階段的作用機(jī)理的研究還是初步階段，與IAA、ABA等內(nèi)源激素在種子萌發(fā)階段的分子作用機(jī)理研究有待深入挖掘；調(diào)控細(xì)胞伸長生長中是否存在雙重效應(yīng)的BR信號傳導(dǎo)途徑的分子機(jī)理研究以及提高逆境條件下種子萌發(fā)的作用原理研究也將作為理論結(jié)合實際應(yīng)用的重要橋梁不斷深入。

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