淡黃花百合花粉活力及其測(cè)定方法比較

劉偉+丁長(zhǎng)春+沐建華

摘要：用I-KI法、氯化三苯基四氮唑（TTC）法、離體萌發(fā)法連續(xù)7 d對(duì)淡黃花百合（Lilium sulphureum Baker）的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，I-KI法、離體萌發(fā)法、TTC法測(cè)定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異，由于I-KI法較離體萌發(fā)法簡(jiǎn)單、成本低、所需時(shí)間短，因此是快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異，這幾天都可以進(jìn)行雜交授粉，但從發(fā)育的角度考慮，以開花第2天授粉最佳。

關(guān)鍵詞：淡黃花百合;花粉活力;離體萌發(fā)法;TTC法;I-KI法

中圖分類號(hào)： S682.2+65.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0198-02

收稿日期：2014-06-03

基金項(xiàng)目：云南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2013Y582）;文山學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目（編號(hào)：09wsxk 02）。

作者簡(jiǎn)介：劉 偉（1977—），男，湖南祁東人，碩士，講師，從事植物學(xué)研究。E-mail：liuwei00780@126.com。

百合是世界五大切花之一，也是國(guó)內(nèi)重要的高檔花卉。我國(guó)野生百合種質(zhì)資源豐富，為培育百合新品種奠定了良好的種質(zhì)資源基礎(chǔ)[1]?；ǚ凼情_展雜交育種最基本也是最重要的材料，花粉活力大小對(duì)育種效果影響很大，授粉前對(duì)花粉活力進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要[2]。許多學(xué)者對(duì)不同植物的花粉活力測(cè)定方法進(jìn)行研究，常用的方法包括染色法、萌發(fā)法[3-7]。郝瑞娟等比較了亞洲百合、東方百合、麝香百合的部分栽培品種花粉活力的測(cè)定方法，認(rèn)為染色法簡(jiǎn)單，萌發(fā)法準(zhǔn)確，育種時(shí)應(yīng)將二者結(jié)合使用[8]。趙興華等對(duì)百合花粉生活力測(cè)定、貯藏方法進(jìn)行了研究[9]。張福平等研究了影響百合花粉活力的化學(xué)因素[10]。車代弟等對(duì)東方百合花粉萌發(fā)培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化[11]。尹恒等研究了麝香百合花粉發(fā)芽適宜培養(yǎng)基及最佳貯藏條件，認(rèn)為蔗糖濃度、硼酸濃度等對(duì)花粉萌發(fā)均有較大影響[12]。本研究以淡黃花百合花粉作為材料，用萌發(fā)法、染色法對(duì)淡黃花百合的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，目的在于獲取快速測(cè)定花粉活力的最佳方法，明確淡黃花百合花粉活力最高時(shí)期，在此基礎(chǔ)上確定雜交育種最佳授粉時(shí)間，旨在為提高淡黃花百合育種效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

將從野外采集和云南省文山市中藥材市場(chǎng)購買的淡黃花百合種球種植于文山學(xué)院生物園地，待其快綻放時(shí)，收集不同時(shí)期的新鮮百合花粉。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 每天早晨觀察百合花蕾期，待其開花前 1 d 09：00左右開始采集花粉，將花蕾輕輕剝開，用刀片切取 1/2 個(gè)花藥，用錫箔紙包裹，置于保鮮袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。每天在同一時(shí)間采集花粉并進(jìn)行試驗(yàn)。所采集的花粉均來自生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的同一植株，測(cè)量期間按時(shí)澆水，確保水分充足。

1.2.2 花粉活力測(cè)定

1.2.2.1 I-KI染色測(cè)定法[13] 取2 g KI溶于10 mL蒸餾水中，加入1 g I2待其全部溶解后，再加蒸餾水至200 mL，配好試劑后，貯于棕色瓶中備用。用解剖針挑取少量花粉置于載玻片上，加入1～2滴I2-KI溶液，輕輕蓋上蓋玻片放置1～2 min，置于低倍顯微鏡下觀察。凡染成藍(lán)紫色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。每處理3個(gè)玻片，每個(gè)玻片觀察5個(gè)視野，計(jì)算平均值。花粉活力計(jì)算公式如下：

花粉活力= （藍(lán)色花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%。

1.2.2.2 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色測(cè)定法[13] 用解剖針取少量花粉置于載玻片上，加1～2滴0.5% TTC溶液，蓋上蓋玻片。將裝片置于35 ℃恒溫箱中，15 min 后置于低倍顯微鏡下觀察，染成紅色的為生活力強(qiáng)的花粉，淡紅色的次之，無色者為沒有活力或不育的花粉。每處理3個(gè)玻片，每個(gè)玻片觀察5個(gè)視野，計(jì)算平均值?；ǚ刍盍τ?jì)算公式：花粉活力=（被染色的花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%。

1.2.2.3 離體萌發(fā)法[13] 配制0.01%硼酸、0.03% CaCl2、0.35 mol/L蔗糖、0.7%瓊脂的固體培養(yǎng)基，將配好的培養(yǎng)基置于錐形瓶滅菌，滅菌完成后待其凝固前用移液槍取100～150 μL滴于雙孔凹玻片處，用解剖針取花粉置于培養(yǎng)基中，將其放入培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿中事先放有濕濾紙），置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。在光學(xué)顯微鏡下，觀察3個(gè)玻片6個(gè)凹孔，每個(gè)凹孔觀察5個(gè)視野，離體培養(yǎng)后花粉管明顯伸長(zhǎng)的為有生活力的花粉，未伸長(zhǎng)的為沒有活力的花粉。萌發(fā)率計(jì)算公式：萌發(fā)率=（已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野，采用Excel 2003、SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 I-KI法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d至第3天，花粉活力不斷增強(qiáng)，第4天開始活力不斷降低，開花第3天花粉活力最高。開花后1～4 d花粉活力無顯著差異，維持在95%左右。開花前1 d花粉活力為78.97%，第5天花粉活力為82.53%。開花第6天、第7天花粉活力均低于50%，單花接近花謝期，明顯不適合進(jìn)行雜交授粉。由此可知，開花后1～4 d淡黃花百合花粉活力較高，最適合授粉，如果與其他百合雜交出現(xiàn)花期不遇，也可在此時(shí)期采集花粉進(jìn)行貯存。

2.2 TTC法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d花粉活力為70.63%，開花當(dāng)天花粉活力為73.57%，均較低;開花第2天至第4天花粉活力較高，第3天最高;開花第5天花粉活力為75.60%;第6天與第7天分別為43.50%、43.07%，已經(jīng)降至50%以下。開花前1 d、開花當(dāng)天及開花第5天均無顯著差異;開花第2、3、4天均無顯著差異;開花第6、7天無顯著差異。由此可知，花粉離體保存取花粉的最佳時(shí)期及雜交育種最佳授粉時(shí)間均為開花第2至第4天。endprint

表1 不同測(cè)定方法所測(cè)不同發(fā)育程度花粉活力

開放時(shí)間

（d）

花粉活力（%）

I-KI法 離體萌發(fā)法 TTC法

開花前1 d 78.97a 90.03a 70.63a

1 95.70b 86.70a 73.57a

2 95.40b 89.23a 91.20b

3 96.40b 97.13a 91.90b

4 94.27b 87.93a 84.90b

5 82.53a 75.10b 75.60a

6 48.13c 57.50c 43.50c

7 47.90c 39.57d 43.07c

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3 離體萌發(fā)法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

由表1可知，開花前1 d至開花第4天，淡黃花百合花粉活力變化不明顯，開花第3天花粉活力最高;開花第5天開始花粉活力下降較快，第7天活力降至50%以下。由此可知，為了提高雜交育種的成功率，開花前1 d至開花第4天都可以進(jìn)行授粉，開花第3天是最佳授粉時(shí)間，開花前1 d至開花第4天是離體保存最佳采集花粉時(shí)間。

2.4 3種不同測(cè)定方法比較

由表2可知，用3種不同方法測(cè)定淡黃花百合花粉活力由高到低依次為I-KI法>離體萌發(fā)法>TTC法。采用I-KI染色法測(cè)定的花粉活力與離體萌發(fā)法無明顯差異，這2種方法所得花粉活力與TTC染色法所得花粉活力差異極顯著。由于離體萌發(fā)法測(cè)定的花粉活力最接近真實(shí)值，因此離體萌發(fā)法被廣泛使用[14-16]。本試驗(yàn)中，離體萌發(fā)法與I-KI染色法所得花粉活力無顯著差異，說明I-KI染色法適用于淡黃花百合花粉活力的測(cè)定。鑒于離體萌發(fā)法比I-KI 染色法程序復(fù)雜、耗時(shí)多、成本高，I-KI 染色法操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短，快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力最佳方法為I-KI 染色法。

3 結(jié)論與討論

花粉活力對(duì)于研究花粉與柱頭的相互作用、基因庫的保持、不親和性與受精關(guān)系、生理調(diào)節(jié)對(duì)花粉萌發(fā)的影響等均有非常重要的意義。為了進(jìn)行雜交授粉，通常要早期采集、貯存花粉，以解決花期不一致、遠(yuǎn)距離雜交的問題，花粉活力直接

表2 3種不同測(cè)定花粉活力方法方差分析

測(cè)定方法 花粉平均萌發(fā)率（%）

I-KI法 79.91aA

TTC法 71.79bB

離體萌發(fā)法 77.90aA

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)系到育種效率[3]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，I-KI法、離體萌發(fā)法、TTC法測(cè)定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異，這2種方法都可用于淡黃花百合花粉活力的測(cè)定。趙統(tǒng)利等以卷丹百合為研究對(duì)象，認(rèn)為I-KI法不適合用于花粉活力的測(cè)定[16]。郝瑞娟等也認(rèn)為，萌發(fā)法比染色法能更準(zhǔn)確地反映花粉的真實(shí)活力[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異，由于I-KI法較離體萌發(fā)法簡(jiǎn)單、成本低、所需時(shí)間短，因此是快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異，這幾天都可以進(jìn)行雜交授粉，但從發(fā)育角度考慮，以開花第2天授粉最佳。

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