倪萌萌+許厚強(qiáng)+趙佳福+陳偉+桓聰聰+周迪

摘要：顯微操作針是顯微操作的必備工具，其制作的好壞直接影響到操作的成敗。介紹了利用拉針儀、斷針儀、磨針儀制備用于小鼠胚胎移植顯微操作的移卵針（moving pipettes）、注射針（injection pipettes）和持卵針（holding pipettes）的制作方法，以供實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān)鍵詞：顯微操作;移卵針;注射針;持卵針;制作方法

中圖分類號(hào)： Q-336 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0226-03

收稿日期：2014-05-19

基金項(xiàng)目：貴州省科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：黔科合重大專項(xiàng)字[2013]6008號(hào)）;貴州大學(xué)青年教師科研基金（編號(hào)：貴大自青基合字[2012]010號(hào)）

作者簡介：倪萌萌（1989—），男，安徽鳳陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖生物技術(shù)。E-mail： 237805700@qq.com。

通信作者：許厚強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾笄莘N質(zhì)資源保存與創(chuàng)新利用。Tel：（0851）8292183;E-mail：

近20年來，DNA顯微注射技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中基因轉(zhuǎn)移的重要手段。而顯微操作針是應(yīng)用于輔助生殖[1]、動(dòng)物克隆[2]、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備[3]和嵌合體動(dòng)物制備[4]等方面的重要工具之一。顯微操作的成功與否與顯微操作針制備的好壞密切相關(guān)。目前購買成品針用于顯微操作成本太高，許多領(lǐng)域的特殊操作用針只能通過人工拉制，因此，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室傾向于自制顯微操作針。目前大多選擇購買拉針儀、斷針儀和磨針儀等儀器設(shè)備，自行拉制顯微操作針，從而可以對(duì)顯微針的參數(shù)進(jìn)行精確的控制，獲得理想的實(shí)驗(yàn)用針。本研究通過日本尼康NT88-V3型倒置熒光顯微操作儀，總結(jié)出適合該設(shè)備系統(tǒng)的顯微操作針制備方法，以供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與材料

倒置熒光顯微操作儀（日本，尼康NT88-V3），水平拉針儀（日本，Narishige PN-30），磨針儀（日本，Narishige EG-44），斷針儀（日本，Narishige MF-900），微電極玻璃毛細(xì)管（外徑：1.00 mm，內(nèi)徑：0.70 mm）和微電極玻璃毛細(xì)管（外徑：1.00 mm，內(nèi)徑：0.66 mm），眼科鑷。

1.2 方法

1.2.1 制針用毛細(xì)玻璃管的準(zhǔn)備 購買經(jīng)過硅化的毛細(xì)玻璃管時(shí)，需檢查是否經(jīng)過滅菌處理，多數(shù)商家提供的毛細(xì)玻璃管不用滅菌，拆開包裝就可直接使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)拆，避免過早打開積累灰塵。但有些廠家的毛細(xì)玻璃管出廠前僅用75%乙醇處理，需要經(jīng)過以下處理才能使用：4% HCl浸泡 24 h，除去沾在管壁的污質(zhì)，自來水沖洗至中性，用去離子水沖洗后浸泡0.5 h，烘干，75%乙醇浸泡24 h，去離子水沖洗，烘干，包裝后160 ℃干烤滅菌2.5 h[5]。

1.2.2 移卵針的制作 雙手持住一根10 cm的玻璃管（外徑：1.00 mm，內(nèi)徑：0.66 mm）兩端，將玻璃管的中部置于乙醇燈外焰，邊旋轉(zhuǎn)邊加熱，當(dāng)玻璃管變軟時(shí)，迅速水平拉伸，回折至拉細(xì)處斷開，并在乙醇燈外火焰上快速拋光移卵針尖端 1～2 s，在體視顯微鏡下觀察針的尖端是否光滑，是否保持一定的內(nèi)外徑。理想的移卵針內(nèi)徑在150～200 μm之間為宜。使用時(shí)與口吸硅膠管連接。

1.2.3 注射針的制作 注射針的制備分5步：拉、斷、磨、拔、彎。

拉：使用水平拉針儀拉制。設(shè)定好拉針儀的3個(gè)參數(shù)：熱度、主磁力、副磁力，戴一次性乳膠手套將微電極玻璃毛細(xì)管（外徑：1.00 mm，內(nèi)徑：0.70 mm）置于拉針儀“Ω”形鉑絲的中央，并擰緊兩邊的螺絲固定好。運(yùn)行參數(shù)，將拉出的針坯用眼科鑷放置在準(zhǔn)備好的塑料泡沫針板上，待用。

斷：使用斷針儀水平斷針。首先在100倍視野下，將電熱絲及事先制作好的玻璃珠調(diào)至最清晰的位置，將拉好的針插入持針器內(nèi)，并將其水平放置在支撐架上，在鏡下調(diào)清針的位置，水平調(diào)節(jié)針的位置使其斷針處的位置位于玻璃珠的正上方，踩下踏板接通電源，緩慢調(diào)節(jié)溫度旋鈕使鉑金絲和玻璃珠微微發(fā)紅時(shí)（約45 ℃），將針靠近并緊貼，此時(shí)，針會(huì)有微小的擺動(dòng)，說明針與玻璃珠開始熔化粘連，松開腳踏板，這時(shí)電熱絲和玻璃珠冷卻會(huì)產(chǎn)生向下的拉力將針斷開。此時(shí)針口將被斷成一個(gè)斷面，要求斷面垂直、平滑、干凈（圖1、圖2）。

磨：用磨針儀滴水磨針。將斷好的針插入持針器里，擰緊螺絲后固定在磨針儀上，調(diào)好角度45°～50°，調(diào)節(jié)升降旋鈕，使持針器緩緩下降至針尖與磨石的平面剛好接觸，在磨針儀的注射器內(nèi)加適量的去離子水，使之均勻滴下，調(diào)節(jié)磨石的轉(zhuǎn)

速使水滴不被迅速甩掉為宜，這樣磨出的針比較干凈，6 min磨好1根。

拔：使用斷針儀垂直拔尖。首先在100倍視野下，將鉑金絲和玻璃珠調(diào)至最清晰的位置，將磨好的針插入持針器內(nèi)，并將其垂直放置在支撐架上，在鏡下調(diào)清針并使針的位置位于玻璃珠的正上方，磨面正對(duì)操作者，踩下踏板接通電源，緩慢調(diào)節(jié)溫度旋鈕使鉑金絲略呈橘紅色（約50 ℃），緩慢下降針尖端，使其靠近玻璃珠并與之接觸，待針尖一接觸玻璃珠就迅速將針向上撤離，此時(shí)針尖被拉成一個(gè)短而銳利的尖，以利于穿刺進(jìn)入卵母細(xì)胞胞漿膜。

彎：使用斷針儀水平彎針。把持針器調(diào)成水平放置，調(diào)清視野，針在玻璃珠的上方一段距離，踩下腳踏板接通電源，緩緩調(diào)節(jié)溫度，直至鉑金絲和玻璃珠呈橘黃色（約60 ℃），將玻璃珠緩緩向上面靠近玻璃針，同時(shí)觀察鏡中的標(biāo)尺，達(dá)到所需要的角度（15°～20°）時(shí)，立即松開腳踏板，即成所需角度的注射針（圖3、圖4）。

1.2.4 持卵針的制作 持卵針制備分4步：拉、斷、燒、彎。

拉：同注射針拉針。

斷：同注射針斷針。endprint

燒：將已斷好針的斷面豎直或水平接近玻璃珠，相距 10 μm 左右，不可相互接觸，踩下踏板接通電源，并緩緩調(diào)節(jié)電熱絲的溫度（約60 ℃），鉑金絲和玻璃珠變橘黃色時(shí)，針管口內(nèi)徑慢慢回縮，用目鏡中的顯微標(biāo)尺觀察尖端內(nèi)徑變化情況，直至內(nèi)徑為15～20 μm時(shí)松開腳踏板停止加熱，將溫度旋鈕調(diào)回“0”位置。此時(shí)持卵針內(nèi)徑大小合適，表面光滑（圖5、圖6）。

彎：同注射針彎針一樣，角度有所差別，一般在20°～30°較為適宜。

1.2.5 針的保存 若針管中有碎屑或灰塵，可用10%氫氟酸溶液沖洗5次，再用去離子水沖洗5次。將制作好的針存

放于75%乙醇清洗過的塑料盒中，固定存放。使用前用紫外線照射30 min 殺菌消毒。

2 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因小鼠的制作過程中包括許多關(guān)鍵步驟，而且每一步又有很多因素對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠制備的成敗產(chǎn)生影響，顯微注射是其中核心部分，除了顯微操作的速度、顯微操作的方法、培養(yǎng)液的成分、培養(yǎng)環(huán)境的溫度和pH值的穩(wěn)定等因素[6]外，拉針儀、斷針儀相關(guān)參數(shù)設(shè)置，斷針、磨針?biāo)扇〉牟煌绞郊帮@微操作針拉制的好壞都會(huì)影響轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的成敗。

2.1 拉針儀相關(guān)參數(shù)設(shè)置對(duì)針坯的影響

筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用PN-30水平拉針儀（日本，Narishige）拉制顯微操作針，該儀器包括：heater（熱度）、magnet sub（副磁力）、magnet main（主磁力）3個(gè)參數(shù)，根據(jù)制備針的不同選擇不同的參數(shù)組合。熱度主要是對(duì)玻璃管進(jìn)行加熱，熱度越高，針拉得越快、針尖越長、針尖的口徑越細(xì)，數(shù)值范圍一般在70～85之間。主磁力決定針尖的細(xì)度，數(shù)值越高針尖越細(xì)，數(shù)值范圍一般在65～100之間。副磁力是決定針尖細(xì)部的長度，數(shù)值越高針尖口長度越長，數(shù)值范圍一般在22～57之間。這些參數(shù)是相互影響的，拉制針時(shí)調(diào)節(jié)一個(gè)參數(shù)其余固定，找到一個(gè)最合適的參數(shù)，并固定下來。如熱度為85 ℃、主磁力為67.2、次磁力為23時(shí)，可拉制出長15～20 mm、內(nèi)徑10 μm 左右的操作針。

2.1.1 鉑金圈的形狀對(duì)針坯的影響 拉針儀上的鉑金圈很重要，其形狀如“Ω”形，表面要光滑呈圓弧形，如出現(xiàn)任何不規(guī)則的形狀都會(huì)影響拉制針的形狀。所以用眼科鑷取出拉制好的針坯時(shí)，要特別小心，不可觸碰到鉑金圈，避免外力改變其形狀，導(dǎo)致后續(xù)的工作無法正常進(jìn)行。放置毛細(xì)玻璃管時(shí)，要固定在鉑金圈的中央，不接觸到其任何一邊，固定時(shí)要擰緊螺絲旋鈕，同時(shí)同向旋鈕，防止拉制時(shí)一邊沒固定好拉不斷毛細(xì)管，從而導(dǎo)致受熱不均，拉力不均，拉不出高質(zhì)量的針坯，此時(shí)的針尖端易彎翹、扭曲，影響使用。

2.1.2 鉑金絲上玻璃珠的位置、大小對(duì)注射針和持卵針拉制的影響 鉑金絲上玻璃珠的最佳位置是向上有個(gè)凸起、外徑80 μm左右為宜（圖7），玻璃珠太大或太小都易使針彎而不斷。玻璃珠往往在煅燒時(shí)容易熔化下垂，在鉑金絲下方出現(xiàn)凸起（圖8）或者鉑金絲上沒有玻璃珠（圖9），這2種情況都是不合適的，在斷針、燒針、彎針時(shí)容易受熱不均，導(dǎo)致針尖端的不平、針管的變形、針彎而不斷等，拉不出質(zhì)量好的針胚，影響使用。

2.2 斷針儀上不同處理方式和溫度選擇對(duì)顯微操作針拉制的影響

2.2.1 斷針方式及溫度控制對(duì)注射針和持卵針拉制的影響 使用斷針儀斷針方式分為水平斷針和垂直斷針2種，經(jīng)實(shí)踐比較，水平斷針效果優(yōu)于垂直斷針，垂直斷針因看不見玻璃珠和針管的接觸情況，往往會(huì)出現(xiàn)視野內(nèi)斷得較直，但是旋轉(zhuǎn)至水平后卻發(fā)現(xiàn)針是彎的。相比之下水平斷針就能避免這樣的問題，它能很好地看清玻璃珠與針管的接觸情況，在視野里能一目了然地觀察斷針情況。 較適宜斷針的溫度應(yīng)為鉑金絲和玻璃珠微微發(fā)紅時(shí)（約 45 ℃）。溫度過高易使針管熔化粘連在玻璃珠上，而且斷的針尖端容易不平整、扭曲;溫度過低則無法把針拉斷。

2.2.2 拔尖的方式及溫度對(duì)注射針拉制的影響 拔尖采用水平拔尖或垂直拔尖皆可，要求針尖磨面正對(duì)操作者，針與玻璃珠要完全垂直，這樣拔出的尖才不會(huì)彎斜。 較適宜拔尖的溫度應(yīng)為鉑金絲和玻璃珠略呈橘紅色（50 ℃左右）。溫度過高針尖拔得太細(xì)長、針口易皺縮熔化乃至封口;溫度太低，針尖拔得很短、不銳利乃至拔不出尖，還易把針拔斷。

2.3 磨針方式對(duì)注射針拉制的影響

使用磨針儀磨針的方式有2種：一種是加水磨針，一種是不加水磨針。經(jīng)過實(shí)踐比較，加水磨針效果優(yōu)于不加水磨針。不加水磨針，時(shí)間較快，但是針管內(nèi)會(huì)粘上玻璃碎屑和灰塵，需用氫氟酸和超純水清洗才能使用，比較麻煩;加水磨針，時(shí)間相對(duì)慢點(diǎn)，但磨出的針較干凈、可直接使用。

2.4 顯微操作針的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1 注射針 拉制的針應(yīng)長5～8 cm，才能保證有適宜的注射用尖端。最好的注射針尖端的直徑應(yīng)小于1 mm，內(nèi)徑在10～12 μm之間。在光學(xué)顯微鏡下無法看清，如果能在光學(xué)顯微鏡下看清注射針尖端的開口，則說明針尖端開口直徑過大，注射針開口太大則刺入原核就會(huì)很困難，注射后更多的受精卵會(huì)裂解;但是，如果開口太小，粉塵堵塞針尖的可能性就會(huì)增大。哪種大小的針最佳，必須要試不同規(guī)格的注射針以確定哪一種是最合適的。另外一個(gè)重要的參數(shù)即針尖部的錐度，這可以通過測(cè)量針的距尖端固定距離處的直徑來估計(jì)。在距注射針尖端50 μm處的直徑應(yīng)為10～15 μm或更小。注射針的肩部到尖端的距離應(yīng)為5～8 mm。Jeffrey等研究表明8 mm是最佳的[7]。如果這個(gè)距離過小，注射針的肩部會(huì)使針的尖端在注射小室的底部無法固定，從而影響注射的效果;如果針太長，注射時(shí)注射針在穿過厚的礦物油層時(shí)容易不穩(wěn)固而彎曲，從而導(dǎo)致注射失敗[8]。

2.4.2 持卵針 管尖端外徑和卵母細(xì)胞直徑相差不應(yīng)超過10～30 μm。管口中央與卵母細(xì)胞中央應(yīng)在同一水平線上，這樣在固定卵母細(xì)胞時(shí)就不會(huì)發(fā)生垂直方向上卵母細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。管口外徑不宜太大，否則卵母細(xì)胞不易按要求固定。在被固定前，垂直方向上的位置變動(dòng)會(huì)導(dǎo)致極體位置變化。如果管口外徑太小，在去核時(shí)卵母細(xì)胞往往擺動(dòng)，影響操作。持卵針內(nèi)徑開口在中間為最佳。要做到這一點(diǎn)，必須保持?jǐn)喽似烬R。理想形狀的固定針應(yīng)是外徑100～120 μm、內(nèi)徑10～20 μm，兩邊對(duì)稱并光滑[9]。endprint

2.4.3 移卵針 針管斷面要求平齊、均一、光滑。拉制好的移卵針的外徑應(yīng)為150 μm，略大于受精卵的透明帶直徑。

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