喬毅+沈輝+萬夕和+戚原野+王李寶

摘要：從患有尾鰭基部潰爛病的人工養(yǎng)殖黑鯛（Acanthopagrus schlegel）病灶處分離到1株優(yōu)勢菌LSHD-1，經(jīng)人工感染試驗證實為引起黑鯛尾鰭基部潰爛病病原菌。細菌形態(tài)學觀察、生理生化等表觀、生物學試驗、細菌16S rRNA基因同源性檢索和系統(tǒng)發(fā)育學分析結(jié)果表明，LSHD-1與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）的吻合程度最高，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與殺魚假交替單胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）聚為1支。擴增細菌毒力基因，分析其潛在致病性，發(fā)現(xiàn)LSHD-1攜帶黏附侵襲位點基因（ail）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）、抗金屬蛋白酶基因（ast）。藥敏試驗結(jié)果顯示，LSHD-1對氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、氟苯尼考高度敏感，對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環(huán)素表現(xiàn)出較強耐藥性。

關(guān)鍵詞：黑鯛;假交替單胞菌;潰爛病;系統(tǒng)發(fā)育;毒力基因;藥物敏感性

中圖分類號： S941.42 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0229-04

收稿日期：2015-01-04

基金項目：江蘇省水產(chǎn)三新工程項目（編號：D2013-5-2） 。

作者簡介：喬 毅（1987—），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治技術(shù)研究。 E-mail：qiaoyishou@yeah.net。

通信作者：萬夕和，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治技術(shù)研究。 E-mail：wxh1708@163.com。

假交替單胞菌屬是1995年Gauthier等根據(jù)細菌16S rRNA序列發(fā)現(xiàn)有別于假單胞菌（Pseudomonas）和交替單胞菌（Alteromonas）的一個新屬[1]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多個種。該菌廣泛分布于海洋沉積物以及共附生在一些海洋動植物中。假交替單胞菌能產(chǎn)生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物質(zhì)等與致病相關(guān)的多種物質(zhì)[2]，是一類條件致病菌。研究表明，假交替單胞菌可感染海水養(yǎng)殖藻類和養(yǎng)殖動物等，引起藻類溶藻、綠斑、黃斑[3-5]等，養(yǎng)殖動物皮膚潰爛[6]等疾病。 黑鯛（Acanthopagrus schlegel）屬于鱸形目鱸亞目鯛科魚類，主要分布在西太平洋區(qū)，在我國沿海均有分布，是海水魚養(yǎng)殖主要品種之一。近年來，江蘇沿海地區(qū)黑鯛在養(yǎng)殖過程中經(jīng)常發(fā)生皮膚潰爛，并出現(xiàn)不同程度的死亡，給黑鯛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來嚴重威脅。2012年4月，江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心人工養(yǎng)殖黑鯛過程中發(fā)生皮膚潰爛，并出現(xiàn)一定規(guī)模的死亡。本試驗從患病魚體分離到1株優(yōu)勢菌LSHD-1，對該菌進行了鑒定和毒力基因的研究，并進行了藥物敏感性試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

試菌株LSHD-1，分離自江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心的池塘養(yǎng)殖患皮膚潰爛病黑鯛，該菌株已通過回復(fù)感染證實為該病的病原菌。

2216E培養(yǎng)基、細菌微量生化鑒定管、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）、質(zhì)控菌（大腸桿菌ATCC25922）及藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司;Premix Taq酶、DNA marker購自TaKaRa公司;引物（16S rRNA，毒力基因）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 用接種環(huán)挑取少量細菌在載玻片上涂片固定，革蘭氏染色，油鏡觀察形態(tài)。挑取單菌落細菌用海水制成菌懸液，吸取1滴置于銅網(wǎng)膜上，通過醋酸鈾染色，日立H-300型透射電子顯微鏡觀察。

1.2.2 生理生化試驗 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《Bergeys Manual of Determinative Bacteriology》進行生理生化試驗。

1.2.3 細菌16S rRNA基因擴增 挑取單菌落于裝有 100 μL 滅菌去離子水的1.5 mL EP管中，煮沸10 min，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，上清即為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎猛ㄓ靡飻U增16S rRNA基因序列與測序，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物1492R（5′-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3′）。25 μL反應(yīng)體系：12.5 μL Premix Taq酶，正、反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min;94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán);72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳（120 V，35 min）檢測目的片段（約1 500 bp）后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用National Center for Biotechnology Information（NCBI）數(shù)據(jù)庫中blast對LSHD-1細菌16S rRNA序列進行相似性比較。使用ClustalX2.0軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得序列相似性較高的序列進行多序列比對，通過MEGA4（molecular evolutionary genetics analysis，MEGA）軟件采用鄰接建樹法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過Bootstrap法（1 000次）檢驗。

1.2.5 毒力基因檢測 通過PCR對LSHD-1菌黏附侵襲位點基因（ail）、耐熱腸毒素基因（ystB）、黏附素基因（yadA）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、氣溶素基因（aerA）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）以及抗金屬蛋白酶基因（ast）進行擴增。擴增條件：ail、ystB、yadA、virF、intB按照94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 變性45 s、退火45 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸40 s，35個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。aerA、hlyA、ahpA、altA、ast基因94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s、退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。endprint

表1 檢測的毒力基因引物序列及反應(yīng)條件

基因名稱 引物序列（5′→3′） 長度

（bp） 退火溫度

（℃）

Ail[7] F：TAATGTGTACGCTGCGAG;R：GACGTCTTACTTGCACTG; 351 50

ystB[7] F：CTTCAGATACTGGTGTCGCTGT;R：ATGCCTGACTAGAGCGATATCC 200 56

yadA[7] F：GGCAGAACAGCAGTCAGACATA;R：GGTGAGCATAGAGAATACGTCG 800 56

virF[7] F：GTACATTAGGCCAAGAGACG;R：GCAACATACCTCACAACACC 561 45

intB[7] F：TGCGCCATGCGGTCCATC;R：GGTGCATAAGATTCTCGG 714 50

aerA[8] F：CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA;R：ACGAAGGTGTGGTTCCAGT 309 57

hlyA[9] F：TGACAGGCAAGTAGAATAACGC;R：TGTCCGCTTTCCACTCCC 1 815 53

ahpA[10] F：GTTAGGCGTTGGCAATCTCG;R：CGCTGGAGTAGGAGGAACG 874 60

altA[11] F：ATCGTCAGCGACAGCTTCTT;R：CTCATCCCTTGGCTTGTTGT 442 58

ast[12] F：TGACCCAGTCCTGGCACGGC;R：GCTGATCGATCACCACCAGC 504 57

1.2.6 藥物敏感性試驗 選擇磺胺異唑、強力霉素、氧氟沙星、青霉素G、恩諾沙星、新霉素、頭孢曲松、四環(huán)素、紅霉素、諾氟沙星、氟苯尼考藥敏試紙片對LSHD-1進行敏感性試驗，采用世界衛(wèi)生組織推薦的K-B紙片瓊脂擴散法進行，結(jié)果按敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）報告[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌形態(tài)學特征

LSHD-1菌落在2216E瓊脂平板上為淺黃色，凸透鏡狀，表面光滑濕潤有光澤，邊緣完整，不透明，圓形。革蘭氏染色陰性，呈短桿狀（圖1）。負染后電鏡觀察，菌體呈短桿狀，極端單鞭毛（圖2）。

2.2 生理生化特征

LSHD-1菌氧化酶試驗陽性，L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸和L-色氨酸反應(yīng)陰性（表2），結(jié)合伯杰氏手冊，該生理生化結(jié)果與假交替單胞菌基本符合。

2.3 分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學分析

PCR擴增LSHD-1菌16S rRNA基因獲得1條清晰的條

表2 LSHD-1生理生化試驗

反應(yīng)（酶） 結(jié)果 反應(yīng)（酶） 結(jié)果

鳥氨酸脫羧酶 - 吲哚（產(chǎn)生） -

精氨酸雙水解酶 - N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 +

賴氨酸脫羧酶 - β-半乳糖苷酶 -

脲酶 - 葡萄糖（產(chǎn)酸） -

L-阿拉伯糖醇（產(chǎn)酸） - 蔗糖（產(chǎn)酸） -

半乳糖羧鹽（產(chǎn)酸） - L-阿拉伯糖（產(chǎn)酸） -

5酮基-葡萄糖酸（產(chǎn)酸） - D-阿拉伯醇（產(chǎn)酸） -

肢酶 - α-葡萄糖苷酶 +

酚紅（產(chǎn)酸） - α-半乳糖苷酶 -

β-葡萄糖苷酶 + 海藻糖（產(chǎn)酸） -

甘露醇（產(chǎn)酸） - 鼠李糖（產(chǎn)酸） -

麥芽糖（產(chǎn)酸） - 肌醇（產(chǎn)酸） -

側(cè)金盞花醇（產(chǎn)酸） - 纖維二糖（產(chǎn)酸） -

帕拉金糖（產(chǎn)酸） - 山梨醇（產(chǎn)酸） -

β-葡萄糖酸苷酶 - 麥芽糖苷酶 -

丙二酸 - L-天冬氨酸芳胺酶 +

帶，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)為1 438個堿基的基因片段，將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行blast分析對比，發(fā)現(xiàn)LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種的同源性最近，達99%。將測得序列與GenBank中已登錄的16S rRNA序列進行匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種聚為1支（圖3）。

2.4 毒力基因檢測結(jié)果

PCR擴增LSHD-1細菌毒力基因，經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)：altA、ail、intB、ahpA、ast、virF、hlyA基因（圖4、圖5）出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶，其中絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）條帶最為清晰，altA、intB、virF條帶比較清晰，ail、ast、hlyA條帶相對較弱。

2.5 藥物敏感性試驗

藥敏試驗結(jié)果表明，LSHD-1菌對氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松、諾氟沙星、氟苯尼考敏感;對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環(huán)素表現(xiàn)出耐藥;磺胺異唑和青霉素G對LSHD-1菌的抑菌效果較差（表3）。

3 討論

假交替單胞菌是海洋中常見的細菌，隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，假交替單胞菌受到廣泛的關(guān)注和研究。目前，日本有關(guān)

于假交替單胞菌引起海帶（Laminaria）孢子體紅點病[14]和孔爛癥[15]的報道，我國也有假交替單胞菌引起條斑紫菜（Porphyrae yezoensis）綠斑病[4]和黃斑病[5]的報道;Pujalte等從患病的海鱸體內(nèi)分離到1株P(guān)seudoalteromonas undina，試驗發(fā)現(xiàn)其毒性較弱，但是在養(yǎng)殖環(huán)境惡化時引起金頭鯛和海鱸患病[16];國內(nèi)大量研究表明，假交替單胞菌可引起刺參（Apostichopus japonicus）腐皮病[17-19]、潰瘍病[20]等;喬遷等報道假交替單胞菌引起七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）皮膚潰爛[21];白雪松等從群體死亡日本對蝦（Penaeus japonicus）蚤狀幼體中分離到1株致病菌，經(jīng)鑒定為Pseudoalteromonas lipolytica[22]。本試驗從患病黑鯛病灶處分離到1株優(yōu)勢菌LSHD-1， 革蘭氏染色和透射電鏡觀察結(jié)果與假交替單胞菌endprint

表3 LSHD-1藥物敏感性試驗結(jié)果

藥敏試紙

名稱 藥物含量

（μg/片）

抑菌圈大?。╩m）

ATCC25922 LSHD-1

敏感性

磺胺異唑 300 24.6 0 R

強力霉素 30 18.4 8.0 R

氧氟沙星 5 31.5 23.4 S

青霉素G 10 15.7 0 R

恩諾沙星 15 38.0 26.6 S

新霉素 30 23.5 16.7 I

頭孢曲松 30 34.0 27.9 S

四環(huán)素 30 21.5 13.5 R

紅霉素 15 35.6 15.8 I

諾氟沙星 10 24.3 18.7 S

氟苯尼考 30 34.6 22.4 S

的特征基本一致;根據(jù)生理生化表型特征，LSHD-1菌與假交替單胞菌相似度最高;另外，LSHD-1細菌的16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過blast同源性檢索，基因序列與假交替單胞菌殺魚亞種的同源性最高，達到99%，從基因系統(tǒng)發(fā)育樹來看，LSHD-1與假交替單胞菌殺魚亞種聚為1支。綜合LSHD-1的形態(tài)學特征、生理生化和分子生物學鑒定結(jié)果，認為LSHD-1為假交替單胞菌殺魚亞種。

黑鯛在養(yǎng)殖過程中，相關(guān)報道過有擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus）引起的幼魚腹水病[23]、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）[24]與遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）[25]引起的大規(guī)模死亡。假交替單胞菌殺魚亞種感染黑鯛的研究未見報道，毒力人工回感試驗結(jié)果表明，該株菌為引起黑鯛尾鰭基部潰爛病的病原菌;通過擴增LSHD-1菌的毒力基因，結(jié)果檢測到黏附侵襲位點基因（ail）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌體整合酶基因（intB）、溶血素基因（hlyA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）、腸毒素基因（altA）、抗金屬蛋白酶基因（ast）。ail基因能夠編碼對宿主產(chǎn)生高度黏附并保護細菌不被宿主免疫系統(tǒng)殺滅的小分子黏附蛋白[26]，目前，ail基因在小腸耶爾森氏菌中研究較多[7，27-28]，有學者甚至認為，可將ail基因作為小腸耶爾森氏菌致病性指示基因[29];ahpA基因是細菌重要的致病基因之一，其主要在病原入侵過程中通過活化毒力因子間接發(fā)揮作用[30]，張璐等利用缺失突變法構(gòu)建遲緩愛德華氏菌ahpA基因突變菌株，通過與野生菌株的侵染試驗的比較，認為ahpA基因?qū)t緩愛德華氏菌前期侵染宿主有關(guān)[31]，朱大玲等研究表明，ahpA基因陽性的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為有毒菌[32];hlyA基因是多數(shù)致病細菌的常見基因，關(guān)于其在致病過程中所起的作用，付喬芳等認為，hlyA基因與嗜水氣單胞菌的致病力關(guān)系不大[33]，但黃鈞等發(fā)現(xiàn)攜帶hlyA基因的氣單胞菌致病力增強[34];virF基因是編碼毒力基因的調(diào)控因子[35]，在細菌致病性中起著重要作用，altA、ast基因在已有報道中證實與致病性關(guān)系不大[33]。本試驗還擴增到intB基因，與茍小蘭等的試驗結(jié)果[7]一致，說明LSHD-1染色體上存在高致病性毒力島。綜上可以推斷，本試驗分離的致病性殺魚假交替單胞菌的致病力可能主要由ail、ahpA、virF、intB基因決定。毒力基因的量、毒力基因的表達機理以及毒力基因間的相互作用與致病性的關(guān)系非常復(fù)雜，引起黑鯛的致病機制尚需進一步研究。

LSHD-1藥物敏感性試驗結(jié)果與喬遷等的研究結(jié)論[21-22]基本一致，氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、氟苯尼考對LSHD-1有較好的抑菌效果;該菌對磺胺異唑、強力霉素、青霉素G、四環(huán)素表現(xiàn)出較強耐藥性。但是總體藥物敏感性比淡水菌敏感，這可能是因為海水養(yǎng)殖抗菌藥物使用的頻率不高，細菌在沒有抗菌素環(huán)境壓力下保持了較高的藥物敏感性。該菌的藥物敏感性試驗結(jié)果可為防治該菌引起的水生動物疾病提供借鑒和參考。

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