丁曉穎，黃 鷹，王曉波，高青云，儲莉鳴

(上海市浦東新區(qū)婦幼保健院婦產科，上海201206)

臨產前后絨毛膜中激活的NF-κB與PGF合成調節(jié)酶的相關性

丁曉穎，黃 鷹，王曉波，高青云，儲莉鳴

(上海市浦東新區(qū)婦幼保健院婦產科，上海201206)

目的 分析足月妊娠婦女臨產前后絨毛膜中核因子-κB(NF-κB)的激活與前列腺素F(PGF)合成調節(jié)酶的蛋白表達變化及其相關性。方法 收集足月妊娠臨產及未臨產婦女各15例的絨毛膜組織，采用Western Blot方法檢測其中NF-κB的激活水平以及環(huán)氧合酶(COX)-2、醛糖還原酶(AKR1B)1的蛋白水平，并分析NF-κB的激活水平與COX-2、AKR1B1表達的相關性。結果 ①臨產組絨毛膜中COX-2、AKR1B1的蛋白水平均高于未臨產組，差異均有極顯著性(F值分別為7.737和8.772，均P<0.01)；NF-κB的激活水平也高于未臨產組，差異有顯著性(F=38.563，P<0.05)；②臨產前后絨毛膜中NF-κB的激活水平與COX-2、AKR1B1的表達水平均呈顯著正相關(r值分別為0.243和0.168，均P<0.05)。結論 臨產后絨毛膜中激活的NF-κB和PGF合成調節(jié)酶的表達水平增高，且NF-κB的激活可以上調PGF合成調節(jié)酶表達的過程，導致PGF合成增加，這可能是NF-κB參與足月妊娠分娩啟動的機制之一。

核因子-κB；環(huán)氧合酶-2；醛糖還原酶1；臨產；絨毛膜

早產的全球發(fā)病率為9.6%，每年有超過100萬的新生兒死于早產[1]，給社會和家庭帶來了極大的負擔。早產問題至今懸而未決，其關鍵是因為分娩啟動的具體機制尚未闡明。前列腺素F(prostaglandin F，PGF)一直被認為是誘發(fā)子宮收縮的主要內源性因子，羊膜和絨毛膜是其生成的主要場所。膜磷脂在一系列酶的催化下生成PGF，其中環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)-2是PGF合成過程中的限速酶，以往對PGF合成酶的研究也多集中在COX-2上[2]。前列腺素F合成酶(prostaglandin F synthase，PGFS)是PGF2α合成過程中的末端限速酶，目前已發(fā)現(xiàn)有3個亞型：醛糖還原酶-1(aldo-ketoreductase B-1，AKR1B1)、二氫二醇去氫酶3和羰基還原酶1，其中AKR1B1高表達于絨毛膜組織，但目前國內尚無臨產前后絨毛膜中AKR1B1是否具有差異表達的研究報道。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的激活與人類分娩啟動密切相關[3]。對NF-κB的激活水平的研究主要集中在磷酸化p65亞基(pp65)[4]上；但是，在絨毛膜中臨產前后NF-κB是否被激活，NF-kB的激活是否與PGF合成調節(jié)酶COX-2和AKR1B1的表達有關？目前鮮有文獻報道。本研究采用Western Blot方法檢測臨產前后絨毛膜中COX-2、AKR1B1和NF-κB激活蛋白的變化并分析COX-2、AKR1B1水平與NF-κB激活的相關性，從而明確NF-κB激活是否與臨產前后絨毛膜PGF生產量的變化有關，為明確人類分娩啟動機制以及早產的預防提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

隨機選取2012年12月至2013年12月期間單胎、妊娠37～42周，于上海市浦東新區(qū)婦幼保健院行子宮下段剖宮產術的產婦30例，其中未臨產和臨產者各15例，剔除妊娠期糖尿病、子癇前期等妊娠合并癥及并發(fā)癥者。本次實驗共分兩組：研究組為足月妊娠臨產(term labor，TL)組，TL的納入標準[5]是在無催產素或前列腺素干預的前提下，出現(xiàn)規(guī)律且逐漸增強的宮縮，同時伴有宮頸管消失、宮口擴張和胎先露下降，因活躍期停滯、胎兒宮內窘迫等因素行子宮下段剖宮產術的患者；對照組為足月妊娠未臨產(term non-labor，TNL)組，TNL的納入標準是在無宮縮、見紅及胎膜早破的前提下，因臀位、社會因素行子宮下段剖宮產術的患者。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本采集及處理

在患者知情同意的前提下，當剖宮產術中胎兒胎盤娩出后，將絨毛膜組織放入預冷的生理鹽水中漂洗后，取100mg絨毛膜組織剪碎置于含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中進行組織勻漿。12 000rpm，4℃離心20分鐘，取上清液，BCA檢測試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)測定蛋白含量。

1.2.2 Western印跡檢測環(huán)氧合酶-2、醛糖還原酶1和pp-65蛋白水平

取上述抽提的絨毛膜組織總蛋白100μg，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，目的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。然后用含5%脫脂牛奶的Tris-鹽酸緩沖鹽溶液封閉2小時，COX-2、AKR1B1和pp-65等蛋白一抗分別4℃孵育過夜。第2天用1:1 000辣根過氧化物酶結合的二抗(santa Cruz)室溫孵育1.5小時，用增強型化學發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)進行顯色。結果應用美國ImagerJ圖像軟件系統(tǒng)進行定量分析，用COX-2、AKR1B1蛋白條帶的灰度值與b-actin蛋白條帶的灰度值的比值代表COX-2、AKR1B1的相對表達含量，用pp65蛋白條帶的灰度值與p65蛋白條帶的灰度值的比值來代表NF-kB的激活程度。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，對各組數據進行統(tǒng)計分析。實驗結果采用均數±標準差表示，組間差別采用LSD-t檢驗后再以單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計，相關性分析采用線性相關系數r來表示，以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2 結果

2.1 一般情況比較

兩組研究對象在年齡、孕周、孕婦體質指數(BMI)、產前胎兒臍血流指數(S/D值)、新生兒體重等因素進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組孕產婦一般情況比較

2.2 環(huán)氧合酶-2、醛糖還原酶1和pp-65在臨產前后絨毛膜中的表達情況

COX-2、AKR1B1和pp-65蛋白在臨產組與未臨產組的絨毛膜中均有表達，見圖1；與未臨產組相比，臨產組絨毛膜中COX-2和AKR1B1的表達水平明顯高于未臨產組，差異均有極顯著性(均P<0.01)；臨產組絨毛膜中激活的NF-κB(pp-65)的表達水平也高于未臨產組，差異有顯著性(P<0.05)，見表2。

A

B

圖1 臨產前后絨毛膜中COX-2、AKR1B1(A)及pp65(B)的蛋白Western印跡圖

Fig.1 Western expression of COX-2, AKR1B1(A) and pp65(B) in chorion before and after labor

Table 2 Comparison of COX-2,AKR1B1 and pp65 in chorion between two groups

注：表頭中斜杠后的是校驗蛋白，結果采用二者之比可大大減少誤差。

2.3 臨產前后環(huán)氧合酶-2、醛糖還原酶1的表達與pp65的相關性

為了解PGF合成相關酶的表達與NF-κB激活的關系，對臨產前后COX-2和AKR1B1的蛋白水平與pp65的表達水平進行了相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)臨產前后絨毛膜中pp65的水平與COX-2的表達有顯著相關性(r=0.243，P<0.05)，見圖2；pp65的水平與AKR1B1的表達也有顯著相關性(r=0.168，P<0.05)，見圖3。

圖2 足月妊娠絨毛膜中pp65對COX-2表達的影響(n=15，P=0.006 vs TNL)

Fig.2 Influence of pp65 on the expression of COX-2 in chorion of term pregnancy (n=15,P=0.006 vs TNL)

圖3 足月妊娠絨毛膜中pp65對AKR1B1表達的影響(n=15，P=0.024 vs TNL)

Fig.3 Influence of pp65 on the expression of AKR1B1 in chorion of term pregnancy (n=15,P=0.024 vs TNL)

3 討論

3.1 前列腺素F合成調節(jié)酶與分娩啟動的關系

在正常足月妊娠過程中，子宮肌層處于一種相對靜止狀態(tài)，至妊娠末期，它會進入前宮縮狀態(tài)，導致肌細胞對各種激素信號和壓力改變做出反應，從而引起子宮平滑肌的收縮。目前認為這種轉變與臨產前后一系列子宮激活蛋白的表達改變有關。子宮激活蛋白包括以下4種類型：①子宮收縮因子合成酶或代謝酶；②子宮收縮/舒張激動劑受體；③離子通道蛋白；④縫隙連接蛋白。COX-2和AKR1B1即屬于子宮收縮因子(PGF)合成酶類蛋白。COX-2將花生四烯酸轉化成不穩(wěn)定的前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)，然后，PGFS催化COX產物PGH2轉化成PGF2α。由此可見，COX-2是PGF合成過程中的關鍵限速酶，而且由于COX-2的可誘導性表達，其在妊娠分娩過程中的作用一直受到國內外學者的廣泛關注。以往對COX-2的研究多集中在羊膜，近來Mitchell等[6]研究發(fā)現(xiàn)絨毛膜組織中不僅有COX-2的表達，而且COX-2 mRNA水平隨著孕周的增加而增加，至分娩前最為顯著。胡艷等[7]采用免疫組化法觀察COX-2在早產、足月臨產、足月未臨產者絨毛膜中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)早產組絨毛膜組織中COX-2的表達高于足月臨產和未臨產組，足月臨產組絨毛膜中COX-2的表達又高于未臨產組。這提示位于羊膜與子宮肌層間的絨毛膜，其中COX-2的表達與分娩的啟動密切相關。本實驗結果顯示，COX-2在足月妊娠臨產前后的絨毛膜中均有表達，但在臨產以后的絨毛膜中呈增強表達趨勢，與胡艷等的結果一致，進一步證實了絨毛膜中COX-2表達的增強與足月妊娠分娩啟動的相關性。

AKR1B1屬于醛糖還原酶超家族，起初在研究人體血糖高濃度時發(fā)現(xiàn)AKR1B1可以使血葡萄糖轉化為山梨糖醇。Kabututu等[8]報道AKR1B1還可以將PGH2轉化為PGF，從而在PGF合成過程中發(fā)揮著重要的作用。值得注意的是，AKR1B1在羊膜中微弱表達，卻高表達于絨毛膜組織，脂多糖可以誘導其表達增加[9]，不僅如此，絨毛膜中AKR1B1轉化PGH2至PGF2α的作用也強于AKR1C3[8]。于是設想，能否從可誘導性表達的AKR1B1入手，來探索分娩啟動的確切機制，但國內尚無臨產前后絨毛膜中AKR1B1變化情況的報道。本研究結果顯示，臨產組人絨毛膜組織中AKR1B1的蛋白水平較未臨產組顯著升高。這一發(fā)現(xiàn)提示，作為PGF合成過程中的關鍵限速酶和末端限速酶，臨產后COX-2和AKR1B1的這種表達變化可以使得PGF合成增加，推動子宮平滑肌由靜息態(tài)轉為收縮態(tài)，進而參與分娩的啟動，而如何通過抑制COX-2和AKR1B1的表達來防治早產的發(fā)生，尚需進一步深入的研究。

3.2 核因子-κB的激活與分娩啟動的關系

NF-κB是由兩種Rel家族蛋白質構成的二聚體蛋白質，表達于人體絕大多數細胞中，激活的NF-κB通過調節(jié)細胞因子、趨化因子、粘附分子、轉錄因子等一系列特異基因的表達而參與多種生理、病理過程的調節(jié)。通常所說激活的NF-κB是指p65和p50組成的異源二聚體，而目前對NF-κB轉錄活性的研究主要集中在p65分子上，一般認為p65分子中多個位點的磷酸化狀態(tài)與其轉錄活性有關。隨著分娩動因研究的不斷進展，近年來發(fā)現(xiàn)NF-κB與妊娠關系密切。國外研究報道NF-κB蛋白在胎盤[10]、胎膜和蛻膜[11]組織都有表達，但國內相關報道甚少，尤其是對絨毛膜中NF-κB表達情況的研究極少。Yan等[12]曾報道NF-κB p65在羊膜、絨毛膜中都有表達，但羊膜和絨毛膜中p65的水平不隨孕周的增加和臨產的發(fā)動而改變。趙文舉等[13]在研究后提出了不同的觀點，其發(fā)現(xiàn)p65在未臨產組及臨產組的平滑絨毛膜組織均有表達，并且在臨產組表達增加。本實驗結果顯示，pp65在足月妊娠臨產與未臨產組都有表達，但在臨產組中的表達水平顯著高于未臨產組，差異有顯著性，進而認為NF-κB的激活可能在足月妊娠的分娩啟動中發(fā)揮著重要的作用。

3.3 核因子-κB的激活與前列腺素F合成調節(jié)酶的相關性

NF-κB是怎樣參與分娩啟動的呢？隨著對妊娠過程NF-κB作用的研究愈加深入，有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的DNA結合位點基序為5’-GGGNRYYY CC-3’，可以與多種基因啟動子部位的κB序列特異結合而促進其轉錄表達。在COX-2基因啟動子中包含2個NF-κB位點，這2個位點中1個或2個突變都會顯著降低COX-2的基因轉錄。體外試驗已經證實IL-1β和TNF-α均可以刺激上調絨毛膜滋養(yǎng)層細胞中COX-2的表達，進而促進前列腺素合成增多[14]。本研究結果顯示，絨毛膜中pp65與COX-2、AKR1B1的表達均呈正相關，故認為絨毛膜中激活的NF-κB可以上調COX-2與AKR1B1的表達，NF-κB通過與這些靶基因上κB結合位點的特異性結合，從而在轉錄水平調節(jié)其表達。這種調控的結果進一步引起前列腺素PGF合成增多，促進宮頸成熟，胎膜破裂，子宮收縮，在分娩的啟動和維持中發(fā)揮著重要的作用。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)足月妊娠臨產前后激活的NF-κB與絨毛膜中PGF2α的合成明顯相關，那么能否通過調控NF-κB的激活來控制PG的生成以調節(jié)分娩，或是通過對可誘導型PG合成酶的干預來調節(jié)PG的合成，進而應用于臨床早產的防治，今后有望從這一方面進一步擴大樣本量后繼續(xù)研究。

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[專業(yè)責任編輯：楊文方]

Correlation between activated NF-κB and synthetase regulating PGF in chorion before and after labor

DING Xiao-ying, HUANG Ying, WANG Xiao-bo, GAO Qing-yun, CHU Li-ming

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,PudongDistrictHealthcareHospitalforWomenandChildren,Shanghai201206,China)

Objective To study the changes and relationship between activation of NF-κB and the expression of PGF synthetase in chorion before and after labor in term pregnancy. Methods Fifteen cases of term labor (TL) and 15 cases of term non-labor (TNL) were selected as the objects of study. Western Blot test was used to observe the expression of activated NF-κB, COX-2 and AKR1B1 in their chorion, and the correlation between them was analyzed. Results Compared with the TNL group, the levels of COX-2 and AKR1B1 increased in TL group, there were significant differences between two groups (Fvalue was 7.737 and 8.772, respectively, bothP<0.01), and the level of activated NF-κB was also higher in TL group (F=38.563,P<0.05). Both the expressions of COX-2 and AKR1B1 were positively correlated with the activated NF-κB in chorion before and after labor (rvalue was 0.243 and 0.168, respectively, bothP<0.05). Conclusion The levels of NF-κB, COX-2 and AKR1B1 protein increase in human chorion after labor, and the activated NF-κB can up-regulate the expression of PGF synthetase and lead to increased synthesis of PGF. It may be the mechanism of NF-κB participating in initiation of labor.

nuclear factor kappa B(NF-κB)；cyclooxygenase-2(COX-2)；aldo-ketoreductase B-1(AKR1B1)；labor；chorion

2014-12-14

上海市衛(wèi)計委課題基金資助項目(課題編號：201440003)

丁曉穎(1973-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事圍產醫(yī)學的研究。

儲莉鳴，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.027

R714.7

A

1673-5293(2015)02-0248-03