毛果楊HDA901基因的克隆和表達(dá)分析

呂世博，毛昱力，姜廷波，馬旭俊

（東北林業(yè)大學(xué) 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實驗室，哈爾濱150040）

組蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳修飾，包括組蛋白乙?；腿ヒ阴；?個動態(tài)的、可逆的過程。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）介導(dǎo)組蛋白去乙?；?，與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）共同作用來調(diào)節(jié)組蛋白乙?；臓顟B(tài)。組蛋白乙?；癄顟B(tài)能夠影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種生命活動。HAT 是將乙?；o酶A 上的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到組蛋白的賴氨酸殘基上；而HDAC的作用是將組蛋白賴氨酸殘基上的乙?；鶊F(tuán)去除。HDAC 介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)處于緊縮狀態(tài)，不利于轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與DNA 結(jié)合，因此，一般被認(rèn)為與基因的抑制或沉默有關(guān)。近年來，組蛋白去乙酰化酶的功能研究越來越受到重視。研究表明HDAC在植物的生長、發(fā)育和脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮十分重要的調(diào)節(jié)作用［1］。

HDAC是一個多基因家族，根據(jù)與酵母HDAC（RPD3、HDA1 和SIR2）序列的同源比較，植 物HDAC可分為3 個亞家族：RPD3／HDA1、SIR2 和HD2。其中RPD3／HDA1亞家族是一種Zn2＋－依賴性組蛋白去乙?；福涿富钚缘陌l(fā)揮依賴于Zn2＋的存在。RPD3／HDA1 亞家族基因表達(dá)水平的改變（如表達(dá)上調(diào)或下降），均能影響植物的生長和發(fā)育，并產(chǎn)生表型的改變［2－3］。RPD3／HDA1類型的組蛋白去乙?；冈谥参锷锩{迫（病蟲害）和非生物脅迫（高鹽、干旱、低溫）反應(yīng)中也具有十分重要的調(diào)節(jié)作用［4－9］。目前，HDAC研究主要集中在玉米、擬南芥、水稻等草本植物中，而木本植物HDAC 的研究鮮有報道。楊樹具有生長快、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)。但楊樹組蛋白去乙?；富虻目寺『凸δ苎芯课匆妶蟮?。本研究克隆了毛果楊RPD3／HDA1類型的組蛋白去乙酰化酶基因HDA901的編碼區(qū)序列，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及亞細(xì)胞定位和鹽脅迫下的表達(dá)分析，為深入研究組蛋白去乙酰化酶基因在楊樹鹽脅迫反應(yīng)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材 料

毛果楊組培幼苗由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實驗室程玉祥教授提供。選取株高和生長狀態(tài)一致的4周齡毛果楊幼苗，200 mmol／L NaCl處理0、12和48h，3個重復(fù)。分別剪取處理后植株的葉片、莖和根，液氮速凍后保存于－80℃，用于總RNA 的提取。

1．2 方 法

1．2．1 毛果楊HDA901基因的克隆 采用Trizol試劑提取NaCl處理后毛果楊葉片、莖和根的總RNA。采用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）試劑盒將所提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為模板用于毛果楊HDA901基因序列的克隆和實時熒光定量PCR 分析。

以毛果楊cDNA 為模板，采用上游引物（5′－GCTCTAGAATGGAGCTTCAAACTTTCCG－3′）和下游引物（5′－GGGGTACCTCAGAGGGAATGTATGTGTT－3′），擴(kuò)增毛果楊HDA901 基因全長編碼序列（ORF）。使用DNA 凝膠回收試劑盒（Omega）回收PCR 產(chǎn)物，然后克隆到pMD18－T Vector（TaKaRa）載體上，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α 中。PCR 驗證陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1．2．2 毛果楊HDA901蛋白序列生物信息學(xué)分析利用ExPaSy提供的在線程序ProtParam（http：／／web．expasy．org／protparam／）對毛果楊HDA901蛋白的一級結(jié)構(gòu)、分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析。利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫Conserved Domain Database（CDD）（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／cdd／）對毛果楊HDA901蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。通過染色質(zhì)數(shù)據(jù)庫ChromDB（http：／／www．chromdb．org／）的Blasp程序獲得毛果楊HDA901同源蛋白的氨基酸序列。利用軟件DNAMAN 對毛果楊HDA901與其他植物中的同源蛋白進(jìn)行多重序列比對分析；利用軟件MEGA 5．0對毛果楊HDA901與其他植物中的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。利用在線啟動子分析軟件PlantCare（http：／／bioinformatics．psb．ugent．be／webtools／plantcare／html／）對毛果楊HDA901基因的啟動子進(jìn)行分析。利用在線軟件WoLF PSORT（https：／／wolfpsort．org／）預(yù)測毛果楊HDA901 蛋白的亞細(xì)胞定位。

1．2．3 毛果楊HDA901 的亞細(xì)胞定位 毛果楊HDA901基因的ORF 序列與GFP 構(gòu)建成融合表達(dá)載體。采用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮，使其瞬時表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中的定位。

1．2．4 實時熒光定量PCR 分析 運(yùn)用軟件Primer 5設(shè)計實時熒光定量PCR 上游引物（CAGCTGGAGCAGGACTAACC）和下游引物（GCCCTTTTGGAATAGCATGA）。分 別 提 取200 mmol／L NaCl處理0、12 和48h 的毛果楊根、莖和葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為模板，采用SYBR PremixExTaqTMkit試劑盒（Takara）進(jìn)行實時熒光定量PCR 分析。PCR 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30 s，44個循環(huán)。以18S作為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)3 次。通過Ct值來確定基因的表達(dá)水平，以2－ΔΔCt法計算NaCl處理不同時間毛果楊HDA901基因的相對表達(dá)量。采用t檢驗分析毛果楊HDA901基因在鹽處理不同時間表達(dá)水平的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2．1 毛果楊HDA 901基因的克隆與序列分析

采用毛果楊HDA901特異性引物，以毛果楊葉片cDNA 為模板，通過PCR 方法獲得HDA901基因開放閱讀框（ORF）擴(kuò)增片段（圖1）。測序結(jié)果表明，毛果楊HDA901基因ORF序列全長為1 245bp，編碼1個由414個氨基酸組成的蛋白質(zhì)（圖2）。

2．2 毛果楊HDA901的生物信息學(xué)分析

通過在線ExPaSy的ProtParam 軟件對毛果楊HDA901基因編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析表明，該蛋白的理論分子量為45．2kD，理論等電點(diǎn)為5．77。利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD），對HDA901 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明，在氨基酸序列的第61和378之間存在一個組蛋白去乙酰化酶結(jié)構(gòu)域（HDAC＿ClassⅡ），該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏grelinase＿HDAC超家族。

利用DNAMAN 軟件，將毛果楊HDA901基因的編碼蛋白與來自6個物種的HDAC 蛋白進(jìn)行多重序列比對分析，結(jié)果表明這些組蛋白去乙?；冈诎被嵝蛄猩暇哂懈叨缺Ｊ匦裕▓D3）。對應(yīng)于毛果楊HDA901的152－216位氨基酸殘基處，來自不同植物的HDAC蛋白存在一段長為65個氨基酸殘基的高度保守序列，這一段序列極有可能是該蛋白的重要功能位點(diǎn)。毛果楊HDA901 與桃PpHDA5807的氨基酸序列一致性最高（90%）；與玉米ZmHDA118、擬南芥AtHDA14、水稻OsHDA714具有較高的一致性，分別為88%、87%、85%；與火炬松PtHDA1801 和云杉PaHDA 的一致性也較高，分別為84%和81%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，相同科的植物可以聚為一類，如火距松和云杉都屬于松科。單子葉植物（玉米和水稻）的HDAC 在進(jìn)化上處于一個分支；雙子葉植物毛果楊HDA901 與擬南芥AtHDA14的親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖1 毛果楊HDA901的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR amplification of HDA901 fromP．trichocarpa

圖2 毛果楊HDA 901基因的ORF序列和編碼氨基酸序列Fig．2 The ORF sequence and deduced amino acid sequence of HDA 901in P．trichocarpa

圖3 毛果楊HDA901與其它物種中HDAC的氨基酸序列比對Fig．3 Amino acid sequence alignment of HDA901and HDACs from the other plants

利用在線啟動子分析軟件PlantCare，對毛果楊HDA901基因的啟動子進(jìn)行分析（表1）。毛果楊HDA901基因的啟動子序列來自Phytozome（http：／／phytozome．jgi．doe．gov／pz／portal．html）數(shù)據(jù)庫，選取HDA901上游3 000bp序列作為其啟動子進(jìn)行分析。在HDA901啟動子序列中，有顯著的啟動子元件TATA－box、CAAT－box、增強(qiáng)子以及TCrich repeat序列。在HDA901啟動子區(qū)域中，還存在大量的與光反應(yīng)相關(guān)的元件，如3－AF1binding site、ACE、AT－rich element、Box 4、Box I、G－box 和I－box等。根據(jù)這些結(jié)果推測，毛果楊HDA901基因很可能參與楊樹的光反應(yīng)。此外，在HDA901啟動子區(qū)域還存在其他一些元件，如GA調(diào)節(jié)元件GARE－motif、ABA 反應(yīng)元件ABRE、熱響應(yīng)元件HSE、真菌誘導(dǎo)元件Box－W1、以及胚乳發(fā)育的相關(guān)元件Skn－1＿motif。這些元件的存在表明毛果楊HDA901參與多個生物學(xué)反應(yīng)過程，涉及到光調(diào)節(jié)、植物激素反應(yīng)、脅迫反應(yīng)以及早期發(fā)育中的生物學(xué)調(diào)控。

圖4 毛果楊HDA901與其它植物同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig．4 Phylogenetic tree analysis of HDA901 and HDACs from the other plants

2．3 毛果楊HDA901的亞細(xì)胞定位

利用在線軟件WoLF PSORT對毛果楊HDA901亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測分析。預(yù)測結(jié)果表明，HDA901 不存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，主要位于線粒體，同時也穿梭于葉綠體和線粒體之間。為了確定毛果楊HDA901蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，構(gòu)建了HDA901－GFP的瞬時表達(dá)載體，觀察HDA901在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示HDA901既沒有定位于細(xì)胞核中，也沒有定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖5）。毛果楊HDA901在細(xì)胞內(nèi)的分布有別于其他植物組蛋白去乙?；?，預(yù)示著其可能具有不同的功能。

2．4 毛果楊HDA 901基因在鹽脅迫下的表達(dá)

采用實時熒光定量PCR 的方法，分析了200 mmol／L NaCl處理不同時間毛果楊HDA901基因在幼苗根、莖和葉中的表達(dá)情況，結(jié)果表明HDA901基因的表達(dá)受鹽脅迫的調(diào)節(jié)（圖6）。在鹽脅迫下，根和莖中HDA901基因的表達(dá)模式相同，而與葉中的表達(dá)模式不同。在根和莖中，NaCl處理抑制HDA901基因的表達(dá)，隨著鹽處理時間的增加其表達(dá)量持續(xù)下降；鹽處理12h和48h后，毛果楊HDA901基因的表達(dá)量顯著低于處理前（0h）的表達(dá)量。而在葉中，NaCl處理12h時，HDA901基因的表達(dá)量顯著增強(qiáng)，鹽處理48h后其表達(dá)量回落。這些結(jié)果表明HDA901參與鹽脅迫反應(yīng)，在不同器官其表達(dá)水平受到不同的調(diào)節(jié)。

表1 毛果楊HDA 901基因啟動子序列的順式作用元件Table 1 Cis－acting elements in the promoter of HDA 901in P．trichocarpa

圖5 毛果楊HDA901的亞細(xì)胞定位Fig．5 Sub－cellular localization of HDA901

圖6 鹽脅迫下毛果楊HDA901基因的表達(dá)Fig．6 The expression of HDA901gene under salt stress

3 討 論

在多種植物中的研究表明組蛋白去乙?；钢饕植加诩?xì)胞核內(nèi)，也在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器（如葉綠體和線粒體）中有分布，或穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間［1］。利用生物信息學(xué)軟件WoLFPSORT，對毛果楊HDA901蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測分析，結(jié)果顯示HDA901蛋白不存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，主要位于線粒體，同時也穿梭于葉綠體和線粒體之間。此外，分析毛果楊HDA901基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果證實了HDA901確實沒有定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。由于洋蔥表皮細(xì)胞沒有葉綠體，線粒體也不易觀察，因此無法確定HDA901在葉綠體和線粒體中的分布情況。HDA901 很可能分布于線粒體和（或）葉綠體中，參與這些細(xì)胞器基因表達(dá)的調(diào)控。為了進(jìn)一步確定毛果楊HDA901的亞細(xì)胞分布，明確其是否在葉綠體或線粒體中存在，可以將HDA901 遺傳轉(zhuǎn)化到植物中并穩(wěn)定表達(dá)，或進(jìn)行原生質(zhì)體瞬時表達(dá)，從而確定HDA901在細(xì)胞內(nèi)的哪些部位發(fā)揮其功能。

擬南芥等植物的研究表明組蛋白去乙?；冈谏锖头巧锩{迫反應(yīng)中發(fā)揮十分重要的調(diào)節(jié)作用。本研究對鹽脅迫下毛果楊HDA901基因的表達(dá)結(jié)果表明，毛果楊HDA901基因的表達(dá)受鹽脅迫的調(diào)節(jié)，而且HDA901基因表達(dá)模式在不同組織會有不同，根和莖HDA901基因的表達(dá)受鹽脅迫的抑制，葉HDA901基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)，這與水稻中的研究一致。Fu等［10］的研究表明水稻葉片HDA714的表達(dá)也受鹽脅迫的誘導(dǎo)。此外，啟動子序列分析顯示毛果楊HDA901基因的啟動子序列中含有多個與光反應(yīng)、生物或非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，暗示HDA901還可能參與光反應(yīng)或生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)外界刺激存在時，脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可能通過與這些順式作用元件的結(jié)合，調(diào)控毛果楊HDA901的轉(zhuǎn)錄。

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