溫青娜，周玲玲，申 紅，楊菊鳳，林祥群

（1.河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.廣東中大南海海洋生物技術(shù)工程中心有限公司，廣東廣州 510330；3.石河子大學(xué)，新疆石河子 832003；4.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；5.石河子職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院，新疆石河子 832003）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬的一種接觸性病毒性傳染病，典型癥狀為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎增多，仔豬主要為呼吸困難、高死產(chǎn)率等特征。自我國(guó)首次分離到PRRSV以來(lái)，該病先后在國(guó)內(nèi)的多個(gè)省市暴發(fā)和流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為危害當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一［1］。PRRSV有歐洲型、美洲型毒株。起初，歐洲型只發(fā)生在歐洲，而美洲型則只限制在亞洲和北美。但是近年來(lái)，PRRSV打破了原有地理因素的限制，在歐洲、北美和亞洲地區(qū)，歐洲型及美洲型PRRSV已經(jīng)被同時(shí)監(jiān)測(cè)到［2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)也有歐洲型PRRSV發(fā)病的報(bào)道［3］。此外，也有人們從組織病料中分離出疑似歐洲型PRRSV疫苗株的報(bào)道［4］。國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)中歐洲型PRRSV的陽(yáng)性檢出加劇了我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征的鑒別與防控難度。美洲型和歐洲型PRRSV的基因序列同源性不是很高，但二者在基因組結(jié)構(gòu)組成、功能和生物學(xué)特征等方面均具有一致性［4］。目前，國(guó)內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合征毒株主要是以美洲型為主，經(jīng)典毒株與高致病性變異毒株并存，同時(shí)歐洲型也有感染，且呈上升趨勢(shì)［5］。目前國(guó)內(nèi)尚未有鑒別檢測(cè)不同型別PRRSV的報(bào)道。本研究根據(jù)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理，建立一種快速鑒別美洲型、歐洲型和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)方法，針對(duì)豬群中的不同型別的PRRSV進(jìn)行檢測(cè)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及疫苗 豬輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株（RN）來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌株保藏管理中心；豬乙型腦炎活疫苗（SA-14-14-2株）購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）購(gòu)自廣東大華動(dòng)物保健品股份有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征疫苗（CH-1R株）購(gòu)自上海諾科生物藥品有限公司；豬瘟（CSFV）活疫苗購(gòu)自廣東永順生物制藥有限公司；豬口蹄疫O型滅活疫苗（O2K／93株＋OS／99株）購(gòu)自新疆天康；豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗（TEGV＋PEDV）購(gòu)自上海海利生物藥品有限公司；豬腹瀉三聯(lián)疫苗（TGEV＋PEDV＋RN）購(gòu)自河南省寶依特生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 Premix ExTaqTM（Probe qPCR）、ExTaq?、Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD18-T Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PfuTaqDNA Polymeras購(gòu)自Sigma公司；Trizol＠Reagent購(gòu)自In Vitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物與探針的設(shè)計(jì) 用Bioedit軟件對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)布的60株歐洲型和60株美洲型PRRSV N基因序列，97株美洲型和30株歐洲型PRRSV的M基因序列，30株高致病性PRRSV和30株普通PRRSV的NSP2基因序列，進(jìn)行同源性分析，根據(jù)各基因保守區(qū)，用 Primer express 3.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針（表1），由英俊公司合成。

1.2.2 SOE PCR引物的設(shè)計(jì) 以上述歐洲型PRRSV的擴(kuò)增片段為目的基因，應(yīng)用Primer primer5.0進(jìn)行SOE PCR引物設(shè)計(jì)，OU1和OU2兩條引物之間有16個(gè)～23個(gè)堿基序列反向互補(bǔ)，引物由英俊公司合成。

表1 本研究所用引物信息Table 1 The information of primers used in the study

1.2.3 歐洲型PRRSV 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用SOE PCR技術(shù)人工合成歐洲型PRRSV的目的基因片段。SOE PCR擴(kuò)增體系（50μL）：1×Pfu buffer，dNTPs 0.2mmol／L，PfuTaqDNA Polymeras 1.25U，OU1和 OU2各0.4μmol／L。反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后在產(chǎn)物中加入Taq5U，dNTPs 0.2mmol／L，72℃30min?；厥誗OE PCR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，確定為歐洲型PRRSV目的基因，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD 260nm，換算成摩爾濃度后，稀釋至1×106copies／μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 美洲型和高致病性PRRSV重組質(zhì)粒的構(gòu)建 按照TRizol＠Reagent（In-Vitrogen公司）的操作說(shuō)明書(shū)對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）的 RNA進(jìn)行提取，接著用Prime-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。取2μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）：1×PCR buffer、ExTaq1.25U，dNTPs Mixture 0.2mmol／L，上、下游引物各20μmol／L，其余以雙蒸水加至50μL。反應(yīng)程序：94℃30s；94℃30 s，58℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min?；厥誔CR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，確定為美州型和高致病性PRRSV目的基因，測(cè)OD 260nm換算濃度后，均稀釋至1×106copies／μL，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化以稀釋后的質(zhì)粒為模板，用Premix ExTaqTM（Probe qPCR）體系在不同退火溫度（54℃～62℃）下進(jìn)行復(fù)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)應(yīng)用矩陣優(yōu)勢(shì)法對(duì)熒光PCR體系中探針用量（2μmol／L～8μmol／L）和引物用量（5μmol／L～15μmol／L）進(jìn)行優(yōu)化，得到復(fù)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 以特異性樣本JXA1-R株、CH-1R株、豬瘟活疫苗（兔源）、豬輪狀病毒標(biāo)準(zhǔn)株、豬口蹄疫O型滅活疫苗（O2K／93株＋OS／99株）、豬乙型腦炎活疫苗（SA-14-14-2株）、豬腹瀉三聯(lián)疫苗TGEV＋PEDV＋RN等的cDNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.7 靈敏性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將濃度為1×106copies／μL 的美洲型、歐洲型和高致病性PRRSV的重組質(zhì)粒10倍系列稀釋6個(gè)梯度，每個(gè)梯度做3次重復(fù)，進(jìn)行多重?zé)晒釶CR反應(yīng)，來(lái)確定該方法的敏感度。同時(shí)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各自的相關(guān)系數(shù)。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分3次配制3批檢測(cè)試劑，以上述重組質(zhì)粒為模板（1×105copies／μL～1×102copies／μL），每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，在同一臺(tái)熒光定量PCR儀上檢測(cè)三批試劑的批內(nèi)及批間重復(fù)性。

1.2.9 臨床樣品檢測(cè) 收集經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的20份美洲型PRRSV陽(yáng)性樣本（15份高致病性PRRSV陽(yáng)性、5份普通PRRSV陽(yáng)性），其他臨床組織樣品30份，累計(jì)50份，采用該多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 SOE PCR

SOE PCR的完整過(guò)程如圖4，將OU1和OU2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增條帶與設(shè)計(jì)時(shí)的目的片段大小一致（圖1）。

2.2 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系的優(yōu)化

圖1 歐洲型PRRSV基因SOE-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of SOE-PCR products of European genotype PRRSV gene

以不同型別的PRRSV目的質(zhì)粒為模板對(duì)多重?zé)晒釶CR體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的反應(yīng)條件。引物和探針的最佳濃度分別為：歐洲型PRRSV上、下游引物為10μmol／L，美洲型PRRSV上、下游引物為10μmol／L，高致病性PRRSV上、下游引物為8 μmol／L，OP1（FAM）探針3μmol／L，AP1（VIC）5 μmol／L，HP1（CY5）3μmol／L，總體系50μL。擴(kuò)增條件確定為：95℃30s；95℃5s，58℃40s，40個(gè)循環(huán)，退火時(shí)收集熒光信號(hào)。最終的優(yōu)化結(jié)果可知，每個(gè)通道都有明顯的擴(kuò)增曲線，且各通道之間的熒光信號(hào)差別最小（圖2）。

2.3 靈敏度試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以濃度1×105copies／μL～1copies／μL 6個(gè)線性梯度的不同型別PRRSV重組質(zhì)粒為模板，檢測(cè)試劑盒靈敏度，其中1copies／μL沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)，其他濃度均為陽(yáng)性，說(shuō)明該多重?zé)晒釶CR檢測(cè)下線為1×101copies／μL。其中1×105copies／μL～10copies／μL模板的擴(kuò)增曲線呈等距性和平行性，由此梯度系列生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)r值均在0.98以上，說(shuō)明較高的相關(guān)性；斜率在-2.66～-3.36，本方法具有較好的擴(kuò)增效率（圖3～圖5）。

圖2 PCR優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The results of PCR optimization

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中歐洲型PRRSV檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of multiplex real-time PCR for European genotype PRRSV detection

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中美洲型PRRSV檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of multiplex real-time PCR for American genotype PRRSV detection

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中高致病性PRRSV檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensitivity test of multiplex real-time PCR for highly pathogenic PRRSV detection

2.4 特異性試驗(yàn)

對(duì)豬輪狀病毒（RN）、豬乙型腦炎活疫苗（SA-14-14-2株）、JXA1-R 株、CH-1R 株、豬瘟活疫苗（CSFV）、豬口蹄疫 O型滅活疫苗（O2K／93株＋OS／99株）、豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗（TEGV PEDV）、豬腹瀉三聯(lián)疫苗（TGEV＋PEDV＋RN）等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果JXA1-R株、CH-1R株為FAM檢測(cè)通道陽(yáng)性，JXA1-R株為cy5檢測(cè)通道陽(yáng)性，其他樣本檢測(cè)結(jié)果為FAM、VIC、cy5通道陰性，證實(shí)該方法有較好的特異性（圖6～圖8）。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中美洲型PRRSV的特異性試驗(yàn)Fig.6 Sensitivity test of multiplex real-time PCR for American genotype PRRSV detection

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中歐洲型PRRSV的特異性試驗(yàn)Fig.7 Specificity test of multiplex real-time PCR for European genotype PRRSV detection

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

將重組質(zhì)粒（1×106copies／μL）濃度10倍梯度稀釋成1×105copies／μL～1×102copies／μL，每個(gè)濃度樣品做3次重復(fù)性試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定Ct值來(lái)驗(yàn)證方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示，第1批試劑的批內(nèi)變異系數(shù)在0.13%～1.55%，第2批試劑的批內(nèi)變異系數(shù)在0.27%～1.84%，第3批試劑的批內(nèi)變異系數(shù)在0.25%～1.43%（表2～表4）；3批試劑的批間變異系數(shù)在0.50%～1.76%（表5）。

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

用所建立的方法對(duì)50份臨床動(dòng)物組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，20份美洲型PRRSV陽(yáng)性樣品的檢驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，其中15例為高致病性PRRSV陽(yáng)性，其他30例樣品均為陰性。

圖8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系中高致病性PRRSV的特異性試驗(yàn)Fig.8 Specificity test of multiplex real-time PCR for highly pathogenic PRRSV detection

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法FAM檢測(cè)通道的批內(nèi)重復(fù)性Table 2 Intra-assay variability of FAM detction channel of multiplex real-time PCR

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法VIC檢測(cè)通道的批內(nèi)重復(fù)性Table 3 Intra-assay variability of VIC detction channel of multiplex real-time PCR

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法CY5檢測(cè)通道的批內(nèi)重復(fù)性Table 4 Intra-assay variability of CY5detction channel of multiplex real-time PCR

表5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的批間重復(fù)性Table 5 Inter-assay variability of multiplex real-time PCR

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒易發(fā)生變異，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的發(fā)生就是PRRSV變異后毒力增強(qiáng)的有力證據(jù)。2006年-2007年在我國(guó)20多個(gè)省市區(qū)暴發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，使我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)遭受了的巨大的沖擊，同時(shí)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，為此農(nóng)業(yè)部將其列為動(dòng)物一類傳染病，屬動(dòng)物重大疫?。?-9］。田克恭在多個(gè)技術(shù)研討會(huì)上透露其實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)對(duì)全國(guó)豬病流行性調(diào)查的結(jié)論，2011年，通過(guò)對(duì)97個(gè)原種豬場(chǎng)共4 982頭豬只的流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其中8個(gè)場(chǎng)共13頭豬只檢出歐洲型豬藍(lán)耳病病毒株，豬場(chǎng)檢出率達(dá)8.2%，個(gè)體檢出率達(dá)0.3%［5］。到目前為止，國(guó)內(nèi)豬繁殖與呼吸綜合征毒株一直是以美洲型為主（經(jīng)典毒株與高致病性毒株同在），歐洲型毒株偶有發(fā)生［6］。此外，國(guó)內(nèi)某些豬場(chǎng)使用歐洲型PRRSV弱毒疫苗，加大了PRRSV的分析的難度，且弱毒疫苗的安全性還存在爭(zhēng)議，在選擇性壓力的作用下，弱毒疫苗毒株會(huì)發(fā)生返祖現(xiàn)象，變?yōu)閺?qiáng)毒株，從而造成PRRS的暴發(fā)［10］。國(guó)內(nèi)缺乏對(duì)PRRSV全面系統(tǒng)性診斷的研究，因此，加強(qiáng)對(duì)美洲型、歐洲型、高致病性PRRSV的研究為形勢(shì)所需。目前在我國(guó)，經(jīng)典株、高致病株及歐洲型PRSSV均有檢出，有必要建立一種快速鑒別豬繁殖與呼吸綜合征的診斷方法。

重疊延伸PCR技術(shù)（SOE PCR）從問(wèn)世就受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，使得體外人工合成長(zhǎng)鏈DNA成為可能［11］。本研究由于未能收集到歐洲型PRRSV的樣本，所以應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)合成歐洲型PRRSV的目的基因片段，隨機(jī)挑選一個(gè)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，用本文的多重?zé)晒釶CR方法對(duì)此重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有vic檢測(cè)通道有明顯的擴(kuò)增曲線，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.36說(shuō)明所設(shè)計(jì)的歐洲型PRRSV引物、探針具有比較理想的擴(kuò)增效率，進(jìn)一步證明所設(shè)計(jì)的歐洲型引物及探針合理可靠，可以擴(kuò)增出正確的歐洲型PRRSV目的基因片段。

Real-time RT-PCR技術(shù)具有操作方便、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于病原體快速檢測(cè)［12-14］。目前，國(guó)內(nèi)外將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)用于檢測(cè)美洲型PRRSV的報(bào)道比較常見(jiàn)［15-18］，而關(guān)于歐洲型PRRSV的報(bào)道較少［19-20］。本研究構(gòu)建的三重三色熒光PCR檢測(cè)方法，能在一次反應(yīng)中對(duì)歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV 3種病原體進(jìn)行鑒別檢測(cè)，此方法的檢測(cè)線性范圍為1×102copies／μL～1×105copies／μL，具有良好的重復(fù)穩(wěn)定性，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別在0.25%～1.92%和0.50%～1.76%間，檢測(cè)最低限可達(dá)10copies／μL。疫苗株和野毒株之間的基因序列的同源性比較高，由于本次試驗(yàn)未能收集到相關(guān)的病毒株，因此采用各自的疫苗株代替致病毒株進(jìn)行特異性驗(yàn)證。此外，本研究還對(duì)臨床確診的陽(yáng)性和陰性樣本進(jìn)行驗(yàn)證并獲得了精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。雖然此次研究缺乏對(duì)歐洲型PRRSV臨床樣本的驗(yàn)證，但我們成功構(gòu)建了含歐洲型目的基因的質(zhì)粒，并用其驗(yàn)證了歐洲型引物及探針的正確性。說(shuō)明該方法可用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征疾病，并對(duì)其病毒進(jìn)行鑒別診斷?？傊?，本研究建立的PRRSV三重三色實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法將有助于提高臨床上不同類型PRRSV病毒感染的監(jiān)控技術(shù)和檢測(cè)能力，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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