安汶鎧，常 丹，張富春

（新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046）

棉花作為新疆的主要經(jīng)濟(jì)作物，干旱是制約新疆棉區(qū)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因素之一。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）作為一種影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆的植物內(nèi)源激素，在提高植物抗鹽、抗旱、耐高溫以及調(diào)節(jié)植物衰老等生理功能方面發(fā)揮重要作用［1－2］。研究表明BR能夠廣泛參與植物各種生理過(guò)程，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)逆境條件下的生理響應(yīng)［3－6］。經(jīng)過(guò)BR噴施處理后，植物葉片含水量增加，葉片水勢(shì)提高，且植物的蒸騰作用明顯降低，這樣既保持了細(xì)胞膨壓，又能夠緩解干旱脅迫，改善植物細(xì)胞中的水分狀況，提高植物在干旱脅迫下的生存能力。近年來(lái)，隨著B(niǎo)R 促進(jìn)植物抗逆性研究的深入，BR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)中［7－12］。

BZR1／BES1是BR 信號(hào)通路中一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，與BR 結(jié)合后使得BRI1的羧端磷酸化，調(diào)控BKI1（BRI1kinase inhibitor1）從質(zhì)膜上解離下來(lái)，使BRI1 與共受體BAK1（BRI1－associated receptor kinase）結(jié) 合［13－14］，并 形 成 異 源 二 聚 體，進(jìn) 而通過(guò)相互磷酸化完全激活BR 信號(hào)通路［15］，異二聚體BRI1－BAK1可使得BSK 激活，BSK 又能夠活化BSU11（BRI 1suppressor 1），BSU1 可 使 下 游 的BIN2 （Brassinosteroid－insensitive 2）失 活［16］，而B(niǎo)IN2則影響B(tài)ZR1／BES1的磷酸化［17］。Kim 等發(fā)現(xiàn)磷酸化后的BZR1／BES1 失去了核輸出以及與DNA 結(jié)合的能力，并且可被蛋白酶降解，被激活的BSU1可以使BIN2的Tyr磷酸化位點(diǎn)去磷酸化從而抑制其活性，使得BZR1／BES1 被蛋白磷酸2A（PP2A）去磷酸化，最終在細(xì)胞核內(nèi)大量積累［18］。核內(nèi)聚集的BZR1／BES1能夠與下游基因啟動(dòng)子上特定區(qū)域結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)BR 靶基因的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆性能［19］。因此研究BR 信號(hào)通路中基因BZR1／BES1的表達(dá)調(diào)控機(jī)理顯得尤為重要。

本研究以新疆的主栽棉花品種‘新陸早17號(hào)’的幼苗為材料，根據(jù)亞洲棉‘石系亞1號(hào)’的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中轉(zhuǎn)錄因子BES1／BZR1基因的開(kāi)放閱讀框序列［20］，通過(guò)PCR 克隆獲BES1／BZR1轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為GhBES1／BZR1（GenBank登錄號(hào)KP272000）；在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討干旱脅迫下用油菜素內(nèi)酯及油菜素內(nèi)酯抑制劑（Z）處理棉花后，Gh－BES1／BZR1的表達(dá)變化規(guī)律，研究外源噴施植物激素BR對(duì)干旱脅迫下棉花GhBES1／BZR1表達(dá)的影響，揭示BR提高棉花抗旱能力的分子機(jī)制，為棉花生產(chǎn)中合理使用BR提供依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

棉花‘新陸早17號(hào)’種子由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所瑪納斯實(shí)驗(yàn)站提供。挑選籽粒飽滿(mǎn)大小一致的棉花種子，用70%乙醇消毒1min，蒸餾水沖洗3～4次，用15%過(guò)氧化氫浸種5h，再用蒸餾水沖洗3～4次，播種到固體MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，10d 后將棉花幼苗轉(zhuǎn)至Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液［21］中繼續(xù)進(jìn)行液體培養(yǎng)，每隔5～7d換1次營(yíng)養(yǎng)液，以5～6片真葉期的棉花幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。

1．2 方 法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)材料的處理 待棉花幼苗生長(zhǎng)至5～6片真葉期時(shí)，用2．5% PEG－6000干旱脅迫處理24 h后，分別用水、BR（0．5mg／L）和Z（1．0mg／L，BR抑制劑）噴施。具體處理組為：（1）Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋蒸餾水為對(duì)照組（CK）；（2）含2．5%PEG－6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋蒸餾水（PEG）；（3）Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋0．5mg／L BR（BR）；（4）含2．5%PEG－6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋0．5 mg／L BR（PEG＋BR）；（5）含2．5% PEG－6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋0．5 mg／L BR＋1．0 mg／L Z（PEG＋BR＋Z）；（6）含2．5%PEG－6000的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液＋1．0 mg／L Z（PEG＋Z）。每隔3h進(jìn)行1次噴灑處理，在0、3、6、12、24h時(shí)采集不同處理的不同棉花幼苗底部倒數(shù)第3～4片的10個(gè)葉片，分別稱(chēng)取0．1g棉花幼苗葉片，迅速凍于液氮中備用。

1．2．2 棉花幼苗總RNA 的提取和cDNA的合成 取0．1g棉花幼苗葉片在液氮中充分研磨，采用植物總RNA 提取試劑盒（北京百泰克公司）提取棉花總RNA，接著進(jìn)行定量和電泳檢測(cè)。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（大連TaKa－Ra公司）試劑盒合成cDNA。

1．2．3 GhBES1／BZR1 基因的擴(kuò)增和鑒定 根據(jù)亞洲棉‘石系亞1號(hào)’轉(zhuǎn)錄因子BES1／BZR1的開(kāi)放閱讀框序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框的上游引物（5′－GCGCTGCTTTGAGGAAGGTATTG－3′）和 下 游引 物（5′－CTGACAGTGTTTGCTTGATGTGATGCTC－3′），以棉花幼苗葉片的cDNA 為模板，使用ExTaq酶PCR 擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s；72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的基因片段，與pMD18－T 載體連接，并轉(zhuǎn)化E．coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選菌液進(jìn)行PCR 及質(zhì)粒酶切鑒定的陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1．2．4 GhBES1／BZR1 蛋白生物信息學(xué)分析 利用ExPASy ProtParam（http：／／expasy．org／tools／pi＿tool．html）分析GhBES1／BZR1蛋白的理化性質(zhì)及疏水性；用NCBI CDD 數(shù)據(jù)庫(kù)分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，用SignalP4．0Server（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP）軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；Cell－PLoc 2．0PSORT（http：／／psort．ims．u－tokyo．a(chǎn)c．jp／form．html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；GOR4（http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa＿automat．pl）軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；NetPhos（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／NetPhos）分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)；NPS Prosite Scan（http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／pattern＿prosite．pl）分析蛋白活性位點(diǎn)；用MEGA 5．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［22－23］。

1．2．5 不同處理GhBES1／BZR1基因的表達(dá) 根據(jù)GhBES1／BZR1的cDNA 序列設(shè)計(jì)上游引物（5′－TGGGATGAAATGAATGCTGGGC－3′）和下游引物（5′－AGTGTAAGTTCGAGATCATCAGCTGC－3′），以18S基因作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)上游引物（5′－CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT－3′）和下游引物（5′－CAAGGAATCGAAACGAAAGAAGG－3′）。以處理組棉花幼苗葉片的cDNA 為模板，取1．0μL cDNA，qRT－PCR 參照帶有ROX 的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix－UDG（美國(guó)Invitrogen公司）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RT－PCR 反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性15s；94 ℃變性30s；59 ℃退火30s；72 ℃延 伸45s；40 個(gè) 循 環(huán)。采 用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT法進(jìn)行分析［24］。

2 結(jié)果與分析

2．1 GhBES1／BZR1基因的克隆和鑒定

以棉花‘新陸早17號(hào)’幼苗葉片的cDNA 為模板，以根據(jù)BES1／BZR1基因開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)PCR 進(jìn)行GhBES1／BZR1 開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增。結(jié)果表明PCR 擴(kuò)增出與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度一致的條帶（圖1），測(cè)序結(jié)果表明開(kāi)放閱讀框?yàn)?60bp，編碼319 個(gè)氨基酸，提交NCBI 基因庫(kù)（GenBank登錄號(hào)KP272000），所獲得的GhBES1／BZR1基因?yàn)檎_的目的基因。

2．2 GhBES1／BZR1蛋白的理化特性和結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)在線EXPASY 的ProtParam 軟件對(duì)BES1／BZR1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析表明，GhBES1／BZR1蛋白的理論分子量為34．3kD，理論等電點(diǎn)為8．95。利用在線NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（conserved domain database，CDD）對(duì)Gh－BES1／BZR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果說(shuō)明GhBES1／BZR1蛋白含有一個(gè)DUF822 保守結(jié)構(gòu)域，而DUF822為基因未知功能的植物蛋白，此家族由未知功能的幾個(gè)植物蛋白的N 末端區(qū)域組成。利用SignalP4．0Server軟件對(duì)GhBES1／BZR1 蛋白進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。結(jié)果說(shuō)明GhBES1／BZR1蛋白的N 端不存在剪切位點(diǎn)，表明其不包含信號(hào)肽，推測(cè)GhBES1／BZR1蛋白為非分泌蛋白。利用在線EXPASY 的ProtParam 軟 件 對(duì)GhBES1／BZR1 蛋白的疏水性／親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)。推測(cè)GhBES1／BZR1蛋白是一種可溶性蛋白。利用在線軟件GOR4對(duì)GhBES1／BZR1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，GhBES1／BZR1蛋白主要由α－螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈構(gòu)成（表1）。其中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)最多，占據(jù)整條鏈的62．07%。α－螺旋占了24．76%，其余的全為延伸鏈。

圖1 GhBES1／BZR1基因的PCR 擴(kuò)增Fig．1 PCR amplification of GhBES1／BZR1gene M．DL2000；1，2．GhBES1／BZR1

表1 GhBES1／BZR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 1 GhBES1／BZR1protein of secondary structure prediction

2．3 GhBES1／BZR1 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及活性位點(diǎn)的分析

磷酸化是生物體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)方式，主要在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮作用［25］。利用NPS（network protein sequence analysis）的Prosite Scan對(duì)GhBES1／BZR1蛋白進(jìn)行活性位點(diǎn)分 析。如 表2 所 示，GhBES1／BZR1 有3 類(lèi) 磷 酸 化位點(diǎn)和1類(lèi)N－糖基化位點(diǎn)、1類(lèi)酰胺化位點(diǎn)和1類(lèi)豆蔻酰化位點(diǎn)。

2．4 GhBES1／BZR1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索GhBES1／BZR1同源蛋白序列，使用MEGA 5．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其結(jié)果表明GhBES1／BZR1 蛋白和可可聚類(lèi)在一起（圖2），Blast比對(duì)編碼棉花和可可這兩種植物同源蛋白的序列相似度達(dá)到99%。

2．5 干旱脅迫下不同處理GhBES1／BZR1基因的表達(dá)分析

采用qRT－PCR 方法，以18S作為內(nèi)參基因，分別檢測(cè)不同處理和不同時(shí)間棉花幼苗葉片Gh－BES1／BZR1的表達(dá)變化（圖3）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，處理3h時(shí)，PEG－6000處理相對(duì)于水處理的GhBES1／BZR1 基因表達(dá)量極顯著地上調(diào)了3．9倍（P＜0．01），PEG－6000處理下噴灑BR（PEG＋BR）相對(duì)于其他處理基因的表達(dá)量最高，而PEG＋BR 處理下再?lài)姙R 抑制劑（PEG＋BR＋Z）相對(duì)于PEG＋BR 處理有顯著性的降低（P＜0．05）。說(shuō)明PEG 處理下噴施BR 能夠顯著提高GhBES1／BZR1的表達(dá)，而噴施BR 抑制劑后Gh－BES1／BZR1的表達(dá)顯著降低。處理6h時(shí)，PEG＋BR 處理的基因表達(dá)量相對(duì)于其他處理是最高，除PEG 處理和PEG＋BR 處理外，其它處理下該基因的表達(dá)量都有所上升，PEG＋BR 處理的基因表達(dá)量有所下降，但相互之間都無(wú)顯著性差異（P ＞0．05）。說(shuō)明在6h直接噴施BR 和在PEG－6000處理下噴施BR 均能夠顯著提高GhBES1／BZR1，而噴施BR 抑制劑后GhBES1／BZR1的表達(dá)也顯著降低。處理12h時(shí)，各處理的GhBES1／BZR1表達(dá)量相對(duì)于6h處理都有所下降，而PEG＋BR 處理的基因表達(dá)量依然最高，并顯著性地高于PEG－6000處理和PEG＋BR＋Z 處理（P＜0．05），分別是其1．3和1．6倍。處理24h時(shí)，PEG＋BR 處理的基因表達(dá)量降低，直接噴施BR 處理的基因表達(dá)量達(dá)到最高。而PEG＋Z和PEG＋BR＋Z處理的基因表達(dá)量只有BR 處理組的1／7 左右。說(shuō)明隨著PEG處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在PEG 處理下噴施BRGhBES1／BZR1的表達(dá)明顯下降，而噴施BR 抑制劑后Gh－BES1／BZR1的表達(dá)更加顯著降低，已經(jīng)低于對(duì)照組，說(shuō)明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BR 抑制劑極大地降低了GhBES1／BZR1的表達(dá)。

表2 GhBES1／BZR1在NPS中活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析Table 2 The prediction analysis of GhBES1／BZR1active site in NPS

圖3 干旱脅迫下不同處理‘新陸早17號(hào)’棉花幼苗葉片中GhBES1／BZR1的相對(duì)表達(dá)不同小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同處理下差異顯著（P＜0．05）Fig．3 Relative expression of GhBES1／BZR1 in the seedling leaves of cotton‘XLZ17’for the different treatments under drought stress Different letters represent significant differences among treatments under the same time（P＜0．05）

3 討 論

BR 作為一種重要的植物內(nèi)源激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御干旱方面發(fā)揮作用。BES1／BZR1作為BR 信號(hào)通路中的一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的BES1／BZR1蛋白是植物防御的一種內(nèi)源信號(hào)分子，當(dāng)植物受到各種脅迫時(shí)，可以誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)去抵御外界的脅迫，并直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育同時(shí)調(diào)節(jié)植物的生理代謝過(guò)程［26－27］。

通過(guò)對(duì)棉花‘新陸早17號(hào)’GhBES1／BZR1 基因序列的生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與可可編碼的BES1／BZR1氨基酸序列的相似性達(dá)99%，且與可可的BES1／BZR1聚在進(jìn)化樹(shù)的同一分支上，這表明其進(jìn)化上與可可具有趨同性。利用NPS的Prosite Scan 對(duì)BES1／BZR1蛋白進(jìn)行活性位點(diǎn)分析結(jié)果表明，GhBES1／BZR1有3類(lèi)磷酸化，這可能是與GhBES1／BZR1蛋白的磷酸化參與調(diào)解干旱脅迫的信號(hào)通路有關(guān)。蛋白質(zhì)的疏水性通常依據(jù)蛋白的GRAVY 值預(yù)測(cè)，而GRAVY 值通常分布在－2～2之間，正值表明蛋白為疏水蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白。預(yù)測(cè)顯示Gh－BES1／BZR1蛋白的GRAVY 值為－4．211，說(shuō)明GhBES1／BZR1 蛋白是一種可溶性蛋白，結(jié)果與BES1／BZR1蛋白不與膜結(jié)合在細(xì)胞核內(nèi)與特定啟動(dòng)子發(fā)揮作用的結(jié)果相一致［13］。表明該蛋白可能是一種能夠通過(guò)磷酸化和去磷酸化在BR 信號(hào)通路中發(fā)揮作用的可溶性蛋白。

BR 在作物上的應(yīng)用主要是浸種或外源噴等，有關(guān)BR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要組分如GhBES1／BZR1基因表達(dá)變化對(duì)作物抗旱性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)河南棉花所對(duì)亞洲棉進(jìn)行干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，BR 信號(hào)通路中BES、BKI、BRI 等基因的表達(dá)上調(diào)，其中PEG 模擬干旱脅迫3h后，亞洲棉‘石系亞1 號(hào)’葉中GhBES1／BZR1 表達(dá)量上調(diào)了2．7 倍［20］。本研究結(jié)果中，PEG－6000模擬干旱脅迫，PEG＋BR 處理3h 時(shí)GhBES1／BZR1基因的表達(dá)量分別是PEG 和PEG＋BR＋Z處理的1．9倍和1．7倍。BR 處理6和12h時(shí)，GhBES1／BZR1表達(dá)量相對(duì)于3h時(shí)都有明顯下降，但噴施BR 表達(dá)量明顯高于沒(méi)有噴施BR 處理組，而B(niǎo)R＋Z處理GhBES1／BZR1表達(dá)量降低，這說(shuō)明噴施BR能夠誘導(dǎo)GhBES1／BZR1表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)R 抑制劑Z能夠干涉BR 的作用致使GhBES1／BZR1表達(dá)下降。噴施BR 處 理 下3h 時(shí)，GhBES1／BZR1 表 達(dá)量快速升高，表明在干旱脅迫下噴施BR 能夠讓GhBES1／BZR1表達(dá)快速升高以響應(yīng)干旱脅迫。而噴 施BR 6、12 和24h 相 對(duì) 于3h 處 理GhBES1／BZR1表達(dá)有所下降，則表明在干旱脅迫下噴施BR對(duì)于GhBES1／BZR1表達(dá)的影響在時(shí)間上沒(méi)有持久性，伴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)誘導(dǎo)作用逐漸減弱，與植物激素作用快的特性相一致。在沒(méi)有干旱脅迫而單獨(dú)噴施BR 處理24h時(shí)，GhBES1／BZR1表達(dá)量遠(yuǎn)高于干旱脅迫下噴施BR 處理。說(shuō)明干旱脅迫下噴施BR 可快速誘導(dǎo)GhBES1／BZR1 表達(dá)，但在沒(méi)有干旱脅迫下噴施BR 誘導(dǎo)GhBES1／BZR1表達(dá)明顯存在一定的滯后性，證明干旱脅迫下噴施BR 是Gh－BES1／BZR1快速表達(dá)誘導(dǎo)因素。

總之，從棉花‘新陸早17號(hào)’幼苗中克隆獲得的轉(zhuǎn)錄因子GhBES1／BZR1，在BR 信號(hào)通路的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在干旱脅迫下外源噴施BR及BR 抑制劑Z對(duì)棉花GhBES1／BZR1基因表達(dá)有明顯的影響。表明BR 是促進(jìn)干旱脅迫下Gh－BES1／BZR1表達(dá)的主要誘因，干旱脅迫和非干旱脅迫噴施BR 能夠直接影響GhBES1／BZR1表達(dá)水平升高的速率。進(jìn)一步探討外源噴施BR 對(duì)棉花GhBES1／BZR1表達(dá)的影響，有助于闡明BR 調(diào)控棉花抗旱性的分子機(jī)理。

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