王 嬌，王秋文，尹清強，岳道友，常 娟，宋安東，黨曉偉 ，劉洪兵(.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 000；.濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 濮陽 7000；.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 000； .河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng) 66000；. 泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 6700)

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轉(zhuǎn)錳過氧化物酶基因酵母的建立及其降解秸稈木質(zhì)素能力的研究

王 嬌1, 2，王秋文1，尹清強1，岳道友2，常 娟1，宋安東3，黨曉偉4，劉洪兵5
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 濮陽 457000；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 4.河南德鄰生物制品有限公司，河南 新鄉(xiāng) 466000；5. 泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 463700)

為了提高錳過氧化物酶基因的表達產(chǎn)量，從黃孢原毛平革菌中獲取錳過氧化物酶基因，并將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中。在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件下，重組酵母與原始黃孢原毛平革菌所分泌的錳過氧化物酶活性分別為0.317 8 U·mL-1和0.197 2 U·mL-1(P<0.05)；重組酵母所表達酶的最適溫度和pH值分別為40 ℃和4.5，與原始酶的生化特性基本一致。在含有玉米秸稈的液體培養(yǎng)基中，重組酵母對秸稈中木質(zhì)素降解率達到24.09%，而黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素的降解率為16.53%(P<0.05)。

錳過氧化物酶；基因表達；畢赤酵母；木質(zhì)素降解

中國每年所產(chǎn)的農(nóng)作物秸稈約6億t，由于缺乏有效的處理手段，大部分被焚燒和腐爛掉，造成嚴重的資源浪費和環(huán)境污染問題。因而，把秸稈轉(zhuǎn)化為動物飼料和其他有價值的資源具有非常重要的社會和經(jīng)濟意義。為了提高農(nóng)作物秸稈的利用率，首先要考慮的是如何來降解秸稈中的木質(zhì)素。降解木質(zhì)素的主要酶類有木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。錳過氧化物酶(Manganese peroxidase) 是一個含鐵血紅素的氧化還原酶，主要由白腐真菌系和土壤枯草系這2個擔(dān)子真菌系產(chǎn)生。MnP與Lip都含有血紅素，具有糖基的胞外酶，又稱血紅素過氧化物酶。MnP底物為有機酸，先將Mn2+氧化為Mn3+，Mn3+與有機酸螯合，通過擴散離開酶活性中心,在H2O2存在時，氧化分解具有芳香環(huán)多聚體的木質(zhì)素及木質(zhì)素模型物，被認為是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一[1-3]。MnP最早是在1984年由KUWAHARA等在黃孢原毛平革菌培養(yǎng)液中獲得[4]，在生物漂白、造紙業(yè)、食品業(yè)和飼料業(yè)等應(yīng)用方面具有重要作用[2，5，6]。MnP基因是協(xié)同表達的，受底物、氮源、錳濃度和熱應(yīng)激等因素影響[7，8]。對MnP基因的異源表達研究已很多，在原核表達系統(tǒng)中，需在培養(yǎng)液中加入血紅素才能誘導(dǎo)錳過氧化物酶基因的表達[9]。以酵母菌為宿主菌的異源表達，是在AOX啟動子下進行的，有利于外源基因的高效表達[10]。農(nóng)作物秸稈是一種潛在的非競爭資源，能否變秸稈為飼料是人們關(guān)注的問題[11]。本研究將黃孢原毛平革菌的MnP基因在畢赤酵母中進行異源表達，研究其對農(nóng)作物秸稈中木質(zhì)素的降解作用，為農(nóng)作物秸稈的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃孢原毛平革菌(No.5.776)購自中國科學(xué)院微生物研究所。感受態(tài)大腸桿菌DH5α、硅膠膜型TMPCR產(chǎn)物(DNA片段)純化試劑盒、PMD19-T連接試劑盒等試劑盒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、限制性內(nèi)切酶Bg1II、蝸牛酶均購自自寶生物工程有限公司。DNA marker、Amp、抗生素Zeocin、IPTG和X-gal均購自TaKaRa公司。巴斯德畢赤酵母X-33和表達質(zhì)粒載體pGAPZαA均表達質(zhì)粒pGAPZαA購自Invitrogen公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基 稱取可溶性淀粉0.6 g，葡萄糖2 g，酵母浸粉0.2 g，胰蛋白胨0.5 g，磷酸氫二甲0.5 g，硫酸鎂0.03 g，溶于100 mL蒸餾水中。

1.2.2 LB培養(yǎng)基 稱取胰蛋白胨1 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉1 g，溶于100 mL蒸餾水中，低鹽LB培養(yǎng)基氯化鈉加0.5%，如需要加抗生素Zeocin，待高壓滅菌后冷卻至50 ℃時再加Zeocin混勻。所含Zeocin質(zhì)量濃度為100 mg·L-1。

1.2.3 YPD培養(yǎng)基 稱取酵母浸粉1 g，胰蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，溶于100 mL蒸餾水中。

1.2.4 秸稈培養(yǎng)基 液體YPD培養(yǎng)基中加0.2%硫酸錳和1%的玉米秸稈，秸稈粒度為40～60目。

上述培養(yǎng)基若制成固體培養(yǎng)基，可在相應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基中加2%瓊脂。所有培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至室溫后備用。

1.3 錳過氧化物酶DNA提取及克隆

1.4 錳過氧化物酶基因在畢赤酵母中的表達

將上述鑒定克隆成功的目的基因通過EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切回收，再通過T4 DNA連接酶作用與表達載體pGAPZαA連接，連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，在含抗生素Zeocin(100 mg·L-1)的低鹽LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)鑒定。將攜帶有錳過氧化物酶基因的重組質(zhì)粒用Bg1 II限制性內(nèi)切酶線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母。點擊轉(zhuǎn)化條件為：1.6 kV，25 μF，200 Ω，電擊時間4～10 ms。

1.5 轉(zhuǎn)錳過氧化物酶基因酵母的產(chǎn)酶特性分析

1.5.1 微生物的培養(yǎng) 將黃孢原毛平革菌和轉(zhuǎn)MnP基因畢赤酵母菌在秸稈培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每個菌種做3個重復(fù)，于30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速70 r·min-1。分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h取樣，離心取上清液得到粗酶液，酶活性測定選用愈創(chuàng)木酚法[12]。

1.5.2 不同溫度處理粗酶液后酶活性測定 將上述2種粗酶液分別在20，30，40，50，60 ℃溫度水浴20 min，迅速放在冷水中降溫后測定MnP活性。

1.5.3 酶最適pH的測定 通過改變丙二酸緩沖液的pH，測定MnP在pH為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5反應(yīng)體系中酶活性的變化情況。

1.6 轉(zhuǎn)錳過氧化物酶基因酵母對玉米秸稈中木質(zhì)素降解率的影響

將黃孢原毛平革菌、轉(zhuǎn)MnP基因畢赤酵母、X-33原始畢赤酵母和轉(zhuǎn)空pGAPZαA質(zhì)粒酵母按相同計量分別接種于含1%玉米秸稈的秸稈培養(yǎng)液中，每個處理分別做3個重復(fù)，在30 ℃和轉(zhuǎn)速70 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，在105 ℃下烘干稱重，以不接種的空白培養(yǎng)基作為對照組。每瓶取樣1.5 g左右，測定木質(zhì)素含量，木質(zhì)素含量測定方法參照“飼料中酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)的測定”。計算木質(zhì)素含量的百分比，并且以空白作為對照，計算在發(fā)酵培養(yǎng)中，秸稈木質(zhì)素的降解率[13]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用SAS6.12統(tǒng)計軟件中ANOVA進行方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1MnP基因的獲得、載體構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達

MnP基因通過PCR反應(yīng)擴增后，用電泳分析和純化，經(jīng)上海生工測序結(jié)果與在NCBI上公布的序列L29039.1進行Blast比對，同源性達到98%，克隆所得基因全長1 451 bp，編碼361個氨基酸，蛋白相對分子量約為40.1 kD。目的基因與載體連接后，通過高壓電擊手段把目的基因轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中。為了驗證MnP基因是否在重組酵母中存在和表達，首先提取重組酵母基因組DNA，以P1、P2為引物擴增，經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)，在約1500 bp處有清晰條帶(圖1)，說明MnP基因已成功導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母X-33中。分別取含有MnP基因的重組酵母、含有空質(zhì)粒子載體的重組酵母、原始巴斯德畢赤酵母X-33、黃孢原毛平革菌等四種菌的培養(yǎng)液，做SDS-PAGE蛋白凝膠電泳。結(jié)果表明，含有MnP基因重組酵母菌液在約40 kD處出現(xiàn)1個清晰條帶(圖2)，根據(jù)DNA測序結(jié)果，經(jīng)軟件預(yù)測錳過氧化物酶表達的蛋白分子量約為40.1 kD，說明錳過氧化物酶已成功地在重組酵母中表達。

泳道M: DNA marker DL5000; 泳道1:MnP基因條帶。

Lane M: DNA marker DL5000; Lane 1: The bands ofMnPgene.

圖1 重組酵母基因組PCR
Fig.1 PCR ofMnPgene from genomic DNA of recombinantPichiapastoris

M：蛋白Maker；1：黃孢原毛平革菌；2：重組酵母；3：原始X-33酵母；4：空質(zhì)粒酵母；5：水。

Lane M: Protein maker; Lane 1:Phanerochaetechrysosporium; Lane 2: recombinantPichiapastoriswithMnPgene; Lane 3: The nativePichiapastorisX33; Lane 4: recombinantPichiapastoriswithoutMnPgene; Lane 5: water.

圖2 SDS-PAGE蛋白凝膠電泳
Fig.2 SDS-PAGE protein gel electrophoresis

2.2 重組酵母所表達的MnP生化特性和降解秸稈能力分析

2.2.1MnP活性檢測及分泌規(guī)律 由表1可知，轉(zhuǎn)MnP基因畢赤酵母產(chǎn)酶時間比黃孢原毛平革菌產(chǎn)酶要早，且轉(zhuǎn)MnP基因酵母最高酶活性(48 h)比黃孢原毛平革菌產(chǎn)酶最高酶活性(72 h)要高(P<0.05)；而原始畢赤酵母和轉(zhuǎn)空pGAPZαA質(zhì)粒的畢赤酵母均未檢測到酶活性。

2.2.2MnP的最適溫度和pH值 如表2所示，黃孢原毛平革菌與轉(zhuǎn)錳過氧化物酶酵母兩者酶活性均在40 ℃酶活性最高 (P<0.05)，在20 ℃至30 ℃范圍內(nèi)，兩者酶活性變化趨勢基本一致，而30 ℃之后轉(zhuǎn)錳過氧化物酶畢赤酵母酶活性上升幅度增加，40 ℃之后轉(zhuǎn)錳過氧化物酶畢赤酵母酶活性降低幅度較大，兩者在60 ℃均未測到酶活性。由表3可知，黃孢原毛平革菌和轉(zhuǎn)MnP基因酵母兩者的粗酶液最適 pH 均為4.5(P<0.05)。pH 為5.5時，黃孢原毛平革菌粗酶液有少量酶活性，而轉(zhuǎn)錳過氧化物酶酵母的粗酶液未檢測到酶活性，兩者粗酶液酶活性在不同 pH 環(huán)境下變化趨勢基本一致。

表1 不同時間段MnP酶活性的測定 Table 1 The determination of enzyme activity during different incubating time U·mL-1

注：同列內(nèi)小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，同行內(nèi)小寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: The date followed by different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05), while the date followed by the same lowercase letters in the same row mean insignificant difference (P>0.05). The same as below.

表2 不同溫度對Mnp酶活性的影響Table 2 The effect of different temperature on enzyme activity U·mL-1

表3 不同pH對Mnp粗酶液酶活性的影響Table 3 The effect of different pH on enzyme activity U·mL-1

2.2.3 在秸稈木質(zhì)素降解率分析 由表4可知，通過液體發(fā)酵處理秸稈后比較，轉(zhuǎn)MnP基因酵母處理的秸稈含木質(zhì)素量最少，原始黃孢原毛平革菌次之，均低于原始X-33酵母和空質(zhì)粒酵母。轉(zhuǎn)MnP基因酵母處理的秸稈含木質(zhì)素量與原始黃孢原毛平革菌相比差異不顯著(P>0.05)，與原始酵母、空質(zhì)粒酵母和空白處理相比差異顯著(P<0.05)。與空白對照對比，轉(zhuǎn)MnP基因酵母處理的秸稈木質(zhì)素降解率為24.09%，原始黃孢原毛平革菌處理的秸稈木質(zhì)素降解率為16.53%，兩者差異顯著(P<0.05)，并高于其他處理組(P<0.05)。

表4 不同菌株對玉米秸稈中木質(zhì)素降解率的影響Table 4 Lignin degradation rates of corn straw

3 結(jié)論與討論

重組酵母DNA的PCR檢測及MnP的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果均證明MnP基因已成功地得到了表達，其酶蛋白的相對分子量大小與劉尚旭等[14]的報道基本一致，說明MnP基因在畢赤酵母中異源表達成功。余梅等[15]研究表明，MnP活性受碳源、氮源、鹽濃度等影響，葡萄糖為最佳碳源，硫酸銨為最佳氮源，反應(yīng)液中沒有Mn2+時，氧化反應(yīng)幾乎不發(fā)生，Mn2+≤10 μg·L-1時，MnP酶活性隨Mn2+濃度增加而提高，Mn2+≥10 μg·L-1時，會抑制MnP酶活性。本試驗在測定產(chǎn)酶情況時，培養(yǎng)基中加適量的玉米秸稈粉和0.2% MnSO4均是為了誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶和MnP基因的表達。不過重組酵母與黃孢原毛平革菌在24 h前和96 h后均未測到酶活性，其原因是在微生物生長初期，主要是進行初級代謝，此時菌體生長繁殖占主導(dǎo)地位，無次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生；酶屬于次級代謝產(chǎn)物，一般在微生物代謝的后期(平臺期)產(chǎn)生。本研究MnP的最適溫度和pH與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致，分別為35～55 ℃和pH3.5～4.5[16]。說明MnP經(jīng)酵母表達后對酶的生化特性沒有明顯影響。

利用生物法降解木質(zhì)素是通過各種微生物菌系產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶的作用，其關(guān)鍵是提高木質(zhì)素酶活性。在培養(yǎng)過程中，重組酵母只產(chǎn)生MnP這一種與木質(zhì)素降解相關(guān)的酶，而黃孢原毛平革菌還會產(chǎn)生LiP等與木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的酶，會與MnP產(chǎn)生協(xié)同作用。但在本試驗中，在同等處理條件下，重組酵母對木質(zhì)素的降解率達到24.09%，而黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素的降解率只有16.53%，可以說明黃孢原毛平革菌對木質(zhì)素降解率低的原因是產(chǎn)MnP活性低，可能是由于酵母菌比黃孢原毛平革菌更容易在液體培養(yǎng)的環(huán)境下生長，其產(chǎn)酶性質(zhì)相對較好所致。

本研究通過基因工程手段將來自于黃孢原毛平革菌的MnP基因轉(zhuǎn)至畢赤酵母中，在液體發(fā)酵條件下，重組酵母的MnP活性高于原始的黃孢原毛平革菌，兩種酶的最適溫度和pH基本一致，重組酵母菌對玉米秸稈中木質(zhì)素的降解率要高于黃孢原毛平革菌，說明利用基因工程菌來提高秸稈中木質(zhì)素的降解率是可行的，為秸稈的深加工和利用奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

Study on establishment of recombinantPichiapastoriswith manganese peroxidase gene and its ability of degrading lignin in corn straw

WANG Jiao1,2, WANG Qiuwen1, YIN Qingqiang1, YUE Daoyou2, CHANG Juan1, SONG Andong3, DANG Xiaowei4, LIU Hongbing5
(1. Engineering College of Animal Husbandy and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Puyang Vocational and Technical College, Puyang 457000, China; 3. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;4. Henan Delin Biological Products Co., Ltd., Xinxiang 466000, China; 5. Beiyang Animal Husbandry Bureau, Beiyang 463700, China)

In order to enhance manganese peroxidase production，the manganese peroxidase gene was isolated fromPhanerochaetechrysosporiumand transformed intoPichiapastoris(X-33). Under the same conditions of liquid-state incubation for the recombinantPichiapastorisandPhanerochaetechrysosporium, manganese peroxidase activity was 0.317 8 U·mL-1and 0.197 2 U·mL-1, respectively (P<0.05). The optimal temperature and pH value of the expressed enzyme were 40 ℃ and 4.5, which was the same as the native enzyme. The liquid-state fermentation with corn straw showed that lignin degradation rates in corn straw were 24.09% and 16.53% for the recombinantPichiapastorisandPhanerochaetechrysosporium, respectively (P<0.05).

manganese peroxidase; gene expression;Pichiapastoris; lignin degradation

2015-06-23

鄭州市科技創(chuàng)新團隊(112PCXTD339)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(15IRTSTHN014)

王 嬌(1986-)，女，山西長治人，碩士，主要從事飼料生物技術(shù)研究。

尹清強(1964-)，男，河南南陽人，教授，博士。

1000-2340(2015)06-0817-05

S816

A