王煉 楊碧霞 張新申 鄭洪國 冉良驥
摘 要 建立了親水作用-反相二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乳制品中β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、氨基糖苷、酰胺醇、喹諾酮和磺胺7類20種抗生素殘留的方法。樣品與C18和CN填料混合,進(jìn)行基質(zhì)固相分散萃取,以乙腈和水洗脫,洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,殘渣流動相溶解后分析。對樣品前處理條件、色譜流動相、質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。各分析物回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9945~0.9998;以定量離子信噪比為3和10時所對應(yīng)的樣品中分析物濃度計算檢出限和定量限,分別為0.10~2.40 μg/kg和0.33~7.92 μg/kg。奶粉和牛奶中添加水平25 μg/kg的加標(biāo)回收率分別為72.5%~97.2%和70.1%~96.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%~8.8%和3.7%~9.9%。本方法應(yīng)用于實際樣品測定,結(jié)果滿意。
關(guān)鍵詞 親水交互作用色譜;二維液相色譜;抗生素;基質(zhì)固相分散
1 引 言
抗生素具有抑制或殺滅細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、衣原體等致病微生物的作用。廣義的抗生素常常包括: β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類(Aminoglycosides, AGs)、酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類和多肽類【1,2】。作為常用的獸藥,近年來抗生素常被多類混合添加在動物飼料中,以掩蓋單個藥物殘留量超限的現(xiàn)象。因此,為保障食品安全,建立同時檢測多類抗生素的方法意義重大。
AGs極性最強(qiáng),采用反相液相色譜(RPLC)分離,幾乎沒有保留。在流動相中加入離子對試劑,通過中和電荷降低其極性后可進(jìn)行RPLC分離,但會極大增加平衡時間,且不利于與質(zhì)譜聯(lián)機(jī)【3,4】。親水交互作用色譜(HILIC)使用RPLC的流動相,可分離強(qiáng)極性有機(jī)物,能解決了AGs的分離問題【5,6】,且易與質(zhì)譜聯(lián)用【7】。由于AGs和其它類抗生素極性差異大,抗生素多殘留分析的難點在AGs和其它類同時提取和檢測,現(xiàn)有方法通常只涉及4~5類抗生素【8~12】,且AGs和其它類抗生素同時檢測的方法鮮有報道。
本研究利用雙三元高效液相色譜儀,外接1個可變流速泵,7條流路組成親水交互作用與反相色譜二維液相色譜系統(tǒng)(HILIC-RPLC),經(jīng)三段分離,串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry, MS/MS)檢測,建立了乳制品中的7類20種抗生素同時分離、定性定量分析的方法。對HILIC-RPLC,前人也做過一些研究,但與本方法在目的和原理上有所差異。Jandera等討論了HILIC與RP的正交性,得出二者不能完全正交的結(jié)論【14】;Wang等采用4個流路兩段分離模式對12種親水和13種親脂的混合物進(jìn)行了檢測,但分析物不涉及抗生素,也未對HILIC和RP都有所保留的情況進(jìn)行探討【15】;Liang等則采用了離線HILIC-RPLC的方式【16】。本研究采用了HILIC-RPLC-MS/MS三段檢測模式,并提出了混合基質(zhì)固相分散(Mixed matrix solid phase dispersion, MMSPD)的樣品前處理技術(shù),較好地解決了7類抗生素同時提取并檢測的難點,方法簡便、快速、靈敏度高,滿足國際社會食品法規(guī)的最大允許殘留量要求。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Ultimate3000高效液相色譜儀(美國ThermoFisher公司),帶DGP-3600SD泵,帶十通閥和六通閥各1個;AXP Auxiliary Pump(美國ThermoFisher公司);3200Qtrap質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BCHI 公司);Vortex Genius3型渦旋混勻器(德國IKA公司);2034型真空泵(美國Welch公司);VisiprepTM-DL固相萃取系統(tǒng)(美國Sepulco公司)6 mL SPE空管及配套熔融玻璃隔板(美國Agilent公司);Chromatorex C18鍵合硅膠填料(40~75 μm,日本富士公司);Cleanert 氰基(CN),硅膠(Silica),強(qiáng)陽離子(SCX)填料(平均粒度45 μm,美國Agela Technologies)。
頭孢噻呋、氨芐青霉素、鄰氯青霉素、大觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素C1a、阿米卡星、卡那霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、替米考星、交沙霉素、強(qiáng)力霉素、土霉素、氯霉素(Dr. Ehrenstorfer GmbH);頭孢氨芐(Fluka公司);磺胺甲氧嗪、磺胺氯噠嗪(Sigma公司);異帕米星(上海士鋒生物科技有限公司)。甲醇和乙腈(HPLC級),乙酸銨和甲酸(色譜純)均購自Dikma公司;EDTA二鈉、草酸為分析純,實驗用水為超純水。1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液均用甲醇配制,
20 ℃條件下,頭孢氨芐和氨芐青霉素保存14天,其它抗生素保存3個月。
2.2 樣品前處理
稱取0.50 g奶粉或牛奶樣品于研缽中,加入C18和CN填料各0.50 g,加入EDTA二鈉1.00 g,用研缽充分碾磨至均勻,裝入6 mL SPE空管(底部塞入熔融玻璃隔板)中,另用熔融玻璃隔板于上部將其壓至無明顯空隙。將裝好的SPE管置于固相萃取裝置上,用2.5 mL乙腈、2.5 mL水依次清洗研缽兩次后,分步加入到SPE管中,減壓洗脫(流速控制在3 mL/min以內(nèi)),收集洗脫液,于(40±1)℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,加入20 mmol/L乙酸銨-乙腈-甲酸(5∶5∶1)至1.0 mL,渦旋混勻1.0 min后,過0.2 μm水系濾膜,供測定。
2.3 色譜-質(zhì)譜條件
2.3.1 液相色譜條件 左泵流動相:A為0.2%甲酸,B為乙腈,C為20 mmol/L草酸;右泵流動相:A為20 mmol/L乙酸銨(含0.4%甲酸),B為乙腈(含0.4%甲酸),C為水。AXP泵流動相:水;流速:0.50 mL/min (0.70~1.30 min)、0.20 mL/min(6.50~11.00 min)。色譜柱1:Inspire HILIC, (100 mm ×2.1 mm, 3 μm,Dikma公司);色譜柱2: Spursil C18-EP(100 mm×2.1 mm, 3 μm,Dikma公司); 捕獲柱(T柱):Oasis HLB (20 mm×2.1 mm, 25 μm, Waters公司)。柱溫:30 ℃。進(jìn)樣體積:10 μL。洗針液:乙腈-水(90∶10, V/V)。閥切換和流動相梯度條件見表1和表2。endprint
2.3.2 質(zhì)譜條件 氣簾氣流量: 172.38 Pa; 碰撞氣流量: 34.48 Pa; 離子源電壓: 3500 V; 接口溫度: 550 ℃; 霧化器流量: 344.75 Pa; 輔助加熱氣流量: 344.75 Pa;檢測器電壓: 2000 V; 電離模式: ESI+。化合物的母離子、子離子及離子檢測參數(shù)見表3。
在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下,空白奶粉樣品添加20種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(各分析物濃度均為20 ng/mL)的總離子流圖見圖1。
3 結(jié)果與討論
3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化
基質(zhì)固相分散(Matrix solid phase dispersion, MSPD)萃取技術(shù)使用C8和C18鍵合硅膠,提取親脂性化合物,簡便快速、提取效率高,常用于動物源性食品中獸藥多殘留檢測的樣品前處理中【17】。本方法針對極性強(qiáng)的AGs提出的混合MSPD技術(shù),利用氰基(CN)、C18鍵合硅膠與EDTA二鈉共同組成提取材料,結(jié)果表明, 對極性差異大的7類抗生素均有較高的提取效率,能較好的去除樣品基質(zhì)。
實驗考察了平均粒度45 μm的氰基(CN)、硅膠(Silica)、強(qiáng)陽離子(SCX)、C18填料和EDTA二鈉等提取材料,用奶粉和牛奶的加標(biāo)回收率考察提取效率。結(jié)果表明,如混合提取材料中不含EDTA二鈉,強(qiáng)力霉素和土霉素?zé)o回收率,這可能與四環(huán)素類藥物結(jié)構(gòu)中兩個酮基易與金屬離子形成螯合物造成損失有關(guān)。采用SCX或Silica與C18和EDTA二鈉組成提取材料時,采用水或乙腈洗脫液,7種AGs均不能被有效洗脫,采用氨化乙腈為洗脫液,可以部分洗脫AGs,僅在使用CN時,奶粉和牛奶中的回收率分別為81.3%(鏈霉素)~98.3%(環(huán)丙沙星),78.4%(鏈霉素)~97.0%(氯霉素)。這可能與CN填料為硅膠鍵合氰丙基,同時具備正相和反相保留機(jī)制,非極性溶劑溶解待測物并用極性溶劑洗脫時,表現(xiàn)為正相作用,對極性化合物有較好的保留有關(guān),而Silica和SCX對極性化合物保留較強(qiáng)。
3.2 HILIC固定相的選擇
已知的HILIC固定相有未衍生化的硅膠【18,19】或雜化顆?!?0,21】、酰胺【22,23】、氨基【24】、二醇【25】、兩性離子【26】等。適合AGs分離的固定相有3種:雜化顆粒、未衍生化的硅膠和兩性離子。雜化顆粒與未衍生化的硅膠兩種固定相保留機(jī)理相似,均使用有機(jī)相與水相的混合流動相,促使硅醇基團(tuán)產(chǎn)生,形成帶負(fù)電的酸性表面,從而有利于陽離子物質(zhì)的保留,常用來分析堿性極性物質(zhì)【27】;但硅膠基質(zhì)顆粒(未衍生化)在中高pH下容易溶解,因此適用范圍小于雜化顆粒。兩性離子固定相包含摩爾比為1∶1的強(qiáng)堿(季銨)和強(qiáng)酸(磺酸)基團(tuán),有利用兩性離子固定相對AGs進(jìn)行分離的報道【28,29】。
本實驗比較了未衍生化硅膠的Atlantis HILIC-silica(100 mm×2.1 mm, 3 μm, Waters公司)、兩性離子的ZIC-HILIC(50 mm×2.1 mm, 3.5μm, Merck公司)和雜化顆粒硅膠的Inspire HILIC(100 mm×2.1 mm, 3 μm, Dikma公司)的色譜柱,使用Inspire HILIC時, 7種AGs分離良好。ZIC-HILIC柱分析效果不佳的原因,可能與它同時提供帶正電和負(fù)電荷的官能團(tuán),使最終總凈電荷接近為零,流動相pH變化對分離影響小有關(guān),在分析帶正電的堿性極性化合物時,ZIC-HILIC柱的分離效果不一定優(yōu)于雜化顆粒。
3.3 三段檢測模式的選擇
研究發(fā)現(xiàn),HILIC與 RP的分離模式接近于正交【30】。但在實際分離中,所選的20種抗生素中,5種完全不被HILIC柱保留,7種AGs和大環(huán)內(nèi)脂類替米考星在C18柱上幾乎不保留,而7種物質(zhì)在兩種色譜柱上均有所保留,而流動相組成和AXP泵流速的變化對這7種物質(zhì)的影響也不相同。
實驗中將20種抗生素分為3組(見表4),第一組為5種在HILIC柱上完全不保留的物質(zhì),第二組為7種在HILIC和C18上均有保留的物質(zhì),第三組為C18柱不保留的7種AGs和大環(huán)內(nèi)脂類的替米考星,分階段檢測。如圖2,狀態(tài)Ⅰ,20種待測物進(jìn)入HILIC柱后,第二和第三組物質(zhì)在HILIC上保留;第一組物質(zhì)在死時間通過HILIC柱,AXP泵在0.70~1.30 min,引入0.5 mL/min的水用于稀釋高比例有機(jī)流動相,第一組物質(zhì)被T柱捕獲。狀態(tài)Ⅱ(1.30~6.50 min),左泵流動相反向?qū)柱中待測物洗脫至C18柱并分離后,到達(dá)檢測器。6.50~11.00 min(狀態(tài)Ⅰ)和11.01~14.00 min(狀態(tài)Ⅱ),同樣方法分離和檢測第二組物質(zhì),AXP泵流速為0.20 mL/min。14.00~20.00 min(狀態(tài)Ⅲ),右泵流動相將HILIC上強(qiáng)保留的第三組物質(zhì)洗脫至質(zhì)譜檢測器分析。
3.4 流動相條件優(yōu)化
3.4.1 左泵流動相
對第一組物質(zhì),使用乙腈和0.2%甲酸水溶液流動相,分離良好且質(zhì)譜響應(yīng)度高。第二組中四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素和土霉素,特有的兩個酮基結(jié)構(gòu)使之易與硅羥基作用,分離時出現(xiàn)明顯拖尾峰。研究表明,流動相中加入草酸【31】、琥珀酸【32】、檸檬酸【33】 等螯合劑可改善分離。本實驗中,流動相中加入草酸,結(jié)果表明,強(qiáng)力霉素和土霉素峰形得到極大改善;但草酸濃度太高會對其它物質(zhì)峰形和分離帶來很大影響。實驗采用了11.01~11.20 min, 0.2%甲酸-乙腈(5∶95, V/V)反向沖洗T柱,防止峰展寬;11.21~12.70 min,乙腈-20 mmol/L草酸(5∶95, V/V)保證了足夠的螯合劑,防止了強(qiáng)力霉素和土霉素的拖尾;12.71~14.00 min,0.2%甲酸-乙腈梯度變化,使第二組7種物質(zhì)峰形良好。endprint
3.4.2 右泵流動相
實驗表明,在將第一組物質(zhì)(0~1.30 min)和第二組物質(zhì)(6.50~11.00 min)洗脫至T柱階段,需分別使用高比例的有機(jī)相(95%和 90%),才能將兩組物質(zhì)有效洗脫至T柱,并確保第三組物質(zhì)不被沖出HILIC柱。這可能與兩組物質(zhì)極性較弱以及HILIC柱保留強(qiáng)極性物質(zhì)時,乙腈是弱洗脫溶劑有關(guān)。
3.4.3 AXP泵條件 AXP泵開啟時間及流速在一定程度上影響分離,系統(tǒng)死時間為0.70 min,AXP泵開啟過早或流速過大,產(chǎn)生的反壓會通過三通影響到HILIC柱的分離,使第一組物質(zhì)無法順利通過三通進(jìn)入T柱。比較4種流速(0, 0.25, 0.50和0.75 mL/min)的實驗表明,AXP泵流速死時間(0.70min)后開啟,保持0.50 mL/min流速時,綜合效果最佳。
采用同樣方法優(yōu)化AXP泵在第二組物質(zhì)分離時的條件,結(jié)果表明,AXP泵開啟6.50~11.00 min,流速:0.20 mL/min,第二組物質(zhì)分離良好。
在優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件下,8種代表性的抗生素多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖3所示。
3.5 方法學(xué)評價
對空白奶粉分別添加1.0 mL待測物濃度分別為0.2, 0.5, 2.0, 5.0, 20和100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理后,在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下測定,對各待測物濃度和定量離子峰面積進(jìn)行線性回歸。根據(jù)定量離子信噪比(S/N)分別為3和10時對應(yīng)的樣品中待測物濃度,得到檢出限和定量限(表4)。
在奶粉和牛奶中添加0.5, 1.0, 1.5倍最大殘留限量(MRL)的各抗生素(以MRL值最小的頭孢族抗生素50 μg/kg為基準(zhǔn)),即25, 50和75 μg/kg3個水平,平行測定6份。
計算奶粉和牛奶中平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果:25 μg/kg水平,回收率分別為72.5%(強(qiáng)力霉素)~97.2%(環(huán)丙沙星)和70.1%(強(qiáng)力霉素)~96.8%(環(huán)丙沙星),RSD分別為4.2%(替米考星)~8.8%(四環(huán)素)和3.7%(替米考星)~9.9%(四環(huán)素);50 μg/kg水平,回收率分別為77.0%(強(qiáng)力霉素)~102.1%(環(huán)丙沙星)和76.4%(四環(huán)素)~98.9%(環(huán)丙沙星),RSD分別為2.8%(卡那霉素)~6.9%(四環(huán)素)和4.0%(氯霉素)~7.8%(四環(huán)素); 75 μg/kg水平,回收率分別為82.4%(四環(huán)素)~104.7%(恩諾沙星)和79.0%(四環(huán)素)~105.8%(環(huán)丙沙星),RSD分別為3.6%
3.6 實際樣品的分析
對市售的5份奶粉、5份牛奶、5份原奶進(jìn)行檢測,在1份原奶中檢出氨芐青霉素,含量37.6 μg/kg,低于歐盟規(guī)定的MRL(50 μg/kg),陽性樣品的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖見圖4。
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