李 晶，查美玲，汪徐春

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

【現(xiàn)代應(yīng)用技術(shù)研究】

銅尾礦恢復(fù)植物白三葉抗葉斑病反應(yīng)中防御酶活性變化

李 晶1,2，查美玲1，汪徐春1

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

通過盆栽實(shí)驗(yàn)研究了鏈格孢菌對(duì)銅尾礦復(fù)墾植物白三葉草的致病力及葉片抗病性相關(guān)酶活性的影響.結(jié)果表明，鏈格孢菌對(duì)源自銅尾礦區(qū)的白三葉草有一定的致病力但感病指數(shù)不高.與不接種對(duì)照組相比，接種組葉片的多酚氧化酶、過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性升高，差異性顯著.隨著染病時(shí)間延長(zhǎng)，三種防御酶活性均是先升高后降低.多酚氧化酶活性在接種5天達(dá)到高峰，過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性均在接種7天達(dá)到最高峰.

復(fù)墾植物；抗病性；酶活性

自然界中，病原菌與寄主植物的相互作用一直廣泛存在著，并是研究的熱點(diǎn)之一.研究表明，病原菌感染寄主植物以后，植物個(gè)體的生長(zhǎng)、組織結(jié)構(gòu)、生理生化特性等方面均會(huì)發(fā)生變化，比如生長(zhǎng)緩慢、葉片變黃、一些次生產(chǎn)物(如植保素)合成、植物細(xì)胞壁加強(qiáng)或修飾(如木質(zhì)素累積)以及一些與抗病性相關(guān)的酶活性發(fā)生顯著變化等.在植物體內(nèi)，多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶是與抵抗病原微生物侵染相關(guān)的防御酶[1]，其活性水平可作為植物抗病性的生理指標(biāo).[2-5]

安徽銅陵銅尾礦場(chǎng)的復(fù)墾植物中，豆科的白三葉草(Trifoliumrepens)為優(yōu)勢(shì)種之一.[6]野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，作為復(fù)墾植物的白三葉草種群中有葉斑病發(fā)生，經(jīng)采樣分離鑒定病原菌為鏈格孢菌 (Alternariatenuis).有研究結(jié)果表明，在環(huán)境壓力下，病原菌對(duì)植物的傷害程度加重[7-8]，然而銅尾礦生長(zhǎng)的白三葉草雖有葉斑病發(fā)生，仍能生長(zhǎng)，并未受到致命性傷害.為探討重金屬污染土壤上生長(zhǎng)的白三葉草對(duì)葉斑病抗病能力、鏈格孢菌對(duì)白三葉草的致病力以及葉斑病是否影響到白三葉草對(duì)銅尾礦的復(fù)墾作用這些問題，本文選取銅尾礦復(fù)墾植物白三葉草進(jìn)行接種鏈格孢菌實(shí)驗(yàn)，研究病原菌對(duì)白三葉草致病力以及植物受病原菌侵染后葉片抗病性防御酶變化規(guī)律.為研究白三葉草對(duì)鏈格孢菌的防病戰(zhàn)略、抗性機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為重金屬尾礦區(qū)復(fù)墾植物抗病遺傳育種提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

寄主植物白三葉取自健康、長(zhǎng)勢(shì)好的同一個(gè)無性系，來源地為銅陵獅子山尾礦地，采樣選取生物量、株高基本相同的植物幼苗.實(shí)驗(yàn)前剪取3葉期、長(zhǎng)4cm匍匐莖盆栽培養(yǎng)40天后接種.

1.1.2 供試菌種

病原菌為鏈格孢菌，從上述樣地染病白三葉葉片病斑上分離純化而得.

1.1.3 供試土壤

以蚌埠醫(yī)學(xué)院周邊農(nóng)田土為供試土壤，土壤pH為7.28，有機(jī)質(zhì)含量為13.90g/kg，總氮、總磷、總鉀含量分別為0.51g/kg、3.67g/kg、3.36g/kg，電導(dǎo)率為136.52μs/cm.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試土壤風(fēng)干后過2mm篩，每盆稱重2kg土壤裝進(jìn)花盆，共10盆.將剪取的上述長(zhǎng)4cm的白三葉匍匐莖種入花盆，每盆10株，培養(yǎng)40天.接種鏈格孢菌分生孢子懸浮液到3葉期植物葉片，方法采用針刺法，同時(shí)接種無菌水作對(duì)照[9].接種后用塑料袋將接種葉片套袋保濕24 小時(shí).分別隔離培養(yǎng)，并分別于接種前(0天),接種后3天、5天、7天和9天取樣，測(cè)定各指標(biāo)變化情況，重復(fù)3次.

1.3 測(cè)試指標(biāo)和方法

1.3.1 鏈格孢菌對(duì)白三葉的致病力測(cè)定

接種后按表現(xiàn)型記載標(biāo)準(zhǔn)分4級(jí)，計(jì)算感病指數(shù)(見表1)[10].

表1 白三葉草葉斑病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 多酚氧化酶活性測(cè)定

采用比色法[11]，以每分鐘內(nèi)OD410值變化0.01為一個(gè)酶活性單位(U/gFW·min).

1.3.3 過氧化物酶活性測(cè)定

以1g植物在1min內(nèi)氧化愈創(chuàng)木酚的微克數(shù)為一個(gè)酶活性單位[12](U/gFW·min).

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定

以1g鮮重每小時(shí)OD290值變化0.01為一個(gè)酶活性單位[13](U/gFW·h).

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢菌對(duì)白三葉的致病力測(cè)定

由表2可知，接種無菌水對(duì)照組的植物感病指數(shù)為0，而鏈格孢菌處理組的感病指數(shù)均大于0，證明供試鏈格孢菌菌株對(duì)白三葉有一定的致病力.但染病指數(shù)隨著接種時(shí)間變化不明顯，并且接種9天后染病指數(shù)剛超過50%，這表明，鏈格孢菌雖然可以侵染白三葉，但是不對(duì)其生長(zhǎng)造成致命性傷害，這與野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)銅尾礦復(fù)墾植物白三葉雖然受到病原菌侵染，但仍能正常生長(zhǎng)的結(jié)果一致.說明銅尾礦區(qū)白三葉有良好的抵抗鏈格孢菌的能力.

表2 鏈格孢菌對(duì)白三葉的感病指數(shù)

2.2 鏈格孢菌對(duì)白三葉多酚氧化酶活性的影響

如圖1，未接種組白三葉葉片多酚氧化酶活性在實(shí)驗(yàn)期略有變化但不明顯，接種鏈格孢菌后，白三葉的多酚氧化酶活性有明顯增加，3 天后明顯升高，到第5 天為最大值，為不接種對(duì)照的2.92倍，兩者之間呈極顯著差異，p值小于0.01，隨后酶活性下降的趨勢(shì)相對(duì)緩慢.

圖1 鏈格孢菌對(duì)白三葉葉片多酚氧化酶活性的影響

圖2 鏈格孢菌對(duì)白三葉葉片過氧化物酶活性的影響

2.3 鏈格孢菌對(duì)白三葉過氧化物酶活性的影響

從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，接種鏈格孢菌后，白三葉葉片的過氧化物酶活性都顯著增加，接種3天、5天活性升高速度較快，幅度較大，之后活性仍繼續(xù)升高，但速度較緩慢，到第7天達(dá)到最高峰，是接種之前的2.14倍，隨后略下降.接種第9天，過氧化物酶活性是未接種組的1.83倍.

圖3 鏈格孢菌對(duì)白三葉葉片苯丙氨酸解氨酶活性的影響

2.4 鏈格孢菌對(duì)白三葉苯丙氨酸解氨酶活性的影響

如圖3，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，沒有染病組的白三葉葉片中，苯丙氨酸解氨酶活性相對(duì)平穩(wěn)，沒有顯著差異.而在受到鏈格孢菌感染以后，接種組的苯丙氨酸解氨酶活性迅速增加，到第7天達(dá)峰值，較對(duì)照組增加了175%，隨后下降，第9天仍高于對(duì)照組111%.

3 討論

感病指數(shù)可以反映病原菌對(duì)寄主植物的致病力.實(shí)驗(yàn)中，接種鏈格孢菌處理組的感病指數(shù)均大于0，證明供試鏈格孢菌菌株對(duì)白三葉有一定的致病力.一般來說，感病指數(shù)隨著患病時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加，但是本實(shí)驗(yàn)中整個(gè)感病期變化不明顯，接種9天后感病指數(shù)剛超過50%，這表明：鏈格孢菌雖然可以侵染白三葉，但并不對(duì)其生長(zhǎng)造成致命性影響，這與野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)銅尾礦復(fù)墾植物白三葉雖然受到病原菌侵染，仍能正常生長(zhǎng)的結(jié)果一致，因此，來源于銅尾礦區(qū)白三葉有著良好的抵抗鏈格孢菌葉斑病的能力.

植物體內(nèi)，酚類氧化物和木質(zhì)素的形成可以增強(qiáng)植物細(xì)胞壁、形成保護(hù)屏障，以抵御病原微生物傷害，醌類及衍生物對(duì)病原微生物毒性強(qiáng)，能直接產(chǎn)生抗病作用[14].多酚氧化酶，不僅是在一些酚類氧化物和木質(zhì)素的產(chǎn)生過程中起到催化作用的酶類，還能進(jìn)一步氧化酚類物質(zhì)成醌類,大量研究表明，病原菌感染可引起植物體內(nèi)多酚氧化酶活性升高[15-17].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在受到病原菌感染后，接種組的葉片多酚氧化酶活性在開始時(shí)增加迅速，且增加數(shù)值大，接種后5天內(nèi)快速增加到最大值后開始緩慢下降.這種變化揭示，白三葉在鏈格孢菌感染后，多酚氧化酶活性快速增加，使得抵抗病原菌的酚類物質(zhì)、木質(zhì)素和醌類物質(zhì)快速大量產(chǎn)生，從而可以通過增加機(jī)械屏障直接產(chǎn)生毒害作用來阻擋入侵的病原菌的傷害與擴(kuò)散,寄主植物表現(xiàn)出對(duì)葉斑病的抗病性.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染鏈格孢菌的實(shí)驗(yàn)組中，白三葉草葉片的過氧化物酶活性較不接種組增加.試驗(yàn)周期內(nèi)，染病天數(shù)增加，酶活性也隨之增加.過氧化物酶在植物體內(nèi)，對(duì)于合成植保素、木質(zhì)素和氧化酚類物質(zhì)的過程中起重要作用，同時(shí)，它也是植物體內(nèi)的活性氧清除劑[17].因?yàn)橹参镌谑艿讲≡⑸锔腥竞螅w內(nèi)可以形成大量活性氧，而過氧化物酶增加可以幫助清除這些活性氧，從而保護(hù)植物免受其傷害.同時(shí)，過氧化物酶活性增加后，還能直接促進(jìn)植保素、木質(zhì)素合成過程，抵抗鏈格孢菌侵染和擴(kuò)散，增加抗病能力.

在植物抗病反應(yīng)中，苯丙烷類代謝可形成植保素、木質(zhì)素和酚類化合物等多種抗病次生物質(zhì)，是重要的代謝途徑，而苯丙氨酸解氨酶是這一途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，受多種因素(病原物侵染、旱、冷及其他逆境等)誘導(dǎo)調(diào)控[3].許多研究表明，植物受病原菌侵染后，苯丙氨酸解氨酶活性會(huì)升高[4,18-20].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鏈格孢菌侵染后，白三葉草葉片苯丙氨酸解氨酶活性顯著增加，表明植物體快速開啟一系列苯丙烷類的反應(yīng)，加速植保素和木質(zhì)素大量合成來抵御病菌，表現(xiàn)出抗病性.

病原菌侵染后植物葉片防御酶活性與抗病性關(guān)系的報(bào)道大多認(rèn)為，多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶這三種酶在植物受病原菌侵染后活性升高，并與抗病性成正相關(guān)，可以將其作為衡量植株抗病性生理指標(biāo)[18-20].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種后多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶三種酶活性均升高，出現(xiàn)的高峰時(shí)間略有不同，多酚氧化酶的高峰出現(xiàn)在第5天，過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶均在第7天出現(xiàn)高峰.因此，在白三葉感染鏈格孢菌后，不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為上述三種酶在任何發(fā)病時(shí)期都可以作為抗病性指標(biāo)，還要綜合考慮發(fā)病的時(shí)間來確定.

綜上，鏈格孢菌對(duì)白三葉有一定的致病力，侵染后使白三葉體內(nèi)與抗病相關(guān)的酶如多酚氧化酶、過氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶三種酶活性升高，促使了木質(zhì)素、植保素等保護(hù)性物質(zhì)的合成，提高了白三葉對(duì)鏈格孢菌的抗病性.

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【責(zé)任編輯 馬小俠】

Changes of Related Defense Enzyme Activity in Resistance to the Leaf Spot Disease of a Reclamation Plant in Copper Tailing

LI Jing1, 2, ZHA Mei-ling1, WANG Xu-chun1

(1. Department of Life Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China; 2. College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu, 241000, China)

Through pot cultivation experiments, the effects ofA.tenuison changes of related defense enzyme activity in resistance to the leaf spot disease of white clover, a reclamation plant in copper tailing, were studied. The results showed thatA.tenuishas some virulence to white clover but susceptible index is not high. Compared with the non-inoculated control group, polyphenol oxidases, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity of white clover leaves in inoculated group significantly increased. With prolonged illness, activity of the three enzyme and lignin content firstly increased and then decreased. Polyphenol oxidase activity peaked at 5 d, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity were reached the peak at 7 d.

reclamation plant; resistance; enzyme activities

2014-04-13

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目：安徽銅陵藥用植物鳳丹種植區(qū)土壤及藥材中重金屬含量及其健康風(fēng)險(xiǎn)初步評(píng)價(jià)(KJ2013Z208)；蚌埠醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目：重金屬銅污染土壤復(fù)墾植物白三葉草的抗病性機(jī)制研究(Byky1207)

李晶(1981—)，女，江蘇揚(yáng)州人，蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系講師，安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生，主要從事生態(tài)學(xué)和天然藥物研究.

S

A

1009-5128(2015)10-0030-05