脊椎動物NF－κB1／2基因亞家族分子進化和功能分歧分析

甘 翔，王繼文，劉賀賀，李 亮，孫文強，王郁石，張 濤，陳 達，黃惠蘭

（四川農(nóng)業(yè)大學，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130）

NF－κB1與 NF－κB2共同隸屬于 NF－κB基因家族，分別編碼p50與p52的前體蛋白p105和p100。p105與p100是核轉(zhuǎn)錄因子，在二聚體化后能與免疫球蛋白輕鏈（Immunoglobulin light chain，MYLC）基因增強子cDNA序列（5′－GGGACTTTCC－3′）特異性結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，從而啟動和調(diào)節(jié)眾多免疫和炎癥反應(yīng)［1－2］。NF－κB1／2擁有Rel homology domain（RHD）、IPT domain（IPT）、ankyrin repeats（ANK）和 Death domain（DD）4個結(jié)構(gòu)域［3］。RHD由大約200個氨基酸殘基組成，擁有核定位信號序列，是與DNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，也是與抑制劑作用的重要區(qū)域；ANK可作為NF－κB家族的抑制劑，通過與RHD結(jié)合來使其滯留在細胞質(zhì)并保持靜息態(tài)，ANK蛋白的磷酸化、泛素化、降解釋放RHD的過程也就是NF－κB蛋白的激活過程［4］；而IPT和DD則與NF－κB蛋白二聚體的穩(wěn)定性與活性有著密切的聯(lián)系［5］。

研究表明，NF－κB基因的原始結(jié)構(gòu)起源于后生動物以前，在進化過程中分化為 NF－κB1和 NF－κB2［6］。利用模式脊椎動物的 NF－κB1／2氨基酸序列構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)它們分成兩支，且完全沒有交叉的跡象，說明兩者在進化上出現(xiàn)了明顯的分歧，暗示它們在結(jié)構(gòu)上存在一定差異。另外，在脊椎動物中，NF－κB1／2蛋白的功能也表現(xiàn)出了一定的差異。有文獻報道［7－8］，不同的 NF－κB1／2蛋白二聚體對于相應(yīng)的κB位點會顯示出不同的親和力與激活能力。不僅如此，兩者的ANK抑制結(jié)構(gòu)對于不同的二聚體也可能顯示出不同的抑制強度。還有報告［7－9］稱，許多刺激信號如 TNF－α、IL－1、LPS等對 NF－κB1和NF－κB2氨基酸序列的刺激能力與刺激途徑也有所差異。在小鼠中，敲除NF－κB1會導致B細胞的多種功能缺陷，而敲除NF－κB2則會引起淋巴結(jié)構(gòu)改變，影響上皮發(fā)育。另外，兩者的敲除反應(yīng)都會一定程度上導致胃黏膜增生，但NF－κB2對胃黏膜的影響程度要大于NF－κB1［4］。當前的研究已經(jīng)基本定義了NF－κB1／2基因的起源，也明確了 NF－κB家族在脊椎動物中的功能差異，但對造成這些差異的原因還沒有明確的定義。不過可以推斷，NF－κB1／2的 RHD、IPT、ANK 與 DD 在 NF－κB1與 NF－κB2基因亞家族分子進化特征的形成和分子功能分歧的產(chǎn)生方面扮演了重要的角色。

本研究選擇模式脊椎動物的NF－κB1／2基因與蛋白質(zhì)序列，針對NF－κB1／2的RHD、IPT、ANK和DD 4個結(jié)構(gòu)域進行生物信息學分析，旨在揭示引起NF－κB1／2功能分化的部分原因，并闡述 NF－κB1／2在脊椎動物中進化、變遷的基本趨勢。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)的收集與下載

序列比對與核苷酸替代率分析所用的NF－κB1／2氨基酸、核苷酸序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）。序列比對使用了包括人類（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、原雞（gallus gallus）、非洲爪蟾（Xenopus（Silurana）tropicalis）、美國短吻鱷 （Alligator mississippiensis）、二 色熱帶魚（Stegastes partitus）7種具有代表性的模式動物的NF－κB1／2的氨基酸序列。而核苷酸替代率分析則選用了魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和海陸哺乳類共計20余種脊椎動物的 NF－κB1／2核苷酸序列［10］。

1.2 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

使用ClustalW將下載序列對齊，使用DAMBE等軟件進行格式處理，得到的結(jié)果輸入MEGA 6.0軟件，使用鄰接法（Neighbor－Joining，NJ），經(jīng)過自展法（Bootstrap）1000次重復驗證，以保證樹拓撲結(jié)構(gòu)的可靠性，分別構(gòu)建NF－κB1／2氨基酸全序列及其各個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹［11－12］。

1.3 NF－κB1／2蛋白的結(jié)構(gòu)域預測

使用Pfam 在線數(shù)據(jù)庫（http:／／pfam.sanger.ac.uk／）對 NF－κB1／2蛋白進行結(jié)構(gòu)預測。

1.4 進化速率計算檢驗與分析

使用DAMBE等軟件處理序列文本格式，使用MEGA6.0，ClustalW 進行向?qū)涞臉?gòu)建［13］。將處理結(jié)果文件輸入paml軟件包，codeml工具［14－15］，分別選取模型A:所有的分支有一個ω，模型B:所有的分支有相同的ω且等于1，模型H:每一支都有自己的ω，選擇最優(yōu)模型從而得出各個結(jié)構(gòu)域的整體ω值。每個位點ω的計算也使用codeml工具，NS－site參數(shù)為0、1、2、7、8，在生成結(jié)果中優(yōu)先選用BEB模型，從而得到 NF－κB1／2的 RHD、ANK 和DD 中各個位點的 ω值［16－17］。

2 結(jié) 果

2.1 基于 NF－κB1／2與結(jié)構(gòu)域 RHD、IPT、ANK和DD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

如圖1a所示，進化樹中 NF－κB1／2分為兩大支，進化趨勢與物種進化趨勢一致。由魚類至兩棲類之后，系統(tǒng)發(fā)育樹再分為兩支，其中一支為爬行類與鳥類，另一支為哺乳類。樹中NF－κB1／2兩個成員在整個脊椎動物進化歷程中并沒有出現(xiàn)任何的交織，這表明NF－κB基因家族早在脊椎動物與非脊椎動物分歧時，就已經(jīng)分化成為 NF－κB1和 NF－κB2，然后開始獨立進化。

圖1 NF－κB1／2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹與保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Phylogenetic tree of NF－κB1／2and their conserved domains

脊椎動物 NF－κB1／2兩個成員都包含 RHD、ANK、IPT和DD 4個結(jié)構(gòu)域（圖1b），由它們的氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）與基于全序列構(gòu)建的發(fā)育樹基本一致。

2.2 基于 NF－κB1／2 結(jié)構(gòu)域（RND、IPT、ANK 和DD）的序列分析

圖3中，NF－κB1／2之間在RHD上存在較多保守區(qū)域，但在序列的60～66、108～117、157～164位氨基酸區(qū)段（圖中方框標出）也發(fā)現(xiàn)了它們各自的特征序列。在IPT區(qū)域上，兩個基因在相應(yīng)物種間都表現(xiàn)出較高的同源性。而在ANK區(qū)域上，無論在直系同源還是旁系同源結(jié)構(gòu)中，該區(qū)域都出現(xiàn)了較大差異。另外，相對于其他3個結(jié)構(gòu)域，DD區(qū)域的旁系同源結(jié)構(gòu)之間存在很大的差異，而直系同源結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出較高的同源性。

2.3 NF－κB1／2各保守結(jié)構(gòu)域選擇壓力比較

Codeml中各模型比對結(jié)果顯示，NF－κB1的ANK、RHD和 DD，NF－κB2的 ANK 與 RHD都更適用于H模型，檢測結(jié)果為極顯著；而NF－κB1／2的IPT，NF－κB2的DD更適用于A模型，檢測結(jié)果也極顯著。

分別比較了 NF－κB1／2的 RHD、ANK、IPT與DD區(qū)域的選擇壓力，結(jié)果（表1）表明，在魚類及兩棲動物上，NF－κB1／2的 RHD，NF－κB1的 ANK 顯示出較高的ω值；在爬行動物與鳥類上，NF－κB1／2的ANK與NF－κB1的DDω值較大；而在哺乳動物中，大多數(shù)結(jié)構(gòu)域的ω值均低于0.1。

而對NF－κB1／2氨基酸各位點選擇壓力（圖4）分析表明，RHD、IPT、ANK與DD序列的ω值均小于1.2，且在所分析脊椎動物中，4個結(jié)構(gòu)域均沒有出現(xiàn)處于顯著水平的正選擇位點。NF－κB1／2的RHD區(qū)域大多數(shù)位點ω值在0.1以下。相對于RHD、IPT與DD區(qū)域，ANK區(qū)域則擁有較高的進化速率；NF－κB1的IPT絕大多數(shù)位點ω值較低，而NF－κB2的IPT所有位點的ω值均在0.01以下；NF－κB1／2的DDω曲線存在較大差異，NF－κB1的DD各個位點的ω值顯示出較大的波動。

3 討 論

NF－κB1／2屬于 NF－κB基因家族中的亞家族，作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導機體多種正向調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在動物機體免疫反應(yīng)、骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用［1］。研究表明，NF－κB基因的原始結(jié)構(gòu)起源于后生動物以前，在進化過程中分化為NF－κB 1和NF－κB2［6］。通過構(gòu)建NF－κB1／2 的進化樹，發(fā)現(xiàn)NF－κB基因家族早在脊椎動物與非脊椎動物發(fā)生分歧前，就已經(jīng)分化成為 NF－κB1和 NF－κB2，然后開始獨立進化，這與其他報道［18］得出的結(jié)論一致。

圖2 NF－κB1／24個結(jié)構(gòu)域RHD、IPT、ANK與DD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic trees of RHD，IPT，ANK and DD of NF－κB1／2based on their amino acid sequences

表1 NF－κB1／2基因各結(jié)構(gòu)域在脊椎動物各個群類中的ω均值Table 1 The average value ofωof domains of NF－κB1／2genes in different vertebrate groups

圖3 NF－κB1／2的RHD、IPT、ANK和DD保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域比對Fig.3 Alignment of RHD，IPT，ANK and DD conserved domains of NF－κB1／2

圖4 NF－κB1／2RHD、IPT、ANK與DD結(jié)構(gòu)域各位點選擇壓力Fig.4 The selection pressure of RHD，IPT，ANK and DD conserved domains of NF－κB1／2

RHD、IPT、ANK 與 DD 是 NF－κB1／2亞家族成員重要的典型結(jié)構(gòu)域，早在兩側(cè)對稱動物時期4個結(jié)構(gòu)域就已經(jīng)形成［8］，且這樣的序列結(jié)構(gòu)一直持續(xù)到了哺乳動物［8，18］?？梢酝茢?，RHD、IPT、ANK與DD在NF－κB1與NF－κB2基因亞家族分子進化特征的形成和分子功能分歧的產(chǎn)生方面扮演了重要的角色。本研究構(gòu)建了各個結(jié)構(gòu)域氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)由它們的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與基于全序列構(gòu)建的發(fā)育樹形態(tài)基本相同，說明NF－κB1和 NF－κB2分歧后，NF－κB1和 NF－κB2各個結(jié)構(gòu)域的進化趨勢與其整體序列基本一致。

選擇壓力分析能使人們對NF－κB1／2在進化中所受到的環(huán)境阻力與其序列位點的變異情況有更深入的認識。因此，為了更進一步探索NF－κB1／2在脊椎動物階段的進化歷程，筆者又分別分析了NF－κB1／2各個結(jié)構(gòu)域在不同動物類群中（魚類、鳥類、哺乳動物）的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)不同種類動物NF－κB1／2保守結(jié)構(gòu)域 ω值存在差異，說明 NF－κB1／2各個結(jié)構(gòu)域在不同的進化階段存在著明顯不同的進化歷程。而在對NF－κB1／2各個結(jié)構(gòu)域序列位點的分析中，發(fā)現(xiàn)NF－κB1／2整體序列相對保守，不存在顯著的正選擇位點。不過NF－κB2的DD所承受的選擇壓力卻明顯大于NF－κB1的DD，這很可能是由于NF－κB2的DD所含有的水解抑制區(qū)（Processing inhibitory domain，PID）在生理過程中的重要作用所導致［19］。

另外，對脊椎動物 NF－κB1／2 的 RHD、IPT、ANK和DD與直系、旁系同源結(jié)構(gòu)的同源性分析顯示，NF－κB1／2的序列發(fā)生了各自獨立的進化，且這樣的獨立進化在RHD中表現(xiàn)的尤為顯著，暗示NF－κB1／2在功能上的分工越來越明確。而IPT表現(xiàn)的高保守性與它在生理過程中的重要功能相吻合［5，20］。ANK相對于其他3個結(jié)構(gòu)域在脊椎動物的NF－κB1／2間擁有顯著的差異，推測它可能是導致NF－κB1／2在脊椎動物階段序列、功能差異形成的重要因素。而DD僅在NF－κB1／2之間存在較大的差異，且這樣的差異在魚類中就已經(jīng)表現(xiàn)出來了，這不僅說明了它在脊椎動物階段中的保守性，也暗示了NF－κB1／2的DD分歧的年代較為久遠，甚至可能與NF－κB1／2基因的分歧有一定關(guān)聯(lián)，但是因為NF－κB1／2的分化早于脊椎動物而晚于兩側(cè)對稱動物，期間相關(guān)的動物序列素材較少，因此人們無法進行確切的論證。

綜上，在脊椎動物的各個類群中，NF－κB1／2承受著不同的選擇壓力，它們的4個結(jié)構(gòu)域也表現(xiàn)出了不同的變異程度與特點。NF－κB1／2在脊椎動物中的進化與功能分歧主要由ANK的序列變異造成，而NF－κB1／2在脊椎動物之前的分歧很可能與DD有著密切的聯(lián)系。

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